Methodenartikel

Evaluatie van de toxiciteit van chemicaliën met behulp van een Zebrafish Vibration Startle Response Screening System

DOI:

10.3791/66153

⸱

12 januari 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biological and Chemical Systems - Biological Information Processing, Karlsruhe Institute of Technology - Campus Nord, 2DITABIS AG - Digital Biomedical Imaging Systems AG, 3Centre for Organismal Studies, Heidelberg University, 4School of Biosciences, University of Birmingham, 5Institute for Automation and Applied Informatics, Karlsruhe Institute of Technology - Campus Nord, 6Department of Bioanalytical Ecotoxicology, Helmholtz-Centre for Environmental Research - UFZ

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven de workflow en data-analyse van een screeningssysteem voor het evalueren van de toxiciteit van chemische verbindingen op basis van de schrikreactie van zebravisembryo's. Het systeem registreert de bewegingen van zebravisembryo's bij blootstelling aan een trillingsstimulus en maakt een geïntegreerde evaluatie van algemene toxiciteit/letaliteit en neuromusculaire toxiciteit mogelijk.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We ontwikkelden een eenvoudig screeningssysteem voor de evaluatie van neuromusculaire en algemene toxiciteit in zebravisembryo's. Het modulaire systeem bestaat uit elektrodynamische transducers waarboven weefselkweekschaaltjes met embryo's geplaatst kunnen worden. Meerdere van dergelijke luidspreker-weefselkweekschaalparen kunnen worden gecombineerd. Trillingsprikkels die door de elektrodynamische transducers worden gegenereerd, veroorzaken een karakteristieke schrik- en ontsnappingsreactie in de embryo's. Een riemaangedreven lineaire aandrijving plaatst achtereenvolgens een camera boven elke luidspreker om de beweging van de embryo's vast te leggen. Op deze manier kunnen veranderingen in de schrikreactie als gevolg van letaliteit of neuromusculaire toxiciteit van chemische verbindingen worden gevisualiseerd en gekwantificeerd. We geven een voorbeeld van de workflow voor het screenen van chemische verbindingen met behulp van dit systeem, inclusief de voorbereiding van embryo's en behandelingsoplossingen, de werking van het registratiesysteem en gegevensanalyse om benchmarkconcentratiewaarden te berekenen van verbindingen die actief zijn in de test. De modulaire opbouw op basis van in de handel verkrijgbare eenvoudige componenten maakt dit systeem zowel economisch als flexibel aanpasbaar aan de behoeften van bepaalde laboratoriumopstellingen en screeningsdoeleinden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen jaren zijn zebravissen zeer populaire modelorganismen geworden voor de evaluatie van de effecten van chemische verbindingen, die onderzoeksgebieden omvatten van de ontwikkeling van geneesmiddelen tot milieutoxicologie1. Als gewervelde dieren delen zebravissen veel aspecten van hun genetische samenstelling en algehele fysiologie met mensen 2,3. Daarom zijn de resultaten die in dit model worden verkregen vaak direct relevant voor de menselijke gezondheid. Verschillende kandidaat-geneesmiddelen die momenteel in klinische onderzoeken worden uitgevoerd, zijn geïdentificeerd in samengestelde schermen met behulp van zebravissen4.

Toxiciteitsbeoordeling is een belangrijke toepassing waarbij tests met behulp van embryonale stadia van zebravissen van belang zijn. Er bestaan verschillende testrichtsnoeren van de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling (OESO) voor het gebruik van zebravissen bij milieutoxiciteitstests 5,6. Het kleine formaat en de snelle ontwikkeling van zebravisembryo's maken ze zeer geschikt voor screeningsbenaderingen op een gemiddelde tot hoge doorvoerschaal 1,3,4. Toxicologische eindpunten waarop dergelijke screenings zich richten, zijn onder meer embryonale misvormingen en letaliteit7, hormoonontregeling8, orgaantoxiciteit9 en gedragsbeoordelingen die wijzen op neurale toxiciteit10,11. De gedragstesten zijn mogelijk omdat zebravisembryo's verschillende soorten locomotorische reacties op verschillende stimuli vertonen, afhankelijk van hun ontwikkelingsstadium. Bijvoorbeeld, 1 dag na de bevruchting (dpf) embryo's vertonen spontane staartkronkeling12 en reageren op een opeenvolging van lichtpulsen met een typische opeenvolging van bewegingen, de zogenaamde fotomotorische respons (PMR)10. Na het uitkomen, meestal ongeveer 48-72 uur na de bevruchting (hpf), ontwikkelen de vrij zwemmende eleuthero-embryo's13 geleidelijk schrik- en ontsnappingsreacties op trillingsstimuli vanaf ongeveer 4 dpf14. Deze reacties worden gekenmerkt door een kenmerkende buiging naar de richting tegengesteld aan de richting van de stimulus (de zogenaamde C-bocht of C-start), die wordt gevolgd door een kleinere tegenbuiging en zwemgedrag 14,15,16,17. Met name embryonaal gedrag wordt bepaald door neurale circuits die verschillende neurotransmittersystemen gebruiken, waardoor chemische verbindingseffecten die op deze systemen zijn gericht, kunnen worden onderzocht. De PMR-test onthulde bijvoorbeeld de effecten van verbindingen die interfereren met cholinerge, adrenerge en dopaminerge signalering10, terwijl de schrikreactie cholinerge, glutamaterge en glycinerge neuronen omvat16,18. Bovendien zullen verbindingen die de spieren of de neuromusculaire interface beschadigen ook dit gedrag beïnvloeden, evenals verbindingen die giftig zijn voor de haarcellen van het binnenoor/de zijlijn19,20. Het observeren van het bewegingsgedrag van zebravissen als reactie op een stimulus is dus een geschikt middel om niet alleen neurotoxiciteit te beoordelen, maar ook ototoxiciteit en myotoxiciteit. Het scoren van locomotorisch gedrag dient ook als een proxy voor algemene toxiciteit/letaliteitsbeoordeling, aangezien dode embryo's niet bewegen. Daarbij vertegenwoordigt embryonaal voortbewegingsgedrag een integratieve uitlezing voor een eerstelijns toxiciteitsscreeningbenadering, die letale en neuromusculaire samengestelde effecten in één opstelling aangeeft. Aangezien de eleutheroembryo's al in staat zijn om verbindingen te metaboliseren, kan de aanpak ook de effecten van metabole transformatieproducten detecteren 7,21,22. Belangrijk is dat zebravisembryo's volgens sommige dierenbeschermingswetgeving niet als beschermde levensfase worden beschouwd tot het stadium van vrije voeding na 120 hpf13. Daarom worden ze beschouwd als een alternatief voor toxiciteitstests bij dieren.

figure-introduction-1
Afbeelding 1: Instelling van het schrikreactiesysteem voor trillingen. (A) Overzicht van het systeem. Platen met embryo's die aan de testverbindingen zijn blootgesteld, worden op de elektrodynamische transducerarray ("luidsprekers") geplaatst. De camera wordt achtereenvolgens door de riemaangedreven lineaire aandrijving naar de opnamepositie boven de beoogde transducer bewogen. (B) Gedetailleerd beeld van de transducer/luidspreker met daarop een weefselkweekschaaltje. De platen worden van onderaf verlicht door een LED-lichtplaat van 4000-5000 lux. Een LED-lampje naast de luidspreker licht op terwijl de stimulus wordt gegeven. (C) Stilstaand beeld van video opgenomen door de camera bij stimulatie van de embryo's. (D) Screenshot van het configuratiebestand. (E) Screenshot van de interface van de opnamesoftware. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Hier beschrijven we een testprotocol voor de evaluatie van samengestelde effecten op de trillingsschrikreactie met behulp van een in-house gebouwd eenvoudig testapparaat op basis van trillingsstimuli gegenereerd door elektrodynamische transducers in combinatie met een geautomatiseerde video-opname van verschillende vrij bewegende embryo's in een weefselkweekschaal23. Het systeem is modulair opgebouwd en maakt sequentiële opname van meerdere weefselkweekschalen parallel mogelijk. In de huidige opstelling geven vijf elektrodynamische transducers een trillingsprikkel (500 Hz, duur 1 ms) aan weefselkweekschaaltjes met daarop 20 embryo's (Figuur 1). De platen worden van onderaf verlicht met 4000-5000 lux met LED-lichtplaten. Een LED-lampje naast elke transducer geeft perioden van stimulustoepassing aan en een oscilloscoop geeft golfvormen en frequentie van de toegepaste stimulus aan (zie ref. 23 voor details). Het gedrag van de embryo's wordt vastgelegd door een hogesnelheidscamera (Table of Materials) met 1000 frames per seconde (fps), die door een riemaangedreven lineaire aandrijving boven de beoogde luidspreker wordt bewogen. Deze opnamesnelheid is nodig om de schrikreactie betrouwbaar op te lossen. Het systeem biedt een goedkoop, individueel aanpasbaar alternatief voor de huidige commerciële systemen. De precieze workflow die hieronder wordt beschreven, wordt momenteel uitgevoerd in het kader van het Precision Toxicology-initiatief24 om geschikte blootstellingsomstandigheden te bepalen voor OMICS-gegevensverzameling van zebravisembryo's die zijn behandeld met een geselecteerde set toxische stoffen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle kweek en behandeling van zebravissen werd uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse normen voor dierenbescherming en goedgekeurd door de regering van Baden-Württemberg, Regierungspräsidium Karlsruhe, Duitsland (Aktenzeichen 35-9185.64/BH KIT).

1. Voorbereiding van voorraadoplossingen van te testen chemicaliën

  1. Etiketteer de glazen injectieflacon (of chemisch aliquot) met de naam/afkorting van de verbinding, de voorraadconcentratie en de bereidingsdatum. Bijvoorbeeld, CdCl2_2.5 g· L-1_210813.
  2. Centrifugeer de chemische aliquot bij 2000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur (RT).
  3. Weeg de verbinding (indien nodig) onder een zuurkast af op een weegschaal die gevoelig is voor 0,001 g en breng deze over in de geëtiketteerde injectieflacon. Als de verbinding vloeibaar is, voeg deze dan toe aan de injectieflacon met behulp van een pipet en een plastic pipetpunt.
    OPMERKING: Voor de tricaïne-methaansulfonaatvoorraad die werd gebruikt in het resultaatvoorbeeld in figuur 2, werd bijvoorbeeld 400 mg afgewogen in de geëtiketteerde injectieflacon.
  4. Voeg oplosmiddel toe (bijv. steriel zuiver water of dimethylsulfoxide (DMSO), afhankelijk van de fysisch-chemische eigenschappen van de verbindingen) met behulp van een pipet en een plastic pipetpunt. Indien mogelijk heeft water de voorkeur.
    OPMERKING: Voor de tricaïnebouillon werd bijvoorbeeld een oplossing van 15,3 mM in 100 ml water bereid.
  5. Sluit de injectieflacon, schud voorzichtig en controleer op neerslag.
  6. Bereid verdunde voorraadoplossingen (indien nodig) in glazen injectieflacons met behulp van pipetten en plastic pipetpunten.
    OPMERKING: Er was bijvoorbeeld geen verdere verdunning nodig voor de tricaïnevoorraad.
  7. Bewaar de stockoplossing(en) bij -20 °C tot gebruik.
  8. Bewaar het resterende chemische aliquot onder dezelfde omstandigheden als voorheen.
  9. Noteer voorraadaliquotinformatie in het laboratoriumnotitieboekje.

2. Verzamelen en grootbrengen van zebravisembryo's

  1. Verzamel embryo's in splitsingsstadia (2-8 celstadium) van natuurlijke paaien van groepsparingen in weefselkweekschaaltjes van 10 cm.
  2. Kies een partij van de juiste kwaliteit: minder dan 10% onbevruchte/dode eieren.
  3. Maak de vaat schoon (verwijder onbevruchte eieren, vuil, schubben, enz.).
  4. Plaats 60 embryo's per weefselkweekschaaltje van 10 cm in 15 ml E3-medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4)25.
  5. Plaats de gerechten in een bevochtigde kamer die is voorbereid door met water gedrenkte papieren handdoeken neer te leggen.
  6. Kweek embryo's op tot 72 hpf in een incubator bij 28,5 °C.

3. Voorbereiding van de werkverdunning van te testen chemicaliën

  1. Haal de bouillonoplossing uit de vriezer van -20 °C en laat ontdooien.
  2. Als de oplosbaarheid van de verbinding hoog genoeg is, bereid dan seriële verdunningen in E3-medium in glazen flessen, 1 ml per replicaat per concentratie. Zorg ervoor dat de concentratie 10 keer hoger is dan de gewenste blootstellingsconcentratie. Dit voorkomt dat aan het begin van de blootstelling het hele medium van de embryo's moet worden vervangen. In geval van een lage oplosbaarheid, bereid de seriële verdunningen direct in de gewenste blootstellingsconcentraties, 10 ml per replicaat per concentratie.
  3. Controleer op neerslag (indien nodig). Als de oplossing is neergeslagen, noteer dit dan en verdun het vervolgens verder om de volgende hoogste concentratie te bereiken. Controleer opnieuw op neerslag. Herhaal dit totdat er geen neerslag valt.
  4. Controleer de pH van de belichtingsoplossing. Als u buiten het bereik van pH 7,0-8,5 ligt, noteer dit dan en bereid de oplossingen in E3 met 5 mM HEPES/pH 7,4, waarbij u de pH aanpast met HCl of NaOH.
  5. Gooi ongebruikte blootstellingsmedia weg in overeenstemming met de plaatselijke voorschriften.

4. Embryo's blootstellen aan de te testen chemicaliën

  1. Controleer de schalen met de 72 hpf oude embryo's op dode/niet uitgekomen embryo's en verwijder deze. Als een partij embryo's meer dan 5% niet-uitgekomen eieren bevat, verwijder dan de partij.
  2. Plaats 10 embryo's per weefselkweekschaaltje van 6 cm in 9 ml E3-medium (belichtingsplaat).
  3. Label blootstellingsplaten met de naam van de verbinding, de blootstellingsconcentratie en het duplicaatnummer. Bijvoorbeeld: "CdCl2 1 mg· L-1 01". Voeg indien nodig voldoende platen voor alleen E3 en een controleplaatje voor oplosmiddelen toe (zie rubriek 5).
  4. Voeg 1 ml blootstellingsoplossing toe aan elke plaat, te beginnen met de laagste concentratie, en draai de plaat. Vervang voor verbindingen met een lage oplosbaarheid de volledige 10 ml van de plaat door de blootstellingsoplossing (zie stap 3.2).
  5. Noteer de temporele volgorde waarin samengestelde oplossingen aan de embryo's zijn toegevoegd.
  6. Incubeer de platen in de bevochtigde kamer in een incubator bij 28,5 °C gedurende 48 uur tot ze 120 hpf bereiken.

5. Uitvoeren van de trillingsschriktest

OPMERKING: Analyseer de platen in dezelfde volgorde als vermeld in stap 4.5. Elke run moet een E3-bedieningsplaat bevatten.

  1. Schakel de computer en het trilapparaat in (blauw LED-lampje moet branden).
  2. Bereid het configuratiebestand voor in een spreadsheet, zoals te zien is in afbeelding 1D en bijgevoegd als aanvullend bestand 1. Noteer blootstellingsinformatie voor elk van de 5 plaatposities (compound, concentratie, dupliceren).
  3. Open het GUI-programma (General User Interface) (beschikbaar op https://git.scc.kit.edu/xk4962/vibration-startle-assay-kit , project-id 43215.)
  4. Controleer de camerabeweging door de verschillende posities in het GUI-programma te selecteren en de camerabeweging te observeren.
  5. Haal de af te meten monsterplaten uit de incubator. Plaats de monsterplaten op de 5 posities (zie figuur 1A, "luidsprekers") en laat de embryo's enkele minuten bezinken.
  6. Klik op Opnemen; Er wordt een venster geopend om het configuratiebestand te selecteren.
  7. Selecteer het juiste configuratiebestand dat in stap 5.2 is voorbereid voor deze uitvoering.
  8. Controleer of de beschrijving van het monster overeenkomt met de monsters op elke positie (1-5).
  9. De meting wordt automatisch uitgevoerd (10 s / positie). Wanneer de geluidspuls door het programma wordt toegepast, gaat er een LED branden. Registratie gedurende 10 s/positie maakt het mogelijk om voldoende gegevens te verzamelen om de zwemsnelheid en afgelegde afstand te schatten, zowel voor als na het toepassen van de stimulus en voorkomt gewenning aan volgende stimuli.
  10. Wanneer de opname is voltooid, gaat de camera terug naar positie 1 en begint de software de bestanden te comprimeren. Vervang gedurende deze tijd de monsters door de volgende set die moet worden gemeten.
  11. Ga naar stap 5.2. om de volgende run op te nemen.
  12. Wanneer alle platen zijn gemeten, verzamelt u de belichtingsoplossingen. Gebruik een zeef om de embryo's vast te houden.
  13. Euthanaseer de embryo's door ze snel af te koelen in een ijs/isopropanol (5%) bad.
  14. Gooi de blootstellingsoplossingen en dode embryo's weg in overeenstemming met de plaatselijke voorschriften.

6. Data-analyse

  1. Open de videogegevens met VirtualDub (1.10.4).
  2. Scoor visueel het aantal embryo's dat reageert op de geluidspuls (wanneer de controle-LED brandt).
  3. Voer gegevens in een spreadsheet in. Noteer de naam van de verbinding, de replicatie, de concentratie van de verbinding en het percentage onbeweeglijke embryo's volgens het sjabloon in aanvullend bestand 2, dat de voorbeeldgegevensset bevat die wordt weergegeven in figuur 2C.
    OPMERKING: Het sjabloon heeft een flexibele structuur en maakt het in principe mogelijk om gegevens van andere organismen en eindpunten toe te passen. Het beschrijft de responsen voor elke concentratie en bevat ook eindpuntbeschrijvingen en definities van de parameters die in de daaropvolgende concentratie-responsmodellering worden gegenereerd.
  4. Voer de benchmarkconcentratieanalyse (BMC) uit met behulp van een KNIME-workflow (KNIME analytics 4.626) met ingebedde R-scripts (R-versie 3.6., R-pakketten plotrix, drc en bmd 27,28).
    OPMERKING: In principe zou de beoordeling ook rechtstreeks in R kunnen worden uitgevoerd. Voor het gemak en om beoordeling als een webgebaseerde service mogelijk te maken, is de analyse echter georganiseerd in een KNIME-serverconforme workflow. De uitvoer van de KNIME-workflow is te vinden in Aanvullend Dossier 3. Voor meer informatie over de statistische parameters die door de KNIME-workflow worden gegenereerd, verwijzen wij u naar dit sjabloon. De statistische parameters om de geschiktheid te schatten en de drempels om bepaalde BMC-waarden te accepteren, worden weergegeven in tabel 1. De KNIME workflow zelf is beschikbaar via GitHub (https://github.com/precisiontox/range-finding-drc). De concentratie-respons wordt gemodelleerd met behulp van een log-logistisch model met 4 parameters. Twee van de parameters van de curve-aanpassing kunnen worden vastgezet. Normaal gesproken zou men het maximum op 100 stellen in het geval van procentuele gegevens. Indien er geen achtergrondeffecten worden waargenomen, kan het minimum worden vastgesteld op 0%.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 2A toont het percentage onbeweeglijke embryo's in 48 legsels van onbehandelde wildtype embryo's (AB2O2-stam). Gemiddeld reageert 14,33% van de onbehandelde wildtype embryo's niet op de trillingsprikkel. In 4 legsels bereikte het percentage onbeweeglijke larven 50%, maar 75% van de legsels had een percentage onbeweeglijke larven van minder dan 20%.

Figuur 2B,C toont een voorbeeld van een typische berekening van een benchmarkconcentratie/dosis (BMC/BMD29,30) voor samengestelde effecten op de beweeglijkheid met de workflow voor trillingsschriktest, zoals momenteel uitgevoerd binnen het PrecisionTox-consortium24. BMC10-, BMC25- en BMC50-waarden komen overeen met de concentraties waarbij respectievelijk 10%, 25% en 50% van de embryo's onbeweeglijkheidsniveaus vertonen die hoger zijn dan de achtergrond. Alleen embryo's die volledig onbeweeglijk zijn, worden in deze berekening meegenomen, niet embryo's die nog steeds gedeeltelijke responsen vertonen, zoals alleen een C-bocht zonder daaropvolgende ontsnappingszwem of alleen staartbewegingen (Figuur 2B). De embryo's werden blootgesteld aan 8 concentraties van de natriumkanaalremmer tricaïne methaansulfonaat, die vaak wordt gebruikt voor visanesthesie31. De gegevens wijzen op een achtergrondniveau van ongeveer 25% onbeweeglijkheid als reactie op de trillingsstimulus. Vanaf 1% tricaïne wordt de beweeglijkheid verminderd en stopt dan boven de 2,5%. De KNIME-workflow berekent de BMC50 als 164,9 μM, wat overeenkomt met 1,07% tricaïne en een onbeweeglijkheidsniveau van 75% (Figuur 2C). De kleine 95%-betrouwbaarheidsintervallen (aangegeven door de grijstinten in de curve) duiden op een robuuste reproduceerbaarheid van de beweeglijkheidswaarden in deze test.

Figuur 2D toont een voorbeeld van een suboptimale testrun, waarvan de gegevens niet mogen worden gebruikt voor BMC-berekeningen. Vijf met E3 behandelde controlegroepen met verschillende embryo's afkomstig van hetzelfde legsel worden getoond (AB2O2 [wild-type stam] repliceren 1-5). Alleen de eerste groep vertoont een bijna normale respons, met een onbeweeglijkheid van ongeveer 25% die consistent is met literatuurwaarden32 en die verkregen in de hier beschreven test, zoals weergegeven in figuur 2A, terwijl alle andere groepen verminderde en/of onvolledige gedragsreacties vertonen (bijv. alleen een C-bocht vertonen die niet wordt gevolgd door zwemactiviteit, of beweeglijkheid zonder een duidelijke C-bocht aan het begin). Een dergelijke reactie kan optreden wanneer embryo's zich niet goed ontwikkelen en zich in een onvolgroeide toestand bevinden als gevolg van een ontwikkelingsachterstand, wat van invloed is op de robuustheid van de schrikreactie14,33.

figure-results-1
Figuur 2: Voorbeeld van een typisch resultaat, met inbegrip van de berekening van de referentiedosis. (A) Percentage niet-reagerende embryo's na de geluidspuls voor onbehandelde larven van het wildtype voor 48 legsels (n = 10 per legsel). Het gemiddelde (14,33%) en de standaarddeviatie (±16,19%) zijn in rood aangegeven. (B) Evaluatie van het schrikreactiegedrag van embryo's (n=20 per aandoening) die werden behandeld met de aangegeven concentratie tricaïne in E3-medium of met alleen E3 als controle. Gedrag wordt geclassificeerd volgens het kleurenschema en de cartoons die rechts van de grafiek zijn aangegeven, waarbij elk embryo wordt toegewezen aan slechts een van de volgende klassen: "immotiel": embryo vertoont geen beweging; "staartbeweging": embryo vertoont staartbeweging, maar geen C-bocht of zwemgedrag; "beweeglijk": embryo vertoont zwembeweging, maar geen C-bocht als reactie op de trillingsprikkel; "Alleen C-bocht": embryo vertoont C-bocht, maar ontsnapt niet aan zwemmen; "C-bocht + beweeglijk": embryo vertoont typisch C-bocht gedrag gevolgd door ontsnappingszwemmen (de typische volledige schrikreactie). De verschillende gedragingen worden weergegeven als een percentage van het totale aantal embryo's voor elke behandeling. (C) BMC-berekeningsgrafiek gegenereerd door de KNIME-workflow, met vermelding van het percentage "onbeweeglijke" embryo's voor elke behandelingsconcentratie. Blauwe, rode en zwarte lijnen geven de BMC10-, BMC25- en BMC50-waarden aan, d.w.z. de concentraties waarbij respectievelijk 10%, 25% en 50% van de embryo's onbeweeglijkheidsniveaus vertonen die hoger zijn dan de achtergrond. (D) Voorbeeld van een afgedankte testrun. Vijf met E3 behandelde controleruns met verschillende AB2O2 wild-type embryo's afkomstig van hetzelfde legsel worden getoond (replicatie 1-5). Alleen replicatie 1 vertoont een bijna normale respons, terwijl embryo's van de resterende runs niet de typische C-bocht + ontsnappingszwemrespons vertonen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Statistische parameters om de geschiktheid te schatten en drempels om bepaalde BMC-waarden te accepteren. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Eigenschappen van een selectie van trillingstestsystemen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Excel-sjabloon voor configuratiebestand. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: KNIME-invoersjabloon met een voorbeeldgegevensset. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: Voorbeeld van een KNIME-uitvoerbestand. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren de workflow en data-analyse voor de evaluatie van chemische verbindingen met behulp van een op maat gemaakte zebravisembryo-vibratie-starttestopstelling. De workflow genereert robuuste gegevens die de berekening mogelijk maken van typische parameters die de toxiciteit van verbindingen specificeren, zoals benchmarkconcentratie/dosis (BMC/BMD). De modulariteit van de opstelling maakt aanpassing aan verschillende behoeften aan doorvoer en ruimtevereisten mogelijk. Omdat het systeem is gemaakt van goedkope basale componenten, biedt het na een relatief eenvoudige installatie een goedkoop alternatief voor bestaande commerciële systemen, die over het algemeen zijn ontworpen voor verschillende soorten tests tegelijk, afhankelijk zijn van propriëtaire software en relatief duur blijven.

Zowel deze commerciële systemen als andere op maat gemaakte systemen maken de beoordeling mogelijk van enkele embryo's of larven in platen met meerdere putjes (bijv. 12-well34, 16-well32,35, 24-well 20,33,36, 48-well 37, 96-well 38,39,40,41,42 en zelfs 384-well [als 4x96 well]43), maar de ruimtelijke beperking in de putten maakt de analyse van sommige gegevensparameters van de ontsnappingsreactie (bijv. afgelegde afstand) uitdagender. Bovendien is in sommige van deze opstellingen de beeldvorming beperkt tot een subset van de putjes van de plaat, waardoor de doorvoerwordt verminderd 36,39. Het in beeld brengen van embryo's in schaaltjes maakt een betere beoordeling van de parameters van de ontsnappingsrespons mogelijk en maakt het mogelijk om het gedrag van meerdere embryo's tegelijk vast te leggen (bijvoorbeeld tot 30 in een schaal van 6 cm). Gewoonlijk is beeldvorming op basis van schotels beperkt tot één schotel per run 44,45,46,47,48 (uitzonderingen voeren parallelle beeldvorming uit op 6 schalen met elk één larve49 of op 4 larven in 2 gesplitste schalen50), een nadeel dat kan worden opgelost door parallelle ontwerpen zoals in ons geval. We hebben enkele kenmerken van het systeem dat in deze studie wordt gebruikt en andere commerciële en op maat gemaakte oplossingen samengevat in tabel 2 20,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47,48,49,50,
Levering 51,52.

Een voordeel van de methode is een uitlezing die zowel dodelijkheid als gedragsveranderingen vastlegt, wat de prestaties van toxiciteitsbeoordelingen kan verhogen. Hoewel bijvoorbeeld is aangetoond dat de acute toxiciteitstest (FET)5 van het zebravisembryo de toxiciteit in de acute toxiciteitstest voor volwassen vissen53 vrij goed voorspelt, werd de nauwkeurigheid van de voorspelling verbeterd door gedragsuitlezingenop te nemen 54. De reden hiervoor is de zwakke sterfte die wordt veroorzaakt door neuroactieve stoffen die worden waargenomen in visembryo's, waarschijnlijk als gevolg van het ontbreken van het respiratoire falen syndroom dat verhoogde toxiciteit veroorzaakt bij jonge of volwassen vissen. Neuroactiviteit kan echter worden geïdentificeerd door beoordeling van gedrag. Bovendien kunnen gedragsuitlezingen ook myotoxische en ototoxische effecten vastleggen, evenals andere, subtielere toxische effecten op de fysiologie, die subletaal zijn maar toch de gedragsprestaties van het organisme beïnvloeden.

Bij het uitvoeren van de test is het van cruciaal belang om te zorgen voor een juiste behandeling van verbindingen en om een homogeen ontwikkelende partij zebravisembryo's te gebruiken. Het gebruik van glazen flacons voor de opslag van verbindingen zou dus de daling van de concentraties van chemicaliën, met name hydrofobe verbindingen, als gevolg van absorptie aan plastic materiaal tot een minimum moeten beperken. In het geval van verbindingen met een hoog absorptievermogen tot "plastic" polystyreen, kunnen ook glasplaten worden gebruikt voor de incubatie. Het reinigen van de eicellen in de weefselkweekschaaltjes die worden gebruikt voor het verzamelen en verwijderen van dode embryo's is een cruciale stap om de standaardontwikkeling te waarborgen. Normale ontwikkelingssnelheid is belangrijk, omdat ontwikkelingsachterstanden van invloed kunnen zijn op de volwassenheid van neurale netwerken die ten grondslag liggen aan het beoordeelde gedrag14,33. Om een vergelijking van samengestelde effecten mogelijk te maken, moeten eieren ook van dezelfde stam worden afgeleid, aangezien van verschillende stammen is gemeld dat ze verschillende gedragsprofielen vertonen 38,55,56,57. Tijdens de blootstelling is het belangrijk om de embryo's in een bevochtigde kamer te incuberen om overmatige verdamping van het E3-medium te voorkomen, waardoor de geteste concentraties zouden veranderen.

Bij elke run moeten E3-controles worden opgenomen om het basisresponsniveau te bepalen van de specifieke partij embryo's die in de testreeks wordt gebruikt. Normaal gesproken voeren we één plaat met bedieningselementen uit langs elke set van 5 metingen. Zoals geïllustreerd in figuur 2D, maakt deze aanpak het ook mogelijk om batches te detecteren met suboptimale responsen als gevolg van vertraagde ontwikkeling of om andere redenen, zoals genetische achtergrondeffecten. In het geval van een onverwacht gebrek aan respons op de stimulus, pas dan ook op voor mogelijke transducerstoringen. Doorgaans vertonen de schrikreacties een sigmoïdaal concentratie-responsgedrag dat het mogelijk maakt om curves aan te passen met behulp van een log-logistisch model. In zeldzame gevallen met bifasische responsen kan het echter nodig zijn andere modellen te gebruiken, zoals Gaussiaanse of Cedergreen-modellen. Ze zijn verkrijgbaar binnen de R-pakketten drc en bdm 27,28.

Het gebrek aan respons op de trillingsstimulus kan eenvoudigweg wijzen op de dood van de embryo's of ernstig verminderde levensfuncties als gevolg van algemene cytotoxiciteit, maar kan ook een weerspiegeling zijn van meer specifieke toxiciteit gericht op neurale circuits van stimulusperceptie, integratie en locomotorische output. Andere mogelijke samengestelde effecten zijn interferentie met de neuromusculaire interface of met de spierstructuur en -functie. Om onderscheid te maken tussen deze mogelijkheden zijn verdere analyses nodig. De structurele integriteit van de spieren kan bijvoorbeeld worden beoordeeld met een dubbele brekingstest58,59, en transgene lijnen zijn beschikbaar om de relevantie van de spier- en neurale functie te beoordelen60,61. De opgenomen videogegevens maken echter al een meer gedetailleerde analyse van de morfologie en de gedragsreactie van de embryo's mogelijk, wat de eerste aanvullende informatie kan opleveren. Is alleen de C-bocht aangetast, of alle beweeglijkheid? Zijn er nog restanten van neuromusculaire activiteit aanwezig, zoals blijkt uit zwakke of trillende staartbewegingen? Gaat dergelijk veranderd gedrag samen met veranderingen in de morfologie, zoals oedeem of verhoogde lichaamskromming? Bovendien kunnen parameters zoals latentietijd tot de C-bocht of de afgelegde afstand tijdens de ontsnappingsrespons worden geëvalueerd (zie bijvoorbeeld ref. 44).

Het hier beschreven screeningsprotocol maakt snelle en robuuste evaluaties van de toxiciteit van verbindingen mogelijk, met als toegevoegde waarde dat het specifiek niet-letale neurotoxische, ototoxische en myotoxische verbindingen detecteert. De meegeleverde analyseworkflow is eenvoudig te implementeren en biedt een robuuste uitlezing. Modificaties van de stimulusprotocollen die worden gebruikt in de trillingsschriktest zijn ook gebruikt om samengestelde effecten op complexere aspecten van schrikgedrag aan te pakken, zoals prepulsremming (PPI)39,44 en gewenning32,33, en kunnen worden aangepast aan de elektrodynamische transducer-gebaseerde stimulusopstelling die in deze studie wordt gebruikt.

Een belangrijke toepassing van screeningsystemen op basis van schrikreacties is de beoordeling van samengestelde effecten in chemische screenings, die van belang is voor zowel de evaluatie van de menselijke toxiciteit als de ontwikkeling van geneesmiddelen 1,4,62. Tegelijkertijd zijn de verkregen resultaten, door de vroege levensstadia van een waterorganisme te testen, rechtstreeks relevant voor de ecotoxicologische risicobeoordeling63,64. Bovendien kunnen schrikresponssystemen worden gebruikt voor gedragsfenotypering in genetische schermen 65,66,67,68,69. Ons eenvoudig implementeerbare en aanpasbare systeem biedt een betaalbare opstelling voor kleinere laboratoria die van plan zijn hun eigen specifieke screeningsprojecten in deze verschillende toepassingsdomeinen uit te voeren.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn dankbaar voor de uitstekende technische assistentie van het ondersteunend personeel van de IBCS-BIP-visfaciliteit en het zeefcentrum. Dit werk is gefinancierd door het onderzoeks- en innovatieprogramma Horizon 2020 van de Europese Unie in het kader van subsidieovereenkomst nr. 965406 (PrecisionTox). Deze output geeft alleen de mening van de auteurs weer, en de Europese Unie kan niet verantwoordelijk worden gehouden voor enig gebruik dat kan worden gemaakt van de informatie die erin is opgenomen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Fine test sieves, Brass frame, pore size 250 μmSigma-AldrichZ289744-1EAOf vergelijkbaar materiaal
High-speed cameraXIMEA MQ013MG-ON USB 3 
Laboratory Bottles, Narrow Neck, with Screw CapVWR215-3261Referentienr. voor 50 mL, beschikbaar tot 20 L. Of vergelijkbaar materiaal
Pipette tip, working volume: 10 µLSARSTEDT70.3010.210Of vergelijkbaar materiaal
Pipette tip, working volume: 1000 µLSARSTEDT70.3050.100Of vergelijkbaar materiaal
Pipette tip, working volume: 20 µLSARSTEDT70.3020.210Of vergelijkbaar materiaal
Pipette tip, working volume: 200 µLSARSTEDT70.3030.100Of vergelijkbaar materiaal
Serological pipette 10 mLSARSTEDT86.1254.001Of vergelijkbaar materiaal
Serological pipette 25 mLSARSTEDT86.1685.001Of vergelijkbaar materiaal
Serological pipette 5 mLSARSTEDT86.1253.001Of vergelijkbaar materiaal
Tissue culture dish 60,0 mm/15,0 mm vented (Polystyrene)Greiner bio-one628102Of vergelijkbaar materiaal
Tissue culture dish 100, suspension (Polystyrene)SARSTEDT83.3902.500Of vergelijkbaar materiaal
Transfer pipette 6 mLSARSTEDT86.1175Of vergelijkbaar materiaal
Tube 15 mL 120 mm x 17 mm PPSARSTEDT62.554.502Of vergelijkbaar materiaal
Tube 50 mL 114mm x 28 mm PPSARSTEDT62.5472.54Of vergelijkbaar materiaal

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as a mainstream model for in vivo systems pharmacology and toxicology. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 63, 43-64 (2023).
  2. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  3. Choi, T. Y., Choi, T. I., Lee, Y. R., Choe, S. K., Kim, C. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Exp Mol Med. 53 (3), 310-317 (2021).
  4. Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. Zebrafish disease models in drug discovery: from preclinical modelling to clinical trials. Nat Rev Drug Discov. 20 (8), 611-628 (2021).
  5. OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing, Paris. (2013).
  6. OECD. Test No. 250: EASZY assay - Detection of endocrine active substances, acting through estrogen receptors, using transgenic tg(cyp19a1b:GFP) zebrafish embryos. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing, Paris. (2021).
  7. Braunbeck, T., et al. The fish embryo test (FET): origin, applications, and future. Environ Sci Pollut Res Int. 22 (21), 16247-16261 (2015).
  8. Weger, B. D., Weger, M., Nusser, M., Brenner-Weiss, G., Dickmeis, T. A Chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling in an intact vertebrate. ACS Chem Biol. 7 (7), 1178-1183 (2012).
  9. Pandey, G., Westhoff, J. H., Schaefer, F., Gehrig, J. A Smart imaging workflow for organ-specific screening in a cystic kidney zebrafish disease model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1290(2019).
  10. Kokel, D., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nat Chem Biol. 6 (3), 231-237 (2010).
  11. Zhang, K., Liang, J., Brun, N. R., Zhao, Y., Werdich, A. A. Rapid zebrafish behavioral profiling assay accelerates the identification of environmental neurodevelopmental toxicants. Environ Sci Technol. 55 (3), 1919-1929 (2021).
  12. Ogungbemi, A. O., Teixido, E., Massei, R., Scholz, S., Kuster, E. Optimization of the spontaneous tail coiling test for fast assessment of neurotoxic effects in the zebrafish embryo using an automated workflow in KNIME(R). Neurotoxicol Teratol. 81, 106918(2020).
  13. Strahle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments--a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reprod Toxicol. 33 (2), 128-132 (2012).
  14. Kimmel, C. B., Patterson, J., Kimmel, R. O. The development and behavioral characteristics of the startle response in the zebra fish. Dev Psychobiol. 7 (1), 47-60 (1974).
  15. Eaton, R. C., Bombardieri, R. A., Meyer, D. L. The mauthner-initiated startle response in teleost fish. Journal of Experimental Biology. 66 (1), 65-81 (1977).
  16. Berg, E. M., Bjornfors, E. R., Pallucchi, I., Picton, L. D., El Manira, A. Principles governing locomotion in vertebrates: Lessons from zebrafish. Front Neural Circuits. 12, 73(2018).
  17. Lopez-Schier, H. Neuroplasticity in the acoustic startle reflex in larval zebrafish. Curr Opin Neurobiol. 54, 134-139 (2019).
  18. Hale, M. E., Katz, H. R., Peek, M. Y., Fremont, R. T. Neural circuits that drive startle behavior, with a focus on the Mauthner cells and spiral fiber neurons of fishes. J Neurogenet. 30 (2), 89-100 (2016).
  19. Behra, M., Etard, C., Cousin, X., Strahle, U. The use of zebrafish mutants to identify secondary target effects of acetylcholine esterase inhibitors. Toxicol Sci. 77 (2), 325-333 (2004).
  20. Buck, L. M., Winter, M. J., Redfern, W. S., Whitfield, T. T. Ototoxin-induced cellular damage in neuromasts disrupts lateral line function in larval zebrafish. Hear Res. 284 (1-2), 67-81 (2012).
  21. van Wijk, R. C., Krekels, E. H. J., Hankemeier, T., Spaink, H. P., vander Graaf, P. H. Systems pharmacology of hepatic metabolism in zebrafish larvae. Drug Discovery Today: Disease Models. 22, 27-34 (2016).
  22. Loerracher, A. K., Braunbeck, T. Cytochrome P450-dependent biotransformation capacities in embryonic, juvenile and adult stages of zebrafish (Danio rerio)-a state-of-the-art review. Arch Toxicol. 95 (7), 2299-2334 (2021).
  23. Marcato, D. Design and Development of Imaging Platforms for Phenotypic Characterization of Early Zebrafish. , Karlsruhe Institute of Technology. https://publikationen.bibliothek.kit.edu/1000085054 (2018).
  24. PrecisionTox Consortium. The precision toxicology initiative. Toxicol Lett. 383, 33-42 (2023).
  25. Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish - A Practical Approach. , Oxford University Press, Oxford. (2002).
  26. Preisach, C. hristine, Burkhardt, H. ans, Schmidt-Thieme, L. ars, Decker, R. einhold Data Analysis, Machine Learning and Applications. , Springer Berlin, Heidelberg. (2008).
  27. Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PLoS ONE. 10 (12), e0146021(2015).
  28. Jensen, S. M., Kluxen, F. M., Streibig, J. C., Cedergreen, N., Ritz, C. bmd: an R package for benchmark dose estimation. Peerj. 8, e10557(2020).
  29. Committee, E. S., et al. Guidance on the use of the benchmark dose approach in risk assessment. EFSA J. 20 (10), e07584(2022).
  30. Haber, L. T., et al. Benchmark dose (BMD) modeling: current practice, issues, and challenges. Crit Rev Toxicol. 48 (5), 387-415 (2018).
  31. Carter, K. M., Woodley, C. M., Brown, R. S. A review of tricaine methanesulfonate for anesthesia of fish. Reviews in Fish Biology and Fisheries. 21 (1), 51-59 (2011).
  32. Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15468-15473 (2011).
  33. Roberts, A. C., et al. Habituation of the C-start response in larval zebrafish exhibits several distinct phases and sensitivity to NMDA receptor blockade. PLoS One. 6 (12), e29132(2011).
  34. Marquez-Legorreta, E., et al. Brain-wide visual habituation networks in wild type and fmr1 zebrafish. Nat Commun. 13 (1), 895(2022).
  35. Panlilio, J. M., Aluru, N., Hahn, M. E. Developmental neurotoxicity of the harmful algal bloom toxin domoic acid: Cellular and molecular mechanisms underlying altered behavior in the zebrafish model. Environ Health Perspect. 128 (11), 117002(2020).
  36. Zeddies, D. G., Fay, R. R. Development of the acoustically evoked behavioral response in zebrafish to pure tones. J Exp Biol. 208 (Pt 7), 1363-1372 (2005).
  37. Levitz, J., et al. Optical control of metabotropic glutamate receptors. Nat Neurosci. 16 (4), 507-516 (2013).
  38. Best, J. D., et al. Non-associative learning in larval zebrafish. Neuropsychopharmacology. 33 (5), 1206-1215 (2008).
  39. Bhandiwad, A. A., Zeddies, D. G., Raible, D. W., Rubel, E. W., Sisneros, J. A. Auditory sensitivity of larval zebrafish (Danio rerio) measured using a behavioral prepulse inhibition assay. J Exp Biol. 216 (Pt 18), 3504-3513 (2013).
  40. Liu, F., et al. Solute carrier family 26 member a2 (slc26a2) regulates otic development and hair cell survival in zebrafish. PLoS One. 10 (9), e0136832(2015).
  41. Singh, C., Oikonomou, G., Prober, D. A. Norepinephrine is required to promote wakefulness and for hypocretin-induced arousal in zebrafish. Elife. 4, e07000(2015).
  42. Joo, W., Vivian, M. D., Graham, B. J., Soucy, E. R., Thyme, S. B. A customizable low-cost system for massively parallel zebrafish behavioral phenotyping. Front Behav Neurosci. 14, 606900(2020).
  43. Tucker Edmister, S., et al. Novel use of FDA-approved drugs identified by cluster analysis of behavioral profiles. Sci Rep. 12 (1), 6120(2022).
  44. Burgess, H. A., Granato, M. Sensorimotor gating in larval zebrafish. J Neurosci. 27 (18), 4984-4994 (2007).
  45. Marsden, K. C., Granato, M. In Vivo Ca(2+) Imaging Reveals that Decreased Dendritic Excitability Drives Startle Habituation. Cell Rep. 13 (9), 1733-1740 (2015).
  46. Chatterjee, P., et al. Otoferlin deficiency in zebrafish results in defects in balance and hearing: rescue of the balance and hearing phenotype with full-length and truncated forms of mouse otoferlin. Mol Cell Biol. 35 (6), 1043-1054 (2015).
  47. Wang, C., et al. Evaluation of the hair cell regeneration in zebrafish larvae by measuring and quantifying the startle responses. Neural Plast. 2017, 8283075(2017).
  48. Xu, L., Guan, N. N., Huang, C. X., Hua, Y., Song, J. A neuronal circuit that generates the temporal motor sequence for the defensive response in zebrafish larvae. Curr Biol. 31 (15), 3343-3357.e4 (2021).
  49. Hecker, A., Schulze, W., Oster, J., Richter, D. O., Schuster, S. Removing a single neuron in a vertebrate brain forever abolishes an essential behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (6), 3254-3260 (2020).
  50. Weber, D. N. Dose-dependent effects of developmental mercury exposure on C-start escape responses of larval zebrafish Danio rerio. Journal of Fish Biology. 69 (1), 75-94 (2006).
  51. Santistevan, N. J., et al. cacna2d3, a voltage-gated calcium channel subunit, functions in vertebrate habituation learning and the startle sensitivity threshold. PLoS One. 17 (7), e0270903(2022).
  52. Thyme, S. B., et al. Phenotypic landscape of schizophrenia-associated genes defines candidates and their shared functions. Cell. 177 (2), 478-491.e20 (2019).
  53. OECD. Test No. 203: Fish, Acute Toxicity Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing. Paris. (2019).
  54. Kluver, N., et al. Fish embryo toxicity test: identification of compounds with weak toxicity and analysis of behavioral effects to improve prediction of acute toxicity for neurotoxic compounds. Environ Sci Technol. 49 (11), 7002-7011 (2015).
  55. Monroe, J. D., et al. Hearing sensitivity differs between zebrafish lines used in auditory research. Hear Res. 341, 220-231 (2016).
  56. van den Bos, R., et al. Further characterisation of differences between TL and AB zebrafish (Danio rerio): Gene expression, physiology and behaviour at day 5 of the larval stage. PLoS One. 12 (4), e0175420(2017).
  57. van den Bos, R., et al. Early life exposure to cortisol in zebrafish (Danio rerio): similarities and differences in behaviour and physiology between larvae of the AB and TL strains. Behavl Pharmacol. 30 (2-3), 260-271 (2019).
  58. Felsenfeld, A. L., Walker, C., Westerfield, M., Kimmel, C., Streisinger, G. Mutations affecting skeletal-muscle myofibril structure in the zebrafish. Development. 108 (3), 443-459 (1990).
  59. Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochem Biophys Res Commun. 423 (4), 785-788 (2012).
  60. Shahid, M., et al. Zebrafish biosensor for toxicant induced muscle hyperactivity. Sci Rep. 6, 23768(2016).
  61. Winter, M. J., et al. Functional brain imaging in larval zebrafish for characterising the effects of seizurogenic compounds acting via a range of pharmacological mechanisms. Br J Pharmacol. 178 (13), 2671-2689 (2021).
  62. Vorhees, C. V., Williams, M. T., Hawkey, A. B., Levin, E. D. Translating neurobehavioral toxicity across species from zebrafish to rats to humans: Implications for risk assessment. Front Toxicol. 3, 629229(2021).
  63. Scholz, S., et al. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment--applications beyond acute toxicity testing. Environ Sci Pollut Res Int. 15 (5), 394-404 (2008).
  64. Dutra Costa, B. P., Aquino Moura, L., Gomes Pinto, S. A., Lima-Maximino, M., Maximino, C. Zebrafish models in neural and behavioral toxicology across the life stages. Fishes. 5 (3), 23(2020).
  65. Wolman, M. A., et al. A genome-wide screen identifies PAPP-AA-mediated IGFR signaling as a novel regulator of habituation learning. Neuron. 85 (6), 1200-1211 (2015).
  66. Marsden, K. C., et al. A Cyfip2-dependent excitatory interneuron pathway establishes the innate startle threshold. Cell Rep. 23 (3), 878-887 (2018).
  67. Jain, R. A., et al. A forward genetic screen in zebrafish identifies the g-protein-coupled receptor CaSR as a modulator of sensorimotor decision making. Curr Biol. 28 (9), 1357-1369.e5 (2018).
  68. Nelson, J. C., et al. Acute regulation of habituation learning via posttranslational palmitoylation. Curr Biol. 30 (14), 2729-2738.e4 (2020).
  69. Meserve, J. H., et al. A forward genetic screen identifies Dolk as a regulator of startle magnitude through the potassium channel subunit Kv1.1. PLoS Genet. 17 (6), e1008943(2021).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Zebravisembryo stoxiciteitsscreeningneuromusculaire toxiciteitblootstelling aan chemicali nhigh throughputscreeningbenchmarkconcentratiegedragsassaydosis responscurvedata analyse

Gerelateerde artikelen