Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Meervoudige beeldvorming met levende cellen voor geneesmiddelresponsen in van patiënten afgeleide organoïdemodellen van kanker

2.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66072

⸱

5 januari 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Cancer Biology Graduate Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3The Institute of Cancer Research: and the Royal Marsden NHS Foundation Trust, 4Department of Radiation Oncology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Division of Molecular Medicine, Departments of Internal Medicine and Obstetrics and Gynecology, University of New Mexico Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center, 6Agilent Technologies, 7Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Tumororganoïden van patiënten zijn een geavanceerd modelsysteem voor fundamenteel en translationeel onderzoek. Dit methodeartikel beschrijft het gebruik van gemultiplexte fluorescerende beeldvorming van levende cellen voor gelijktijdige kinetische beoordeling van verschillende organoïde fenotypes.

Samenvatting

Patiënt-afgeleide organoïde (PDO) modellen van kanker zijn een multifunctioneel onderzoekssysteem dat menselijke ziekten beter recapituleert in vergelijking met kankercellijnen. PDO-modellen kunnen worden gegenereerd door tumorcellen van patiënten te kweken in extracellulaire basale membraanextracten (BME) en deze te plateren als driedimensionale koepels. In de handel verkrijgbare reagentia die zijn geoptimaliseerd voor fenotypische tests in monolaagculturen zijn echter vaak niet compatibel met BME. Hierin beschrijven we een methode om PDO-modellen in kaart te brengen en de effecten van geneesmiddelen te beoordelen met behulp van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem met levende cellen. Daarnaast passen we fluorescerende kleurstoffen toe die compatibel zijn met kinetische metingen om de celgezondheid en apoptose tegelijkertijd te kwantificeren. Het vastleggen van afbeeldingen kan worden aangepast om met regelmatige tussenpozen gedurende meerdere dagen plaats te vinden. Gebruikers kunnen de effecten van geneesmiddelen analyseren in individuele Z-vlakbeelden of een Z-projectie van seriële beelden van meerdere brandpuntsvlakken. Met behulp van maskering worden specifieke parameters berekend die van belang zijn, zoals PDO-nummer, oppervlakte en fluorescentie-intensiteit. We leveren proof-of-concept-gegevens die het effect van cytotoxische middelen op celgezondheid, apoptose en levensvatbaarheid aantonen. Dit geautomatiseerde kinetische beeldvormingsplatform kan worden uitgebreid naar andere fenotypische uitlezingen om inzicht te krijgen in diverse therapeutische effecten in PDO-modellen van kanker.

Inleiding

Patiënt-afgeleide tumororganoïden (BOB's) zijn snel in opkomst als een robuust modelsysteem om de ontwikkeling van kanker en therapeutische reacties te bestuderen. BOB's zijn driedimensionale (3D) celkweeksystemen die het complexe genomische profiel en de architectuur van de primaire tumor samenvatten 1,2. In tegenstelling tot traditionele tweedimensionale (2D) culturen van onsterfelijke kankercellijnen, vangen BOB's intratumorale heterogeniteitop en behouden deze 3,4, waardoor ze een waardevol hulpmiddel zijn voor zowel mechanistisch als translationeel onderzoek. Hoewel BOB's een steeds populairder modelsysteem worden, zijn in de handel verkrijgbare reagentia en analysemethoden voor cellulaire effecten die compatibel zijn met BOB-culturen beperkt.

Het gebrek aan robuuste methoden om subtiele veranderingen in de respons op de behandeling te analyseren, belemmert de klinische vertaling. Het gouden standaard celgezondheidsreagens in 3D-culturen, CellTiter-Glo 3D, maakt gebruik van ATP-niveaus als een bepalende factor voor de levensvatbaarheid van cellen 5,6. Hoewel dit reagens nuttig is voor eindpunttests, zijn er verschillende kanttekeningen, met name het onvermogen om monsters voor andere doeleinden te gebruiken na voltooiing van de test.

Beeldvorming van levende cellen is een geavanceerde vorm van kinetische microscopie die, in combinatie met fluorescerende reagentia, de capaciteit heeft om een verscheidenheid aan uitlezingen van de celgezondheid binnen PDO-modellen te kwantificeren, waaronder apoptose 7,8,9 en cytotoxiciteit10. Beeldvorming van levende cellen is inderdaad een integraal onderdeel geweest van de screening van verbindingen met hoge doorvoer in 2D-platforms11,12. Systemen zoals de Incucyte hebben de technologie betaalbaar gemaakt en dus toegankelijk gemaakt voor onderzoeksgroepen in verschillende omgevingen. De toepassing van deze systemen om 3D-culturen te analyseren staat echter nog in de kinderschoenen.

Hierin beschrijven we een methode om de respons op geneesmiddelen in PDO-modellen van kanker te beoordelen met behulp van multiplexed live-cell imaging (Figuur 1). Door analyse van helderveldbeelden kunnen veranderingen in de grootte en morfologie van de PDO's kinetisch worden gevolgd. Bovendien kunnen cellulaire processen in de loop van de tijd gelijktijdig worden gekwantificeerd met behulp van fluorescerende reagentia, zoals Annexine V Rode kleurstof voor apoptose en Cytotox Groene kleurstof voor cytotoxiciteit. De gepresenteerde methoden zijn geoptimaliseerd voor het Cytation 5 live-cell beeldvormingssysteem, maar dit protocol kan worden aangepast aan verschillende live-cell beeldvormingsplatforms.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Studies met menselijke tumormonsters werden beoordeeld en goedgekeurd door de University of Iowa Institutional Review Board (IRB), protocol #201809807, en uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen zoals vastgelegd in de Verklaring van Helsinki van 1964 en de latere wijzigingen ervan. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle proefpersonen die aan het onderzoek deelnamen. Inclusiecriteria zijn onder meer een diagnose van kanker en de beschikbaarheid van tumormonsters.

1. Intacte BOB's plateren in een plaat met 96 putjes

  1. Bereid reagentia voor.
    1. Verwarm de platen met 96 putjes een nacht voor bij 37 °C en ontdooi BME een nacht bij 4 °C.
    2. Bereid volledige organoïde kweekmedia voor die zijn geoptimaliseerd voor het kweken van het kankertype dat van belang is. Specifieke voedingsbodems die worden gebruikt voor de hierin getoonde experimenten zijn opgenomen in aanvullende tabel 1.
      OPMERKING: Mediacomponenten moeten mogelijk worden aangepast voor verschillende tumortypes. Het organoïde kweekmedium wordt bijvoorbeeld aangevuld met 100 nM estradiol voor gynaecologische tumoren13. Voorbereide media zijn gedurende 1 maand stabiel bij 4 °C. Voor langdurige opslag aliquot de media in tubes van 50 ml en bewaren bij -20 °C.
  2. Bereid twee afzonderlijke aliquots van organoïde kweekmedia bij 4 °C en 37 °C. Als er bijvoorbeeld 60 putjes worden geplateerd in een plaat met 96 putjes, gebruik dan 6 ml warme organoïde-kweekmedia en 150 μl ijskoude organoïde-kweekmedia.
  3. Bereid organoïde wasbuffer voor: Vul 1x PBS aan met 10 mM HEPES, 1x Glutamax, 5 mM EDTA en 10 μM Y-27632. Bewaren bij 4 °C
  4. Oogst BOB's gekweekt in een bord met 24 putjes. Voer alle stappen uit op ijs of bij 4 °C, tenzij anders vermeld.
    1. Zuig media uit elke put op met behulp van een vacuümleidingsysteem.
    2. Voeg 500 μL ijskoude organoïde wasbuffer toe en pipetteer voorzichtig 2-3x met een pipettor van 1000 μL. Incubeer de plaat 10 minuten op ijs.
    3. Breng de inhoud van elk putje over in een conische buis van 50 ml. Om er zeker van te zijn dat alle BOB's in suspensie zijn, spoelt u elk putje met een extra 300 μL organoïde wasbuffer en brengt u het over in de conische buis van 50 ml. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 350 x g bij 4 °C
    4. Zuig het supernatans uit de BME/organoïdekorrel op met behulp van een vacuümleidingsysteem, waarbij ~ 5 ml in de buis achterblijft. Voeg 20 ml organoïde wasbuffer toe en resuspendeer de pellet voorzichtig met een serologische pipet van 10 ml. Incubeer 10 minuten op ijs.
    5. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 350 x g bij 4 °C. Zuig het supernatans op met een vacuümleidingsysteem en zorg ervoor dat de BOB-pellet niet wordt verstoord.
  5. Plateren van BOB's in een plaat met 96 putjes: Voer alle stappen uit op ijs, tenzij anders vermeld.
    1. Resuspendeer de BOB-pellet in een geschikte hoeveelheid ijskoude organoïde kweekmedia om een BOB-suspensie te creëren. Breng de BOB-suspensie over in een ijskoude microcentrifugebuis van 1,5 ml.
      OPMERKING: Om de hoeveelheid organoïde-kweekmedia te berekenen, bepaalt u het aantal putjes dat moet worden geplateerd in een plaat met 96 putjes, rekening houdend met het feit dat BOB's worden geplateerd in een koepel van 5 μL in een verhouding van 1:1 van organoïde-kweekmedia en BME. Bij het plateren van een plaat met 96 putjes en het gebruik van alleen de binnenste 60 putjes, is de totale benodigde hoeveelheid PDO-suspensie 300 μL: 150 μL organoïde kweekmedia en 150 μL BME. Voor modellen die een optimale groei vertonen bij verschillende percentages BME, kan de verhouding BME: media in deze stap worden gewijzigd, hoewel het belangrijk is om de verhouding voor alle assays voor elk specifiek model te standaardiseren. Om rekening te houden met pipetteerfouten, voegt u 10% volume toe aan elk onderdeel.
    2. Tel het aantal BOB's.
      1. Breng 2,5 μl van de BOB-suspensie over in een ijskoude microcentrifugebuis van 1,5 ml en meng met 2,5 μl BME. Breng het mengsel van 5 μL over op een schoon glazen microscoopglaasje. Laat de dia niet onder het deksel schuiven. Het mengsel stolt tot een koepel.
      2. Visualiseer met een helderveldmicroscoop op 4x. Tel het aantal BOB's in het mengsel van 5 μL; het doel is om ongeveer 25-50 BOB's per koepel van 5 μL te hebben.
        OPMERKING: Als de gewenste dichtheid in het testmengsel niet wordt bereikt, moet het uiteindelijke volume van de BOB-suspensie worden aangepast door meer organoïde-kweekmedia toe te voegen of door de BOB-suspensie te centrifugeren en de BOB-pellet opnieuw te suspenderen in een lager volume ijskoude organoïde-kweekmedia. Ongeacht hoe de BOB-suspensie in deze stap wordt gewijzigd, is de eindverhouding van BME: BOB-ophanging in stap 1.5.3. moet 1:1 zijn.
    3. Gebruik een pipetto van 200 μl met brede boringen en meng de PDO-suspensie zorgvuldig met een gelijke hoeveelheid BME om een verhouding van 1:1 van organoïde kweekmedia tot BME te bereiken. Vermijd luchtbellen, die de integriteit van de koepels verstoren.
    4. Gebruik een pipettor van 20 μL om koepels van 5 μL in het midden van elk putje van een voorverwarmde plaat met 96 putjes te zaaien, waarbij alleen de binnenste 60 putjes worden gezaaid. Om een gelijkmatige verdeling van de BOB's te garanderen, pipeert u de inhoud van de buis van 1,5 ml periodiek met een pipetor van 200 μl met brede uitloop.
    5. Nadat alle kuiltjes zijn gezaaid, plaatst u het deksel op het bord en keert u voorzichtig om. Incubeer de omgekeerde plaat bij 37 °C gedurende 20 minuten in de weefselkweekincubator om de koepels te laten stollen.
      OPMERKING: Het omkeren van de plaat zorgt ervoor dat de BME/organoïde kweekmediakoepel de 3D-structuur behoudt om voldoende ruimte te bieden voor PDO-vorming.
    6. Draai de plaat om zodat deze met het deksel omhoog staat en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C.

2. Behandelingen en toevoeging van fluorescerende kleurstoffen voor multiplexing

  1. Terwijl BME-koepels stollen in de platen met 96 putjes, bereidt u verdunningen voor van fluorescerende reagentia voor beeldvorming van levende cellen. Hierin worden specifieke parameters gegeven voor het multiplexen van Annexine V Red Dye en Cytotox Green Dye.
  2. Bereiding van fluorescerend reagens (dag -1): Bereken het juiste volume organoïdekweekmedia op basis van het aantal te behandelen putjes, ervan uitgaande dat elk putje zal worden behandeld met 100 μL kleurstofgedoseerde media. Verdun de kleurstof in voorverwarmde organoïde-kweekmedia tot de gewenste concentratie.
    OPMERKING: De totale hoeveelheid media die nodig is, is afhankelijk van het experiment. Voeg 10% toe aan het uiteindelijke volume om rekening te houden met pipetteerfouten. Om bijvoorbeeld de binnenste 60 putjes van een plaat met 96 putjes te behandelen, bereidt u 6,6 ml kleurstofgedoseerde media (tabel 1).
  3. Behandel elk putje met 100 μL 2x kleurstofgedoseerde organoïde kweekmedia. Voeg 200 μL steriele 1x PBS toe aan de buitenste lege putjes van de plaat. Incubeer bij 37 °C gedurende een nacht.
    OPMERKING: PBS in de perifere putten vermindert de verdamping van media uit de binnenste putten.
  4. Toevoeging van geneesmiddelen/behandelingsmiddelen (dag 0): Bereid geneesmiddelen in voorverwarmde organoïdekweekmedia in een concentratie van 2x in een volume van 100 μL per putje.
    OPMERKING: DMSO kan bij hoge concentraties giftig zijn voor cellen. Een concentratie van 0,1% DMSO wordt niet overschreden in de experimenten die in dit onderzoek zijn uitgevoerd. Naast medicijnen worden sommige fluorescerende reagentia gedistribueerd als een DMSO-oplossing. Het is belangrijk om rekening te houden met de totale DMSO-concentratie bij het werken met dergelijke reagentia.
  5. Voeg 100 μL 2x kleurstofgedoseerde media toe aan elk putje; Vermijd het creëren van bubbels.

3. Beeldvormingsparameters instellen

  1. Plaats de plaat in Cytation 5. Openen Gen5-software. Klik op Nieuwe taak > handmatige modus Imager. Selecteer Nu vastleggen en voer de volgende instellingen in: Objectief (selecteer de gewenste vergroting); Filter (selecteer microtiterplaat); Microplaatformaat (selecteer het aantal putjes); en Scheepstype (selecteer plaattype). Klik op Deksel gebruiken en Lagere dragersnelheid gebruiken. Klik op OK.
    OPMERKING: Tanktype: Wees zo specifiek mogelijk bij het selecteren van informatie over de plaat, omdat de software is gekalibreerd op de specifieke afstand van het objectief tot de onderkant van de plaat voor elk plaattype en elke dikte van het plastic.
    Lagere dragersnelheid: Selecteer dit vakje om te voorkomen dat koepels worden verstoord bij het laden/lossen van platen.
  2. Maak een Z-Stack die de hele BME-koepel in beeld brengt.
    1. Selecteer een bron die u wilt bekijken (linkerdeelvenster, onder histogram).
    2. Selecteer het Bright Field-kanaal (linkerpaneel, boven). Klik op Automatisch blootstellen en pas de instellingen naar wens aan.
    3. De onder- en bovenkant van de Z-stapel instellen: Vouw het tabblad Beeldmodus uit (linkerdeelvenster, midden). Vink het vakje Z-Stack aan. Gebruik de pijlen voor het aanpassen van de koers (linkerdeelvenster, midden) en klik op de neerwaartse aanpassing totdat alle BOB's in en uit focus zijn gekomen en wazig zijn. Stel dit in als de onderkant van de Z-Stack. Herhaal dit in de tegenovergestelde richting met behulp van de pijlen voor het aanpassen van de koers om de bovenkant van de Z-stapel in te stellen.
    4. Om er zeker van te zijn dat de instellingen van de Z-Stack geschikt zijn voor andere interessante bronnen, selecteert u een andere put (linkerpaneel, onder histogram) en visualiseert u de boven- en onderkant van de Z-Stack.
    5. Om de brandpuntsafstanden handmatig in te voeren, klikt u op de drie puntjes naast de fijnafstelling (linkerpaneel, boven). Er wordt een venster geopend; typ de bovenste Z-Stack-waarde (te vinden in het linkerdeelvenster, in het midden, onder Imaging Mode). Herhaal dit voor de onderste Z-Stack-waarde. Pas indien nodig aan om het gewenste Z-bereik vast te leggen door stap 3.2.3 te herhalen. Als er aanpassingen nodig waren, selecteer dan een ander putje om de instellingen te controleren.
  3. Stel de belichtingsinstellingen voor de fluorescentiezender(s) in. De instellingen worden beschreven voor twee fluorescentiekanalen (GFP en TRITC). Het specifieke aantal fluorescerende kanalen hangt af van het experiment en welke fluorescerende kubussen in het live-cell beeldvormingssysteem zijn geïnstalleerd.
    OPMERKING: Als wordt verwacht dat de signaalintensiteit aan het einde van het experiment aanzienlijk hoger zal zijn, moeten gebruikers overwegen testexperimenten uit te voeren om de optimale belichtingsinstellingen aan het einde van het experiment te bepalen die vervolgens kunnen worden toegepast bij het instellen van de initiële parameters.
    1. Vouw het tabblad Beeldmodus uit (linkerdeelvenster, midden) en open Bewerkingsstap. Er verschijnt een pop-upvenster.
    2. Klik onder Kanalen op de bubbel voor het gewenste aantal kanalen. Wijs één kanaal aan voor een helder veld en extra kanalen voor elk fluorescerend kanaal. In dit voorbeeld is Kanaal 1 = Helder veld; Kanaal 2 = GFP; Kanaal 3 = TRITC. Selecteer met behulp van de vervolgkeuzemenu's Kleur de juiste instelling voor elk kanaal. Sluit het bewerkingsvenster door op OK te klikken.
    3. Stel elk fluorescerend kanaal in.
      1. Schakel het kanaal naar GFP (linkerpaneel, boven).
      2. Klik op Automatisch blootstellen (linkerdeelvenster, boven). Vouw het tabblad Belichting uit (linkerdeelvenster, midden) en pas de belichtingsinstellingen aan om het achtergrondsignaal te minimaliseren.
      3. Kopieer de belichtingsinstellingen naar het tabblad Beeldmodus volgens de stappen 3.3.3.3-3.3.3.6.
      4. Klik op het pictogram Kopiëren naast het vak Afbeeldingsstap bewerken . Klik op Afbeeldingsstap bewerken, waardoor een ander venster wordt geopend.
      5. Klik onder het GFP-kanaal op het pictogram Klembord op de regel Belichting om de instellingen voor Verlichting, Integratietijd en Cameraversterking aan het kanaal toe te voegen.
      6. Herhaal stap 3.3.3.4-3.3.3.5 voor het TRITC-kanaal. Klik op OK om het venster te sluiten.
  4. Stel de stappen voor beeldvoorbewerking en Z-projectie in om de voorbewerking van afbeeldingen te automatiseren.
    1. Klik op het camerapictogram (linkerpaneel, benedenhoek). Er wordt een nieuw venster geopend.
    2. Klik onder Verwerkingsstap toevoegen (linkerdeelvenster, onderaan) op Beeldvoorbewerking. Er wordt een nieuw venster geopend.
    3. Schakel op het tabblad Helder veld de optie Beeldvoorbewerking toepassen uit.
    4. Zorg ervoor dat voor elk tabblad Fluorescerend kanaal de optie Beeldvoorbewerking toepassen is geselecteerd. Schakel Dezelfde opties gebruiken als kanaal 1 uit en klik op OK. Het venster wordt gesloten.
    5. Klik onder Verwerkingsstap toevoegen op Z-projectie. Er wordt een nieuw venster geopend. Pas desgewenst het slicebereik aan (bijv. om het Z-bereik te verkleinen). Sluit het venster door OK te selecteren.
  5. Maak een protocol.
    1. Klik op Afbeeldingenset in de knoppenbalk. Klik in het dropdown-menu op Experiment maken op basis van deze afbeeldingenset. Het beeldvormingsvenster wordt gesloten en het procedurevenster wordt geopend.
      OPMERKING: De parameters die in de handmatige modus van Imager zijn geselecteerd, worden automatisch in het nieuwe venster geladen, waardoor een experimenteel protocol kan worden gemaakt.
    2. De temperatuur en helling instellen: Klik op 'Stel temperatuur in ' onder het kopje 'Acties ' (links). Er wordt een nieuw venster geopend. Selecteer Incubator aan en voer handmatig de gewenste temperatuur in onder Temperatuur. Voer vervolgens onder Verloop handmatig 1 in. Sluit het venster door OK te selecteren.
      NOTITIE: Door een gradiënt van 1 °C te creëren, wordt condensvorming op het deksel van de plaat voorkomen.
    3. Wijs putten aan de afbeelding aan.
      1. Dubbelklik op de afbeeldingsstap onder Beschrijving. Klik op Volledige plaat (rechterhoek, boven). Hierdoor wordt het venster Plaatlay-out geopend.
      2. Markeer interessante bronnen met behulp van de cursor. Klik op OK. Vink desgewenst de vakjes Autofocus Binning en Capture Binning aan. Klik op OK om het venster te sluiten.
        OPMERKING: Bij het samenvoegen van de binning moet de belichting worden aangepast, zoals beschreven in stap 3.3.3.2 hierboven. Raadpleeg de sectie Discussie voor specifieke scenario's waarin deze functie kan worden gebruikt.
    4. Stel intervallen in voor kinetische beeldvorming.
      1. Klik op Opties onder het kopje Overig (links). Vink het vakje Discontinuous Kinetic Procedure aan.
      2. Voer onder Geschatte totale tijd de uitvoeringstijd voor het experiment in (bijvoorbeeld 5 dagen). Voer onder Geschat interval het interval in om de plaat af te beelden (bijv. elke 6 uur).
      3. Klik op Pauzeren na elke run om de plaat de tijd te geven om naar de couveuse te worden overgebracht. Sluit het venster door OK te selecteren.
    5. Werk de stappen voor gegevensreductie bij.
      1. Klik op OK om het procedurevenster te sluiten. Er wordt een tabblad geopend om de stappen voor gegevensreductie bij te werken. Selecteer Ja. Dubbelklik op Beeldvoorbewerking. Klik door de verschillende kanalen om de instellingen te controleren en klik op OK.
      2. Dubbelklik op Z-projectie. Klik door de verschillende kanalen om de instellingen te controleren. Klik op OK. Klik vervolgens nogmaals op OK om het venster Gegevensreductie te sluiten.
    6. Formatteer de plaatlay-out.
      1. Open de wizard Plaatlay-out en wijs puttypen aan volgens de stappen 3.6.2-3.6.3.
      2. Klik op het pictogram Plaatlay-out in de werkbalk (linkerhoek, boven) om de wizard Plaatlay-out te openen.
      3. Vink de vakjes aan naast de puttypen die in het experiment zijn gebruikt. Voer onder Besturingselementen voor analyse het aantal verschillende besturingstypen in met behulp van de pijlen. Klik op Volgende om het venster Assay Control #1 te openen.
      4. Stel de toestand van de analyseboorput in volgens de stappen 3.6.5-3.6.8.
      5. Voer in het venster Assay Control #1 het controlelabel in het vak Plate Layout ID in. Voer desgewenst de volledige naam in het vak ernaast in. Selecteer het aantal replicaten voor de betreffende controleconditie met behulp van de pijlen.
      6. Als u meerdere concentraties of een verdunningsreeks gebruikt binnen de controle, klikt u op Verdunningen/concentraties definiëren en gebruikt u het vervolgkeuzemenu om het type te selecteren. Voer de waarden voor elke concentratie/verdunning in de tabel in.
        OPMERKING: De automatische functie kan worden gebruikt als de concentraties met een constante toename veranderen.
      7. Selecteer het tabblad Kleur in de werkbalk. Kies de gewenste tekstkleur en achtergrondkleur voor controle in het vervolgkeuzemenu. Klik op Volgende.
      8. Herhaal indien nodig met extra bedieningselementen.
      9. Stel de toestand van de monsterput in volgens de punten 3.6.10-3.6.12.
      10. Voer op de pagina Voorbeeldinstellingen het voorvoegsel van de voorbeeld-id in (bijvoorbeeld SPL). Selecteer het aantal replicaten met behulp van de pijlen. Als u monsters met verschillende behandelingsconcentraties gebruikt, selecteert u Concentraties of Verdunningen in het vervolgkeuzemenu Type . Voer verdunningen/concentraties in de tabel in en voer eenheden in het vak Eenheid in.
      11. Selecteer Identificatievelden in de werkbalk. Voer de gewenste categorienaam/-namen (bijv. monster-ID, geneesmiddel) in de tabel in.
      12. Selecteer het tabblad Kleur in de werkbalk. Selecteer een andere kleur voor elke behandelingsgroep/monster. Klik op Voltooien. Hierdoor wordt de pagina Plaatlay-out geopend.
        OPMERKING: De nummers aan de linkerkant komen overeen met de verschillende voorbeeldnummers.
      13. Wijs voorbeeld-id's toe volgens de stappen 3.6.14-3.6.16.
      14. Selecteren SPL1 in het linkerpaneel. Gebruik de cursor om putten te selecteren.
        OPMERKING: Autoselect-tools kunnen worden aangepast in het vak voor seriële toewijzing. Het aantal replica's en de oriëntatie van de lay-out kunnen vooraf worden aangewezen.
      15. Herhaal dit met andere voorbeelden om de plaatlay-out te voltooien. Als u tevreden bent, klikt u op OK.
      16. Selecteer op de werkbalk Bestand de optie Voorbeeld-id's. Vul de kolommen Monster-ID in met de juiste informatie voor elk monster (bijv. medicijntype). Druk op OK.
    7. Sla het protocol op.
      1. Klik in de knoppenbalk op Bestand > Protocol opslaan als. Selecteer de locatie om het bestand op te slaan. Voer een bestandsnaam in. Klik op Opslaan om het venster te sluiten.
      2. Klik op Bestand > Afsluiten in de knoppenbalk. Er wordt een tabblad geopend om wijzigingen in de handmatige modus van Imager op te slaan. Selecteer Nee.
      3. Er wordt een tabblad geopend om wijzigingen in Experiment 1 op te slaan. Selecteer Nee. Er wordt een tabblad geopend om de protocoldefinitie bij te werken. Selecteer Bijwerken. Sluit de software.
  6. Importeer het protocol in BioSpa OnDemand en voltooi het instellen van het experiment.
    1. Open de BioSpa OnDemand (planningssoftware) software.
    2. Selecteer een beschikbaar slot in de software.
    3. Verwijder de plaat van het beeldvormingssysteem met levende cellen. Klik op Lade openen om toegang te krijgen tot de juiste sleuf in de planningssoftware en plaats de plaat. Klik op Lade sluiten.
      OPMERKING: Deze stap kan op elk moment worden uitgevoerd nadat het protocol is gemaakt in stap 3.5.7 hierboven. De plaat moet zich echter in de Cytatie 5 bevinden om een timingrun uit te voeren in de onderstaande stap 3.6.4.3.
    4. Importeer het protocol.
      1. Selecteer op het tabblad Procedure-informatie de optie Gebruiker in het vervolgkeuzemenu. Klik naast de sleuf Protocol op Selecteren > Een nieuw item toevoegen.
      2. Klik naast de protocolsleuf op Selecteren. Dit opent een nieuw venster om naar het gewenste protocol in de bestandsarchitectuur te navigeren. Klik op Openen om het protocol in de planningssoftware te importeren.
      3. Voer de hoeveelheid tijd in die nodig is om de plaat af te beelden. Klik op OK om het venster Gen5 Protocol List te sluiten.
        OPMERKING: Deze stap is vooral belangrijk wanneer u meerdere experimenten tegelijk uitvoert. Als u de tijd wilt bepalen die nodig is om de afbeelding te maken, klikt u op Nu een timingrun uitvoeren. Klik op OK.
    5. Stel beeldvormingsintervallen in en plan het experiment.
      1. Voer onder Interval het beeldvormingsinterval in dat is aangegeven in stap 3.5.4.
      2. Selecteer onder Opties voor starttijd de optie Indien beschikbaar. Selecteer onder Duur de optie Vast of Doorlopend.
        OPMERKING: Er kan een specifieke starttijd worden aangewezen in plaats van het protocol op de eerstvolgende beschikbare tijd uit te voeren. Als u Vaste duur selecteert, wordt een specifiek eindpunt voor het experiment ingesteld en moet de gebruiker een experimenteel tijdsbestek aanwijzen. Met Continue duur kan het experiment worden uitgevoerd zonder eindpunt en kan het alleen worden beëindigd door een gebruiker die het experiment stopt.
      3. Klik op Schema plaat/vaartuig. Hierdoor wordt de plaatvalidatiesequentie geopend. Er wordt een tabblad geopend met de voorgestelde eerste leestijd. Klik op Ja om dit schema te accepteren.

4. Beeldanalyse in Gen5-software (Figuur 2)

  1. Open de module Beeldanalyse.
    1. Open Gen5. Selecteer in Taakbeheer de optie Experimenten > Openen. Selecteer het experiment om het bestand te openen. Klik op 'Plaat> 'Weergave' in de knoppenbalk.
    2. Wijzig het vervolgkeuzemenu Gegevens in Z-projectie. Dubbelklik op een bron die u interesseert. Selecteer Analyseren > ik een nieuwe stap voor het verminderen van beeldanalysegegevens wil instellen. Klik op OK.
  2. Cellulaire analyse
    1. Primair masker
      1. Selecteer onder Analyse-instellingen de optie Type: Cellulair analyse- en detectiekanaal: ZProj[Tsf[Helder veld]] (linkerdeelvenster, midden).
      2. Klik op Opties. Hiermee wordt de pagina Primair masker en aantal geopend. Schakel in het vak Drempel Automatisch het selectievakje Automatisch in en klik op Toepassen. Klik op het vak Objecten markeren (rechterdeelvenster, onderaan) om objecten binnen de aangewezen drempelwaarde weer te geven. Pas indien nodig aan om interessante objecten op te nemen.
        OPMERKING: Drempelinstellingen zijn gebaseerd op pixelintensiteit. Als de drempelwaarde bijvoorbeeld is ingesteld op 5000, worden pixels met een intensiteit van meer dan 5000 opgenomen in de analyse.
      3. Geef onder Objectselectie de minimale en maximale objectgrootte (μm) aan. Pas indien nodig aan om cellulair afval/afzonderlijke cellen uit te sluiten.
        NOTITIE: De grootte van de BOB kan aanzienlijk variëren tussen verschillende modellen en typen. Gebruik het meetinstrument in de Gen5-software om de minimale en maximale BOB-groottedrempels voor elk model te bepalen. Gebruikers kunnen een kleinere minimale drempelwaarde voor de BOB-grootte kiezen ten opzichte van de waarde die door het meetinstrument wordt geleverd om te voorkomen dat BOB-fragmenten op latere tijdstippen na de medicamenteuze behandeling worden uitgesloten.
      4. Als u de analyse wilt beperken tot een bepaald gebied van de put, schakelt u het aankruisvak 'Analyseer volledige afbeelding ' uit en klikt u op 'Stekker'. Gebruik in het venster Afbeeldingsplug het vervolgkeuzemenu om Plugvorm te selecteren. Pas de grootte- en positieparameters indien nodig aan het gewenste gebied aan.
        OPMERKING: Het is belangrijk om het aantal BOB's in de stekker te maximaliseren en tegelijkertijd PDO-vrije gebieden uit te sluiten om de achtergrond te minimaliseren. Wijs een pluggrootte aan die consequent de meerderheid van de interessante objecten in replicaten vastlegt. Het genereren van een plug die ook de randen van de koepel uitsluit, is belangrijk omdat het alle objecten uitsluit die vervormd kunnen lijken als gevolg van de breking van licht door de extreme kromming van de koepel rond de randen. Objecten aan de primaire rand kunnen ook worden uitgeschakeld om alleen volledige BOB's in de plug vast te leggen.
    2. Analyse van subpopulaties. Een voorbeeld van de aanwijzing van een subpopulatie is weergegeven in figuur 3.
      1. Klik op Berekende statistieken in de werkbalk Cellulaire analyse. Klik op Interessante statistieken op objectniveau selecteren of maken (rechterhoek, onderaan). Selecteer onder Beschikbare objectstatistieken de gewenste statistieken (bijvoorbeeld circulariteit) en klik op de knop Invoegen. Klik op OK.
        OPMERKING: De morfologie en dichtheid van elk BOB-model bepalen de beste maatstaven die van belang zijn om de subpopulatie te onderscheiden.
      2. Klik op Subpopulatieanalyse in de werkbalk Mobiele analyse . Klik op Toevoegen om een nieuwe subpopulatie te maken. Er wordt een pop-upvenster geopend.
      3. Voer desgewenst een naam in voor de subpopulatie. Selecteer onder Objectstatistieken een interessante statistiek en druk op Voorwaarde toevoegen. Voer in het venster Voorwaarde bewerken parameters in voor de gekozen objectmetrie. Herhaal dit indien nodig met aanvullende statistieken.
        NOTITIE: Parameters kunnen handmatig worden aangepast of worden ingesteld met behulp van de zoeker. Om bijvoorbeeld vuil uit te sluiten, kunnen gebruikers Gebied toevoegen als een objectstatistiek en objecten selecteren die kleiner zijn dan 800. Circulariteit als objectmetriek wordt routinematig gebruikt en alle objecten met een circulariteit groter dan 0,2-0,5 worden opgenomen, afhankelijk van het model.
      4. Controleer in de tabel onder aan het venster de gewenste resultaten die u wilt weergeven. Klik op OK > Toepassen.
      5. Als u de objecten in de subpopulatie wilt weergeven, gebruikt u het vervolgkeuzemenu Objectdetails (rechterdeelvenster, midden) om de subpopulatie te selecteren. Objecten die binnen de parameters vallen, worden in de afbeelding gemarkeerd.
        OPMERKING: Als u de markeringskleuren van het primaire masker en de subpopulatie wilt wijzigen, klikt u op Instellingen (rechterdeelvenster, onderaan).
      6. Als u de parameters van de subpopulatie wilt aanpassen, opent u het venster Subpopulatieanalyse opnieuw op de werkbalk 'Mobiele analyse '. Selecteer de subpopulatie en klik op Bewerken. Klik op Stap toevoegen.
        OPMERKING: Hiermee wordt dezelfde analyse toegepast op alle putten binnen het experiment op alle tijdstippen. In het vervolgkeuzemenu op de Matrix-pagina kunnen verschillende statistieken worden geselecteerd voor individuele weergave.

5. Gegevens exporteren van Gen5 naar Excel

  1. Als u een gegevensbestand wilt aanpassen voor export, selecteert u het pictogram Rapport-/exportbouwers in de werkbalk. Klik in het pop-upvenster op Nieuwe export naar Excel.
  2. Selecteer op de pagina Eigenschappen van het pop-upvenster de optie Bereik > plaat en Inhoud > Aangepast. Klik op de optie Inhoud in de werkbalk. Klik op Sjabloon bewerken, waardoor het Excel-programma wordt geopend.
  3. Selecteer in de spreadsheet Invoegtoepassingen > tabel > putgegevens. Plaats de muisaanwijzer op de verschillende selecties om opties voor export te zien. Selecteer de gewenste statistiek (bijv. Object Mean[ZProj[Tsf[TRITC]]]).
    OPMERKING: De plaatlay-out kan worden toegevoegd aan de spreadsheetanalysesjabloon door Invoegtoepassingen > Protocoloverzicht > Lay-out te selecteren.
  4. Er wordt een venster Bewerken geopend. Wijs in het vak Wells de putten aan voor export door Well-ID of Well #. Selecteer OK. Er wordt een sjabloon in het spreadsheetbestand geladen. Spreadsheet sluiten. Het sjabloon wordt automatisch opgeslagen.
  5. Klik op OK in het venster Nieuwe export naar Excel en sluit het venster Rapport/Constructeurs exporteren .
  6. Klik op het pictogram Exporteren in de Gen5-werkbalk. Vink het vakje naast het gewenste exportbestand aan. Klik op OK. Gen5 vult automatisch de spreadsheetsjabloon in en opent het bestand in Excel.

6. Externe data-analyse

  1. Open het Bestand exporteren (.xlsx) in Excel.
  2. Deel voor elk putje elke afzonderlijke waarde door de 0:00-tijdpuntwaarde voor dat putje. Hiermee wordt tijdstip 0 gelijk aan 1 ingesteld, en elke waarde daarboven is relatief ten opzichte van de eerste meting.
  3. Open een nieuw bestand in de data-analysesoftware. Selecteer de optie XY-lay-out .
    OPMERKING: In dit protocol werd GraphPad Prism (versie 9.5.1) gebruikt.
  4. Invoerlabels voor elke gegevensgroep. Kopieer en plak de tijdstippen en bijbehorende genormaliseerde waarden voor elke behandelingsgroep in de Prisma-tabel. Een grafiek voor de gegevens wordt automatisch gegenereerd en is te vinden onder Grafieken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Ons doel was om de haalbaarheid aan te tonen van het gebruik van gemultiplexte beeldvorming van levende cellen om de therapeutische respons van PDO's te beoordelen. Proof of concept-experimenten werden uitgevoerd in twee afzonderlijke BOB-modellen van endometriumkanker: ONC-10817 en ONC-10811 (zie aanvullende figuur 1 en aanvullende figuur 2 voor ONC-10811-gegevens). Apoptose (annexine V-kleuring) en cytotoxiciteit (opname van Cytotox Green) werden kinetisch gecontroleerd als reactie op ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

PDO-culturen worden een steeds populairder in vitro modelsysteem vanwege hun vermogen om cellulaire reacties en gedragingen weer te geven. Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt op het gebied van het genereren, kweken en uitbreiden van BOB's, maar de methoden om therapeutische reacties te analyseren zijn achtergebleven. In de handel verkrijgbare 3D-levensvatbaarheidskits zijn lytische eindpuntassays, die potentieel waardevolle kinetische responsgegevens missen en daaropvolgende analyses met andere...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

KWT is mede-eigenaar van Immortagen Inc. CJD is een werknemer van Agilent. JSdB heeft zitting gehad in adviesraden en vergoedingen ontvangen van Amgen, Astra Zeneca, Astellas, Bayer, Bioxcel Therapeutics, Boehringer Ingelheim, Cellcentric, Daiichi, Eisai, Genentech/Roche, Genmab, GSK, Harpoon, ImCheck Therapeutics, Janssen, Merck Serono, Merck Sharp & Dohme, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Pfizer, Qiagen, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Terumo en Vertex Pharmaceuticals; is een werknemer van het Institute of Cancer Research (ICR), die voor zijn onderzoekswerk financiering of andere steun heeft ontvangen van AZ, Astellas, Bayer, Cellcentric, Daiichi, Genentech, Genmab, GSK, Janssen, Merck Serono, MSD, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Pfizer en Vertex, en die een commercieel belang heeft in abirateron, PARP-remming bij DNA-reparatie defecte kankers, en PI3K/AKT-routeremmers (geen persoonlijk inkomen); is genoemd als uitvinder, zonder financieel belang, voor octrooi 8 822 438, ingediend door Janssen dat betrekking heeft op het gebruik van abirateronacetaat met corticosteroïden; is de CI/PI geweest van veel door de industrie gesponsorde klinische onderzoeken; en is een senior onderzoeker van het National Institute for Health Research (NIHR). Er zijn geen andere auteurs die potentiële belangenconflicten openbaar moeten maken.

Dankbetuigingen

We zijn de Tissue Procurement Core en Dr. Kristen Coleman van de Universiteit van Iowa dankbaar voor het verstrekken van tumormonsters van patiënten en Dr. Sofia Gabrilovich van de afdeling Verloskunde en Gynaecologie voor het helpen bij het genereren van PDO-modellen. We danken ook Dr. Valerie Salvatico (Agilent, USA) voor haar kritische analyse van het manuscript. We erkennen de volgende financieringsbronnen: NIH/NCI CA263783 en DOD CDMRP CA220729P1 aan KWT; Cancer Research UK, Prostate Cancer UK, Prostate Cancer Foundation en Medical Research Council aan JSdB. De financiers hadden geen rol in het ontwerp of de analyse van experimenten of de beslissing om te publiceren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL microcentrfuge tubeDot Scientific Inc1008113
15 mL conical centrifuge tubeSarstedt62.554.100
554 NM LED CubeAgilent1225012
96-well plateCorning Costar3596Voorverwarmd tot 37 °C
96-well plateAgilent204626-100Voorverwarmd tot 37 °C
A83-01Tocris2939De uiteindelijke concentratie is 500 nM (component van organoid kweekmedium)
Advanced DMEM/F-12Gibco12634-010Component van organoid kweekmedium
B27 SupplementGibco17504044De uiteindelijke concentratie is 1x (component van organoid kweekmedium)
BioTek BioSpa 8 Automated IncubatorAgilentBIOSPAG-SNIncubator voor op tafel; BioSpa OnDemand planningssoftware communiceert met Gen5 om platen over te zetten tussen de BioSpa en de Cytation 5 voor beeldvorming (dit protocol gebruikt versie 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode ReaderAgilentCYT5PW-SNPlate reader; Gen5 software wordt gebruikt voor dit apparaat (dit protocol gebruikt versie 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane ExtractR&D SystemsBME001-10
Daunorubicin HClSigma-AldrichS3035Geconstitueerd in DMSO
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD2438
EDTA (0.5 M)Thermo FisherAM9260G
ForskolinTocris1099De uiteindelijke concentratie is 10 µM (component van organoid kweekmedium)
GlutamaxGibco35050-061De uiteindelijke concentratie is 1x (component van organoid kweekmedium)
HEPESGibco15630-080De uiteindelijke concentratie is 10 mM (component van organoid kweekmedium)
Human EGF, Animal-Free Recombinant ProteinGibcoAF-100-15-1MGDe uiteindelijke concentratie is 0.5 ng/mL (component van organoid kweekmedium)
Human FGF-10 Recombinant ProteinGibco100-26-1MGDe uiteindelijke concentratie is 10 ng/mL (component van organoid kweekmedium)
Human R-Spondin 1 Recombinant ProteinGibco120-38-5UGDe uiteindelijke concentratie is 250 ng/mL (component van organoid kweekmedium)
Hydrocortisone Stock SolutionStemCell Technologies7926De uiteindelijke concentratie is 500 ng/mL (component van organoid kweekmedium)
Imaging Filter Cube- GFPAgilent1225101
Imaging Filter Cube- TRITCAgilent1225125
Imaging LED GFP/CFPAgilent1225001
Incucyte Annexin V Red DyeSartorius4641Geconstitueerd in organoid kweekmedium
Incucyte Cytotox Green DyeSartorius4633DMSO oplossing
N-Acetyl-L-cysteineSigma-AldrichA7250De uiteindelijke concentratie is 1.25 mM (component van organoid kweekmedium)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining SolutionFisher-Scientific13366169Voeg 1:50 volume toe
NicotinamideSigma-AldrichN0636De uiteindelijke concentratie is 10 mM (component van organoid kweekmedium)
NogginR&D Systems6057-NGDe uiteindelijke concentratie is 100 ng/mL (component van organoid kweekmedium)
Penicillin-StreptomycinGibco15140122De uiteindelijke concentratie is 10 eenheden/mL (component van organoid kweekmedium)
Phosphate Buffered Saline (1x)Gibco14190-144
PrimocinInvivoGenant-pm-05De uiteindelijke concentratie is 100 µg/mL (component van organoid kweekmedium)
Recombinant Human Heregulinβ-1Pepro Tech100-03De uiteindelijke concentratie is 37.5 ng/mL (component van organoid kweekmedium)
Staurosporine solution from Streptomyces sp.Sigma-AldrichS6942
TrypLE ExpressLife Technologies12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7Sigma-Aldrich688000De uiteindelijke concentratie is 5 µM (component van organoid kweekmedium)
β-EstradiolSigma-AldrichE2758De uiteindelijke concentratie is 100 nM (component van organoid kweekmedium)

Referenties

  1. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  2. Lohmussaar, K., Boretto, M., Clevers, H. Human-derived model systems in gynecological cancer research. Trends Cancer. 6 (12), 1031-1043 (2020).
  3. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  4. de Witte, C. J., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids mimic clinical response and exhibit heterogeneous inter- and intrapatient drug responses. Cell Rep. 31 (11), 107762(2020).
  5. Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Curr Pharm Biotechnol. 17 (14), 1213-1221 (2016).
  6. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nat Protoc. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  7. Alzeeb, G., et al. Gastric cancer cell death analyzed by live cell imaging of spheroids. Sci Rep. 12 (1), 1488(2022).
  8. Deben, C., et al. OrBITS: label-free and time-lapse monitoring of patient derived organoids for advanced drug screening. Cell Oncol (Dordr). 46 (2), 299-314 (2023).
  9. Tamura, H., et al. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues). Oncol Rep. 40 (2), 635-646 (2018).
  10. Le Compte, M., et al. Multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis. J Vis Exp. 190, 64434(2022).
  11. Hanson, K. M., Finkelstein, J. N. An accessible and high-throughput strategy of continuously monitoring apoptosis by fluorescent detection of caspase activation. Anal Biochem. 564-565, 96-101 (2019).
  12. Isherwood, B., et al. Live cell in vitro and in vivo imaging applications: accelerating drug discovery. Pharmaceutics. 3 (2), 141-170 (2011).
  13. Bi, J., et al. Successful patient-derived organoid culture of gynecologic cancers for disease modeling and drug sensitivity testing. Cancers (Basel). 13 (12), 2901(2021).
  14. Binaschi, M., Zunino, F., Capranico, G. Mechanism of action of DNA topoisomerase inhibitors. Stem Cells. 13 (4), 369-379 (1995).
  15. Park, Y. Y., Ahn, J. H., Cho, M. G., Lee, J. H. ATP depletion during mitotic arrest induces mitotic slippage and APC/C(Cdh1)-dependent cyclin B1 degradation. Exp Mol Med. 50 (4), 1-14 (2018).
  16. Lukonin, I., Zinner, M., Liberali, P. Organoids in image-based phenotypic chemical screens. Exp Mol Med. 53 (10), 1495-1502 (2021).
  17. Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nat Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
  18. Ramm, S., et al. High-throughput live and fixed cell imaging method to screen matrigel-embedded organoids. Organoids. 2 (1), 1-19 (2023).
  19. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nat Protoc. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  20. Van Hemelryk, A., et al. Viability analysis and high-content live-cell imaging for drug testing in prostate cancer xenograft-derived organoids. Cells. 12 (10), 1377(2023).
  21. Bi, J., et al. Advantages of tyrosine kinase anti-angiogenic cediranib over bevacizumab: Cell cycle abrogation and synergy with chemotherapy. Pharmaceuticals (Basel). 14 (7), 682(2021).
  22. Bi, J., et al. Blocking autophagy overcomes resistance to dual histone deacetylase and proteasome inhibition in gynecologic cancer). Cell Death Dis. 13 (1), 59(2022).
  23. Guo, C., et al. B7-H3 as a Therapeutic target in advanced prostate cancer. Eur Urol. 83 (3), 224-238 (2023).
  24. Gil, V., et al. HER3 is an actionable target in advanced prostate cancer. Cancer Res. 81 (24), 6207-6218 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Patiëntafgeleide organoïdenanalyse van medicumresponsgemultiplexte beeldvormingscreening van medicamenten op organoïdenfluorescerende kleurstoffenkinetische beeldvormingz-stack-beeldvormingkwantificering van apoptosecellulaire fenotypering
Meervoudige beeldvorming met levende cellen voor geneesmiddelresponsen in van patiënten afgeleide organoïdemodellen van kanker
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.