Al het onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor de verzorging van dieren.
1. Overwegingen en voorbereidingen voor het experiment
- Gebruik een geschikte pulsduplicator (PD) voor de simulatie van het hartminuutvolume via de AV. De PD moet in staat zijn om biologische materialen te bevatten en te kunnen worden gereinigd.
- Gebruik PD-instellingen die geschikt zijn voor het testen van de AV: 70 ml verplaatsingsvolume en 70 slagen per minuut (5 l/min cardiale output), 35% van de hartcyclus in systole, 100 mmHg gemiddelde transvalvulaire drukgradiënt, 120 maximale drukgradiënt en 80 minimale drukgradiënt.
- Gebruik kamertemperatuur (RT) normale zoutoplossing (0,9% NaCl) als vloeibaar medium.
- Zoek of creëer (met behulp van 3D-printen of een vergelijkbare methode) geschikte armaturen voor het monteren van de varkens-AV voor testen op de PD.
- Gebruik armaturen die zijn gemodelleerd naar de armaturen die bij de pulsduplicator zijn geleverd met de volgende specificaties: zorg ervoor dat de binnendiameter van de armatuur vergelijkbaar is met de diameter van de AV die wordt bestudeerd, de lengte van het bevestigingselement minimaal 2 cm is en de bruikbare breedte van het hulpstuk minimaal 4 cm is (Figuur 1).
- Gebruik rubberen O-ringen als pakkingen aan de uiteinden van de armaturen.
- Verkrijg een hartmonster na cardiectomie (Figuur 2A).
- Gebruik hartmonsters van varkens uit het slachthuis of afvalweefsel van dieren die verder gezond zijn en geen deel hebben uitgemaakt van experimentele protocollen die hun hart zullen aantasten.
- Verkrijg een monster na cardiectomie of voer postmortale cardiectomie uit, inclusief doorsnede van de vena cava superior, vena cava inferior, hoofdlongslagader (PA), alle longaders en aorta aan het distale aspect van de aortaboog.
OPMERKING: Voor dit experiment moeten verse monsters worden gebruikt, minder dan 6 uur na het mortem of bewaard in steriele zoutoplossing met een 1% antibiotische oplossing (penicilline en streptomycine) in een koelkast van 4 °C gedurende maximaal 7 dagen. Weefsels gefixeerd in formaline of glutaaraldehyde zullen veranderde hydrodynamische resultaten opleveren als gevolg van verhoogde stijfheid.

Afbeelding 1: Op maat gemaakte 3D-geprinte armaturen voor het monteren van de varkensaortakleppen op de pulsduplicator. Zoals vermeld in het protocol, moet de bevestigingslengte minimaal 2 cm zijn en de bruikbare bevestigingsbreedte minimaal 4 cm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
2. Resectie van rechtszijdige structuren
- Ontleed de PA van de aorta met een Metzenbaum-schaar totdat ventrikelweefsel zichtbaar is (Figuur 2B).
- Ontleed en ligate met zijden banden beide kransslagaders aan hun oorsprong uit de aorta-sinussen, en zorg ervoor dat de sinussen niet vernauwen.
- Doorsnijd de kransslagaders distaal van de zijden banden.
- Snijd de rechterventrikel (RV) tussen de aorta en de PA aan de basis van de pulmonaalklep in met behulp van een Metzenbaum-schaar (Figuur 2C).
- Begin naar voren en vervolg de incisie in de omtrek langs het interventriculaire septum om de RV-vrije wand te verwijderen (Figuur 2D, E).
- Ga door met de incisie naar achteren door de annulus van de tricuspidalisklep langs het interatriale septum om al het juiste atriale weefsel te verwijderen (Figuur 2F).

Figuur 2: Cardiectomiemonster en resectie van rechtszijdige structuren. (A) Cardiectomiemonster. (B) Hoofdlongslagader ontleed van de aorta totdat ventrikelweefsel zichtbaar is. (C) Insnijden van de rechterhartkamer (RV) aan de basis van de longklep. (D) Voortzetting van de incisie langs het interventriculaire septum anterieur. (E) Het verwijderen van de RV-vrije wand door de incisie in de omtrek langs het interventriculaire septum voort te zetten. (F) Specimen waarvan de rechtszijdige structuren zijn verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Voorbereiding van het linkerventrikel-uitstroomkanaal (LVOT) voor canulatie met de PD-armatuur
- Snijd het linker atrium (LA) door het ostium van de rechter longader evenwijdig aan de aorta met behulp van een Metzenbaum-schaar (Figuur 3A).
OPMERKING: Hoewel er beperkte variabiliteit bestaat, eindigt de anatomie van de longader van varkens over het algemeen in twee longaderostia die de LA8 binnenkomen.
- Vervolg de incisie in de richting van de anterolaterale commissuur van de mitralisklep (MV), waarbij u ten minste een manchet van 3 mm atriumweefsel aan de aortazijde overlaat.
- Snijd overtollig LA-weefsel af, waarbij u de manchet van 3 mm atriumweefsel op de aorta en de MV-annulus in de omtrek handhaaft (Figuur 3B).
- Verleng de incisie naar de linker hartkamer (LV) door de anterolaterale commissuur van de MV en zorg ervoor dat de anterolaterale papillaire spier behouden blijft (Figuur 3C).
- Verdeel chordae tendineae van de anterolaterale papillaire spier naar het achterste MV-blad, met behoud van de aanhechtingen aan het voorste MV-blad.
- Ga door met de incisie naar de top van het hart.
- Snijd overtollig LV-weefsel onder de papillaire spieren bij, waarbij beide papillaire spieren behouden blijven (Figuur 3D).

Figuur 3: Voorbereiding van het linkerventrikel-uitstroomkanaal voor canulatie met de pulsduplicatorinrichting. (A) Insnijding van het linker atrium (LA) door het ostium van de rechter longader. (B) Overtollig LA-weefsel bijgesneden, met behoud van ten minste een manchet van 3 mm atriumweefsel op de aorta en met behoud van de mitralisklepannulus in de omtrek. (C) Verlenging van de incisie in de linker hartkamer (LV) door de anterolaterale commissuur van de mitralisklep. (D) Het verwijderen van overtollig LV-weefsel onder de papillaire spieren. Een schaar is zichtbaar in de rechterbovenhoek van de afbeelding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Voorbereiding van de aorta voor canulatie met de PD-armatuur
- Snijd overtollig lymfatisch, bind- of longslagaderweefsel van de aorta af (Figuur 4A).
- Snijd het superieure aspect van de aortaboog van de dalende aorta naar de linker subclavia-slagader in met behulp van een Metzenbaum-schaar (Figuur 4B).
- Vervolg de incisie aan de bovenkant van de aortaboog van de linker subclavia-slagader naar de brachiocephalische stam (Figuur 4C, D).
OPMERKING: Vertakkingen van de aortaboog van het varken van distaal naar proximaal omvatten de linker subclavia-slagader en de brachiocephalische stam, die aanleiding geeft tot de rechter subclavia-slagader, de rechter halsslagader en de linker halsslagader9.

Figuur 4: Voorbereiding van de aorta voor canulatie met de pulsduplicatorfix. (A) Aortaboog met overtollig weefsel verwijderd. Let op de twee boogvaten in de aortaboog van het varken, de brachiocephalische stam en de linker subclavia-slagader. (B) Het starten van de incisie langs het bovenste aspect van de aortaboog van de dalende aorta naar de linker subclavia-slagader. (C) Voortzetting van de incisie langs het bovenste aspect van de aortaboog van de linker subclavia-slagader naar de brachiocephalische stam. (D) Voltooide incisie in de aortaboog. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Canulatie van de LVOT met de PD-armatuur
- Test de positionering van het armatuur in de LVOT en snijd overtollig LV-weefsel weg.
- Plaats het armatuur in de LVOT onder het voorste blad van de MV.
- Wikkel de LV-vrije muur om het armatuur.
- Knip overtollig LV-weefsel af om een strakke wikkel rond het armatuur te behouden.
- Verwijder de helft van de dikte van de LV-vrije wand, beginnend bij het interventriculaire septum, met behoud van ten minste 1 cm epicardium aan de vrije rand om de integriteit van de hechtdraad te behouden (Figuur 5A).
- Knip 1 cm weefsel af van de bovenste hoek van de LV-vrije muurfolie (Figuur 5A).
- Plaats het armatuur in de LVOT met het bevestigingsgat van de steunstang 1 cm achter de LV-incisie (Figuur 5B).
- Zorg ervoor dat u het armatuur niet te ver in de LVOT steekt, zodat de AV-annulus wordt verwijd.
- Bevestig het voorste blad van de MV aan het armatuur met behulp van een of twee 6-inch kabelbinders die tussen de chordae tendineae van het blad zijn geplaatst (Figuur 5C).
- Hecht de LV-vrije muur rond het armatuur (Figuur 5D).
- Begin met het hechten van de manchet van LA-weefsel op de aorta aan de MV-annulus met behulp van een eenvoudige lopende hechting met een taps toelopende naald.
- Ga door met de rijgsteek op de LV, zonder het LV-weefsel te scheuren.

Figuur 5: Canulatie van het linkerventrikeluitstroomkanaal met de pulsduplicatorinrichting. (A) De helft van de dikte van de LV-vrije wand wordt verwijderd met 1 cm epicardium aan de vrije rand. De stippellijn geeft het gebied van 1 cm aan dat moet worden verwijderd uit de bovenste hoek van de LV-vrije muurfolie. (B) Bevestigingsgat voor steunstang 1 cm achter de LV-vrije wandincisie. (C) Kabelbinder waarmee de voorste blaad van de MV aan de proximale bevestiging wordt bevestigd. (D) LV-vrije muur gehecht rond het armatuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
6. Canulatie van de aorta met PD-armatuur en laatste voorbereiding op PD-testen
- Meet de diameter van de AV met behulp van Hegar-dilatatoren om te helpen bij de interpretatie van de resultaten van PD-testen.
- Identificeer de neutrale positie van de aorta door het monster van de tafel te tillen door de aorta vast te pakken (Figuur 6A).
- Steek de PD-armatuur in de aorta en zorg ervoor dat de bevestigingsgaten van de stang in de neutrale positie van de aorta zijn uitgelijnd.
- Controleer de lengte van het preparaat door de steunstangen erin te steken.
- Bevestig het PD-armatuur aan de aorta met behulp van een of twee 6-inch kabelbinders (Figuur 6B).
- Zet de LVOT vast rond het PD-armatuur met behulp van een of twee 8-inch kabelbinders.
- Zet de steunstangen vast met de schroeven die bij de PD-set zijn geleverd.
- Plaats het monster in PD en start de test (Figuur 6C, Video 1 en Video 2).
- Hecht eventuele lekken indien nodig.

Figuur 6: Canulatie van de aorta en testen in de pulsduplicator. (A) Het monster bij de aorta van de tafel tillen om de neutrale positie van de aorta te bepalen. (B) Distale bevestiging vastgezet in de aorta met kabelbinders. (C) Sample gemonteerd in de pulsduplicator voor hydrodynamische tests. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
7. Voer een experimentele procedure uit
OPMERKING: Voer experimentele procedures uit, zoals de Ozaki-procedure zoals eerder beschreven 5,6,7, en herhaal de PD-test.
- Als het weefsel tijdens de procedure is uitgedroogd, trek dan de kabelbinders aan en versterk de hechtdraad indien nodig.
8. Langdurige opslag van het monster (indien gewenst)
- Plaats het monster in formaline 10% gedurende 168 uur (1 week)10,11.
- Was het monster na weefselfixatie met gedeïoniseerd water en plaats het in ethanol 70% voor langdurige opslag.