Methodenartikel

Extractie en detectie van geosmin en 2-methylisoborneol in water en vis met behulp van soppenextractiesondes met hoge capaciteit en GC-MS

2.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67280

⸱

3 juli 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Aquaculture Research Institute, University of Maine, 2Markes International Ltd, 3Markes International GmbH, 4USDA-ARS-National Cold Water Marine Aquaculture Center

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol presenteert een volledig geautomatiseerde workflow voor de extractie van geosmin en 2-methylisoborneol uit water en lipidenrijke visweefsels. De methode maakt het mogelijk om deze moleculen vroegtijdig op te sporen voordat ze geurdrempels bereiken. Er worden representatieve gegevens van een aquacultuuromgeving verstrekt.

Samenvatting

Geosmin en 2-methylisoborneol zijn vluchtige organische stoffen van microbiële oorsprong die vaak voorkomen in recirculerende aquacultuursystemen en onaangename geuren en smaken geven aan vissen daarin, zelfs bij extreem lage concentraties. Bestaande analytische methoden voor deze verbindingen in vis hebben moeite om voldoende monsterdoorvoer te bereiken en zijn vaak niet geautomatiseerd, waardoor een uitgebreide hands-on voorbereiding vereist is. We hebben methoden ontwikkeld voor het analyseren van geosmin en 2-methylisoborneol uit respectievelijk water en visweefsels met behulp van een metalen sonde met een sorptie-extractiefase met hoge capaciteit. Een robuuste en kwantitatieve detectie werd bereikt van zowel water- als visweefsel, met minimale detectielimieten van 1,2 ng/L voor geosmin en 1,1 ng/L voor respectievelijk 2-methylisoborneol uit water en 18,1 ng/kg en 13,6 ng/kg uit visweefsel. Deze concentraties lagen ruim onder de detectiedrempels voor mensen. Daarom concludeerden we dat deze methoden geosmin en 2-methylisoborneol konden detecteren voordat ze waarneembaar werden voor mensen. In tegenstelling tot andere sorptie-extractietechnieken met hoge capaciteit, zoals sorptie-extractie met roerstaafjes, is deze techniek volledig geautomatiseerd, waardoor de doorvoer drastisch wordt verbeterd en handmatige hanteringsfouten worden voorkomen, terwijl het duurzame ontwerp van de sonde breuk voorkomt, zoals gebruikelijk is bij vastefase-micro-extractie (SPME) -vezel. Deze methode is geschikt voor het monitoren van geurstoffen in alle waterkwaliteitsomgevingen, evenals voor de detectie van onaangename verbindingen in vaste en halfvaste matrices.

Inleiding

Geosmin (GSM) en 2-methylisoborneol (MIB) komen van nature voor in water en bodems als bijproducten van het microbiële metabolisme 1,2. Hoewel ze over het algemeen niet gevaarlijk zijn voor het milieu of de menselijke gezondheid, geven ze onaangename 'aardse' en 'modderige' geuren en smaken aan water, die zelfs bij extreem lage concentraties waarneembaar zijn, zo laag als 10 en 20 ng/L voor respectievelijk GSM en MIB 3,4. Als zodanig vermindert de aanwezigheid van deze geurstoffen de waargenomen kwaliteit van water en is het in de meeste contexten hoogst ongewenst. In de binnenwateren verminderen geurstoffen de aantrekkingskracht op bezoekers en kunnen ze klachten uitlokken bij milieuautoriteiten5, terwijl geurstoffen in drinkwater een onaangename geur en smaak afgeven die consumenten onaanvaardbaar vinden6. Veel landen hebben inderdaad wettelijke limieten opgelegd voor geurstoffen in drinkwater, waarbij China 10 ng/L heeft bepaald als de maximaal toegestane GSM-concentratie7.

Recirculerende aquacultuursystemen (RAS's) worden steeds belangrijker in de aquacultuursector als middel voor de visproductie. Deze systemen werken op het land en hergebruiken continu water, waardoor de impact op het milieu wordt verminderd, maar uitgebreide filtering van RAS-water is vereist om optimale omstandigheden voor het kweken van vissen te behouden. Biofilters met bewegend bed worden gekoloniseerd door microben vanwege de overvloed aan voedingsstoffen in visuitwerpselen en niet opgegeten voer8. Deze microben zijn gunstig voor de verwijdering van stikstofhoudend afval en overtollige voedingsstoffen; sommige soorten kunnen echter GSM, MIB en andere geurstoffen produceren4. Deze geurstoffen lekken vervolgens uit in het water en worden opgenomen in het vlees van de vis, waar ze onaangename geur- en smaakkenmerken kunnen geven die consumenten verwerpelijk vinden. De drempelwaarden voor geur in visvlees zijn soortafhankelijk, maar de waarden voor Atlantische zalm, een veel voorkomende soort in RAS's, zijn 44 - 500 ng/kg voor GSM en >900 ng/kg voor MIB4. Daarom moeten RAS-operators regelmatig de GSM- en MIB-concentraties in hun systemen controleren om ervoor te zorgen dat deze geen problematische niveaus4 bereiken. Aangetaste vissen kunnen vóór de oogst worden ontdaan van stoffen met een onaangename smaak om de kwaliteit van de filet te herstellen; Dit is echter een duur proces waarbij de faciliteit de recirculatie van water moet stoppen en in plaats daarvan gedurende 10-14dagen 9 nieuw water door het systeem moet laten stromen. Aangezien GSM en MIB een hardnekkig en economisch kostbaar probleem vormen in een breed scala van industrieën, is het zinvol om de analytische methoden voor detectie opnieuw te beoordelen en te verbeteren. Idealiter zouden RAS-operators in staat moeten zijn om zowel RAS-water te monitoren om toenemende GSM- en MIB-concentraties te identificeren voordat ze problematisch worden, als visweefsels om te bepalen of en in welke mate GSM- en MIB-niveaus de productkwaliteit hebben beïnvloed.

De meeste methoden voor de detectie van GSM en MIB maken gebruik van gaschromatografie (GC) met een massaspectrometer (MS) of vlamionisatiedetector (FID) voor scheiding en detectie, maar de manier waarop geurstoffen in eerste instantie uit de watermatrix worden geëxtraheerd, varieert sterk, met veel gepubliceerde methoden10. Dat zo'n verscheidenheid aan methoden is uitgeprobeerd en inderdaad nog steeds routinematig wordt gebruikt, zegt dat elk aanzienlijke nadelen heeft. Deze nadelen omvatten een vereiste voor een grote monsteromvang en grote hoeveelheden oplosmiddel zoals bij vloeistof-vloeistofextractie (LLE), lage gevoeligheid en waterinterferentie zoals bij methoden op basis van headspace, of uitgebreide problemen met carryover en systeemverontreiniging zoals bij purge- en condensatie (P en T).

Sorptie-extractie omvat een reeks extractietechnieken waarbij een vaste sorptiefase kan worden gebruikt om geurstoffen uit de headspace boven een monster of uit het monster zelf te extraheren via directe onderdompeling10. Deze technieken zijn compatibel met kleinere monstervolumes dan andere technieken, vereisen geen oplosmiddelen en worden doorgaans niet ernstig beïnvloed door waterinterferentie. De meest voorkomende vorm van sorptie-extractie, vaste-fase micro-extractie (SPME), gebruikt echter slechts een klein volume sorptiefase met een lage capaciteit voor analyten, wat de extractie-efficiëntie beperkt. Bovendien kunnen de betrokken broze vezels beschadigd of gebroken raken11, waardoor workflows worden onderbroken. Roerstaaf-sorptie-extractie (SBSE) overwint deze moeilijkheden met een groter fasevolume en een duurzamer ontwerp, maar is niet gemakkelijk te automatiseren, waardoor handmatige overdracht van roerstaven naar monsters en van monsters naar thermische desorptiebuizen12 nodig is. In de context van routinematige waterscreening, waar een hoge doorvoer cruciaal is, vormt dit gebrek aan automatisering een belangrijke barrière.

Het doel van onze methode is om de bovengenoemde methoden te verbeteren met betrekking tot de doorvoer van monsters en de totale sorptie-extractiecapaciteit. Daarom hebben we een techniek ontwikkeld die gebruik maakt van high-capacity sorptive extraction (HCSE) sondes, waarbij de hoge analytcapaciteit en robuustheid van SBSE worden gecombineerd met de faseselectie en automatisering van SPME voor de kwantitatieve, high-throughput analyse van GSM en MIB. Met enkele aanpassingen kan de techniek zowel op watermonsters als op monsters van gehomogeniseerd visweefsel worden toegepast. Hier beschrijven we het protocol volledig en presenteren we validatiegegevens die aantonen dat het reproduceerbaar, lineair en zeer gevoelig is. Hoewel aquacultuurmonsters hier worden gebruikt voor demonstratiedoeleinden, is het protocol geschikt voor het monitoren van geurstoffen in een breed scala aan monstersoorten, waaronder water, bodem en verschillende voedingsmiddelen. Dankzij de volledige automatisering is het protocol vooral gunstig wanneer het aantal monsters naar verwachting hoog zal zijn.

Protocol

De vismonsters werden verzameld van dieren die al voor menselijke consumptie werden geslacht. Daarom was er geen ethische goedkeuring vereist.

1. Voorbereiding van kalibratie en interne standaarden

  1. Kalibratie standaard voorbereiding
    1. Bereid stockoplossing C1 voor door 10 μl geosmin en 2-methylisoborneoloplossing (100 μg/ml) toe te voegen aan een maatkolf van 100 ml en tot volume te vullen met methanol van LC-MS-kwaliteit. De resulterende oplossing bevat elke analyt in een dosis van 10 μg/l (ppb).
    2. Bereid kalibratiestandaarden voor door de C1-stockoplossing in het in tabel 1 aangegeven volume toe te voegen aan een maatkolf van 100 ml en tot volume te vullen met gedeïoniseerd water.
    3. Maak dagelijks nieuwe kalibratiestandaarden, want deze zijn uiterst bederfelijk.
      LET OP: Het is belangrijk om deze voorraadoplossingen elke dag vers te bereiden.
  2. Interne standaard voorbereiding
    1. Bereid stockoplossing (I1) door 10 mg 2-isopropyl-3-methoxypyrazine (IPMP) (>98% zuiver) toe te voegen aan een maatkolf van 1 l die tot volume is gevuld met methanol van LC-MS-kwaliteit, zodat er een bouillon van 10 mg/l ontstaat.
    2. Pipetteer 100 μl oplossing I1 in een maatkolf van 100 ml en vul deze tot volume met gedeïoniseerd water tot oplossing I2 (10 μg/l). Spuit 50 μL in elk monsterflesje om een uiteindelijke concentratie van 100 ng/L te bereiken.

2. Wateranalyse

  1. Voorbereiding van het monster
    1. Plaats een injectieflacon van 20 ml voor elk watermonster dat wordt geanalyseerd in de monstertray.
    2. Weeg met behulp van een gekalibreerde weegschaal af en plaats 2.5 g NaCl in elke flacon met krimpmonster aan de bovenkant van 20 ml.
      OPMERKING: Het toevoegen van zout verbetert de overdracht van de MIB en geosmin van het water naar de hoofdruimte.
    3. Voeg met behulp van een pipet of dispenser voor de dop 5 ml van het monsterwater toe aan elke flacon met krimpdop van 20 ml.
    4. Pipetteer 50 μl van de interne standaardoplossing I2 op elk monster, elke kalibratiestandaard en alle QA/QC-monsters, inclusief blanco's.
    5. Plaats de dop op de injectieflacon en sluit deze af met een krimptang voor de injectieflacon om verlies van de analyt te minimaliseren.
    6. Verwerk slechts 1-2 monsters tegelijk en sluit elke injectieflacon snel af zodra deze is voltooid om het verlies van vluchtige analyten door de analyt te minimaliseren.
  2. Analytextractie (water)
    1. Plaats het monsterbakje op de autosampler bakjehouder.
    2. Om een instrumentmethode voor te bereiden, opent u het instrumentprogramma en klikt u op de Methode-editor.
      1. Maak een nieuwe methode door de volgende parameters in te voeren in de methode-editor (laat andere parameters op hun standaardwaarden staan):
      2. Stel bij 'Voorbemonstering' de roertijd van de injectieflacon in op 10 minuten om de analyten de kans te geven zich van het water naar de hoofdruimte te verdelen.
      3. Stel bij 'Bemonstering' de incubatietemperatuur in op 65 °C, de incubatietijd op 30 minuten en de roersnelheid op 400 tpm.
      4. Zorg ervoor dat 'wash HiSorb sonde' is ingeschakeld; Anders kan de restmonstermatrix het systeem verontreinigen.
      5. Stel bij 'Sondedesorptie' de desorptietijd in op 15 minuten en deD-sorptietemperatuur op 270 °C.
      6. Stel in de Trap-instellingen de lage temperatuur van de Trap in op 25 °C en de 'split flow' op 8 ml/min.
    3. Voer de autosampler-methode uit in combinatie met de GC-MS-methode door op de Start-knop op elk van de respectieve programma's te drukken.

3. Analyse van visweefsel

  1. Voorbereiding van het monster
    1. Plaats een injectieflacon van 20 ml voor elk te analyseren vismonster in de monstertray.
    2. Homogeniseer het visweefsel met behulp van een in de handel verkrijgbare keukenmachine.
    3. Weeg met behulp van een gekalibreerde weegschaal 1,00 g gehomogeniseerd visweefsel af in elke injectieflacon.
    4. Pipetteer 5 ml verzadigde NaCl-oplossing in elke injectieflacon.
    5. Pipetteer 100 μL van de interne standaardoplossing I2 op elk monster, kalibratiemonster en eventuele QA/QC-monsters.
    6. Plaats een dop op de injectieflacon en sluit deze af met de flacon krimptang.
    7. Bereid slechts 1-2 monsters tegelijk voor om het verlies van semi-vluchtige en vluchtige stoffen te verminderen.
  2. Analytextractie (vis)
    1. Plaats het monsterbakje op de autosampler bakjehouder.
    2. Bereid een instrumentmethode als volgt voor (laat andere parameters op hun standaardwaarden staan).
      OPMERKING: de roertijd van de injectieflacon vóór de bemonstering en de incubatietemperatuur verschillen van die van paragraaf 2.2.2.
      1. Stel in 'Voorbemonstering' de roertijd van de injectieflacon in op 20 min.
      2. Stel bij 'Bemonstering' de incubatietemperatuur in op 80 °C, de incubatietijd op 30 minuten en de roersnelheid op 400 tpm.
      3. Zorg ervoor dat 'HiSorb-sonde wassen' is ingeschakeld, anders kan de restmonstermatrix het systeem verontreinigen.
      4. Stel bij 'Sondesorptie' de desorptietijd in op 15 minuten en de desorptietemperatuur op 270 °C.
      5. Stel in de sifon de lage temperatuur van de condenspot in op 25 °C en de gesplitste stroom op 8 ml/min.
        OPMERKING: Een langere, hetere pre-bemonsteringsstap is hier vereist vanwege de hogere affiniteit van MIB en GSM voor lipiderijke visweefsels versus water.
    3. Voer de autosampler-methode uit in combinatie met de GC-MS-methode door op de Start-knop op elk van de respectieve programma's te drukken.

4. Scheiding en detectie met behulp van GC-MS

  1. Gebruik dezelfde GC-MS-parameters voor water- en visweefselmethoden.
  2. Zorg ervoor dat de GC is uitgerust met een kolom van 5MS, 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm en wordt geleverd met ultrazuiver heliumdraaggas. Stel het draagdebiet in op 2 ml/min.
  3. Bereid als volgt een GC-ovenprogramma voor: Een begintemperatuur van 60 °C, 3 minuten aangehouden, vervolgens een temperatuurstijging van 10 °C/min tot 100 °C, vervolgens 20 °C/min tot 190 °C, vervolgens 30 °C/min tot 280 °C, met een uiteindelijke wachttijd van 2 min. De totale speelduur is ingesteld op 16,5 min.
  4. Stel de overdrachtslijn tussen GC en MS in op 280 °C en de ionenbron en de quadrupel op respectievelijk 250 °C en 200 °C.
  5. Gebruik voor MS-detectie in scanmodus een scanbereik van m/z 50-350.
  6. Gebruik voor geselecteerde ionenbewaking (SIM) kwantificerings- en bevestigingsionen van respectievelijk m/z 95 en 107 voor MIB, m/z 137 en 152 voor IPMP en m/z 112 en 55 voor GSM.
    OPMERKING: Veel chromatografiesoftwarepakketten bevatten automatische piekselectie, maar het wordt ten zeerste aanbevolen om de piekselectie handmatig op fouten te controleren.

Resultaten

Methode optimalisatie

Er zijn verschillende experimenten uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de methode wordt geoptimaliseerd, waaronder een carry-over-beoordeling, optimalisatie van de sondesorptietijd, een interne standaardbeoordeling, een beoordeling van de sondefase, een beoordeling van lineariteit en herhaalbaarheid, en berekening van de methodedetectielimiet.

Beoordeling van de overdracht

We begonnen ons experiment met een sondesorptietemperatuur van 250 °C. Er werden kalibratiestandaarden opgesteld, zoals weergegeven in tabel 1. Om de carry-over te beoordelen, analyseerden we GSM- en MIB-standaarden bij 20 ng/L en gingen we vervolgens, in volgorde, verder met een run van de GC-MS-parameters zonder iets in de kolom te injecteren (kolom leeg), een desorptie van de focussvacuüm zonder iets van de injector over te brengen (trap blank), een verwarming van de injector zonder een sonde in te brengen (injector blanco), en een desorptie van de sonde zonder voorafgaande bemonstering (sonde blanco). Minder dan 1% overdracht werd waargenomen in de kolom blanco, trap blanco en injector blanco, maar in de sonde blanco was de overdracht respectievelijk 9,35% en 3,77% voor GSM en MIB (Tabel 2). Daarom hebben we vastgesteld dat er onder de gebruikte omstandigheden een significante overdracht van GSM op de PDMS-sonde was.

Optimalisatie van de desorptietijd

Nadat we overdracht op de PDMS-sonde hadden vastgesteld, probeerden we dit op te lossen door de desorptietemperatuur van de sonde aan te passen. Verwacht wordt dat een hogere desorptietemperatuur van de sonde de desorptiesnelheid van de sonde zal verhogen, zodat de desorptie aan het einde van de sondesorptietijd van 15 minuten vollediger zou zijn. Een hogere temperatuur kan echter ook de afbraak van de analyt bevorderen en daarom de gevoeligheid negatief beïnvloeden. Hogere temperaturen kunnen ook sorptiematerialen beschadigen, dus temperaturen boven de 280 °C moeten worden vermeden. De overdracht van GSM was significant bij de desorptietemperatuur van de sonde van 250 °C, maar dit daalde aanzienlijk tot ver onder de aanvaardbaarheidsdrempel van 5% wanneer in plaats daarvan 270 °C werd gebruikt (Figuur 1). Deze verbetering werd bereikt zonder verlies van gevoeligheid, waarbij de piekgebieden die voor de eerste analyse werden geproduceerd bij 270 °C niet kleiner waren dan voor lagere sondesorptietemperaturen (figuur 1). Dit geeft aan dat elke toename van de afbraak van analyten te verwaarlozen is.

Gebruik van interne standaard

De verbinding 2-isopropyl-3-methoxypyrozine is op grote schaal gebruikt als interne standaard tijdens de detectie van GSM en MIB13. We vergeleken de berekende concentraties van GSM en MIB met de bekende piekende concentraties, zowel met als zonder interne standaardcorrectie. Het herstel zonder interne standaardcorrectie was slecht, met berekende concentraties in 60% van de bekende piekconcentraties (Figuur 2). Daarentegen was het herstel bij de toegepaste interne standaardcorrectie zeer goed, in de buurt van 100%. Daarom hebben we interne standaardcorrectie toegepast in alle toekomstige analyses.

Fase selectie

In SPME-analyses worden vaak carbon wide range (CWR) en/of divinylbenzeen (DVB) aan PDMS toegevoegd om de gevoeligheid te verbeteren, maar dit verhoogt de kosten. We hebben geprobeerd om sondes met alleen PDMS te vergelijken met driefasige (DVB/CWR/PDMS) sondes, aangezien het verhoogde fasevolume van de sonde waarschijnlijk de gevoeligheid verbetert ten opzichte van SPME-vezels. Herstelgegevens voor PDMS en driefasensondes (Figuur 3) illustreren in grote lijnen vergelijkbare prestaties tussen de twee sondetypen, met herstel iets dichter bij 100% met de PDMS-sondes. Gezien de iets betere prestaties en de lagere kosten hebben we dus alle toekomstige analyses met PDMS-sondes uitgevoerd. Opgemerkt moet worden dat, aangezien de sonde analyten verzamelt uit de headspace en niet via direct contact met de monstermatrix, de kinetiek van GSM / MIB-verdeling naar het fasemateriaal niet mag verschillen tussen water- en vismonsters.

Methode validatie

Een kalibratiereeks met zes concentraties van analyten in water van 1 tot 100 ng/L werd geanalyseerd (Figuur 4). Er werd een uitstekende lineariteit bereikt, met r2 van 0,9999 voor GSM en 0,9999 voor MIB. De standaardregressiefout was respectievelijk 0,43 en 0,37 voor GSM en MIB. Dit geeft aan dat de methode geschikt is voor kwantitatieve analyses over het beoordeelde bereik. We hebben de herhaalbaarheid bepaald aan de hand van acht replicaten van laboratoriumstandaarden die GSM en MIB bevatten bij 40 ng/L in water. RSD-waarden waren 6,3% voor GSM en 4,8% voor MIB, wat een opmerkelijke reproduceerbaarheid van de resultaten aantoont. Deze replicaten werden geanalyseerd in drie afzonderlijke batches op verschillende dagen, wat de precisie van de methode verder aantoont. Daarom is HCSE met GC-MS-analyse een kwantitatieve en betrouwbare methode.

Minimale detectielimieten (MDL)

De MDL werd berekend volgens het Amerikaanse EPA-protocol14 met behulp van verrijkt water (n=10) of puntige vismonsters (n=11). De methode voor extractie en detectie van GSM en MIB in water produceerde detectielimieten van 1,2 ng/L voor GSM en 1,1 ng/L voor MIB. Deze MDL's lagen ver onder de drempelwaarden voor menselijke geur van respectievelijk ongeveer 10 en 20 ng/L. De voorgestelde methode kan dus met vertrouwen en kwantitatief de accumulatie van deze geurmoleculen detecteren voordat ze menselijke sensorische drempels bereiken. Detectielimieten voor de extractie en detectie van GSM en MIB uit in vis geproduceerde limieten van 18,1 ng/kg voor GSM en 13,6 ng/kg voor MIB.

Analyse van watermonsters uit de aquacultuur

We analyseerden watermonsters uit zeven recirculerende aquacultuursystemen, waarbij voor elk vijf replicaten (systeem 3) of drie replicaten (alle andere systemen) werden beoordeeld. Op één na bevatten alle geanalyseerde recirculerende aquacultuursystemen geosmin en MIB in concentraties boven onze MDL (Figuur 5), wat wijst op een mogelijk probleem met de waterkwaliteit. We merkten echter op dat MIB in alle gevallen ruim onder de menselijke geurdrempel van 20 ng/L lag, terwijl slechts één systeem de GSM-geurdrempel van 10 ng/L overschreed (systeem 1, GSM-concentratie = 12,69 ng/L). Hoewel we GSM en MIB in systeem 3 hebben gedetecteerd, merken we op dat de concentratie voor MIB onder onze berekende MDL's valt, en daarom kan de concentratie niet met zekerheid worden gekwantificeerd. De methode toonde een indrukwekkende precisie in alle systemen, ondanks het gebruik van real-world watermonsters met zeer weinig variatie in berekende concentratie tussen gerepliceerde monsters in elk systeem (Figuur 5).

Analyse van visweefsels

Visweefsel, rijk aan lipiden, geeft een sterk matrixeffect dat de extractie van GSM en MIB tijdens deze methode belemmert. Om die reden worden er subtiele wijzigingen aangebracht in de methode om de extractie-efficiëntie te verhogen, waaronder een hogere incubatietemperatuur (80 °C) en een langere incubatietijd (20 min) in vergelijking met de waterextractiemethode. Visweefsels werden eerder geanalyseerd om de achtergrondconcentraties GSM en MIB te bepalen. Diezelfde monsters werden vervolgens verrijkt met een bekende hoeveelheid GSM en MIB en in drievoud geanalyseerd om het herstelpercentage en de precisie te bepalen (Figuur 6).

figure-results-1
Figuur 1: Effect van de sondesorptietemperatuur op de overdracht. (A) Een laboratoriumstandaard met GSM en MIB van 20 ng/L werd geanalyseerd bij een van de drie sondesordinatietemperaturen in drievoud, met gemiddelde piekgebieden. Elke sonde werd vervolgens nog twee keer gedesorbeerd bij de begintemperatuur om de overdracht te beoordelen met resultaten in (B) (GSM) en (C) (MIB). Overdracht wordt uitgedrukt als piekgebied als percentage van het initiële piekgebied. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie over drie replica's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2 :Intern standaardgebruik. Vergelijking van gecorrigeerde versus niet-gecorrigeerde gegevensherstelgegevens voor analytische standaarden bij 15 of 40 ng/L, met extractie door alleen PDMS-sondes. Monsterconcentraties werden gecorrigeerd met behulp van IPMP als interne standaard. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

figure-results-3
Figuur 3: Analyt herstel. Herstelgegevens voor analytische standaarden van GSM (links) en MIB (rechts) bij 15 ng/L, met extractie door PDMS-only of driefasige (PDMS, DVB, CWR) sondes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Analytische kalibratiecurves. Lineaire regressies van kalibratiecurven voor GSM (ononderbroken lijn, r2 van 0,9999; S=0,37) en MIB (stippellijn, r2 van 0,9999; S=0,37). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5 — Toepassing van aquacultuurwater Concentraties van (A) GSM en (B) MIB in watermonsters genomen van zeven aquacultuursystemen (nr. ≥ 3 voor elk systeem). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

figure-results-6
Figuur 6 : Toepassing van visweefsel. Concentraties van GSM en MIB van twee vismonsters piekten met GSM en MIB (F1 en F2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naam van de oplossingVoorraad C1 volume toegevoegdTotaal volumeResulterende concentratie
Voorraad C110ul100ml10 μg/ml
Cal 110 ulInhoud: 100 ml1 ng/L
Cal 220 ulInhoud: 100 ml2ng/L
Calorieën 550 ulInhoud: 100 ml5 ng/L
Calorieën 10100 ulInhoud: 100 ml10 ng/L
Calorieën 20200 ulInhoud: 100 ml20 ng/L
Calorieën 50500 ulInhoud: 100 ml50 ng/L
Calorieën 1001000 ulInhoud: 100 ml100 ng/L
Calorieën 2002000 ul100ml200 ng/L

Tabel 1: Kalibratiestandaarden. Geosmin- en 2-MIB-standaarden zijn allemaal gemaakt van CRM47525 geosmin- en 2-methylisoborneoloplossing (100 μg/ml) in methanol die is verdund tot een standaardoplossing C1 (10 μg/ml) in methanol.

AnalyseOverdrachten (%)
Mobiele telefoonMIB
GC Rennen0.040.08
Desorptie van de condenspot0.090
Desorptie van de inlaat00
Redesorptie van de sonde9.353.77

Tabel 2: Beoordeling van de overdracht van de sonde. Overdracht na extractie, desorptie en GC-MS-analyse van een laboratoriumstandaard die GSM en MIB bevat bij 20 ng/l, met interne standaard IPMP bij 30 ng/l. Beschrijvingen van analyses worden gegeven in 2.2.1.

Discussie

GSM en MIB zijn verbindingen met een onaangename smaak die voorkomen in een breed scala aan waterbewakingsomgevingen, en de vraag naar testcapaciteit is groot. Bovendien zijn GSM en MIB op sporenniveaus waarneembaar voor mensen. Een ideaal analytisch systeem moet daarom een hoge gevoeligheid combineren met een hoge doorvoer om grote hoeveelheden kwaliteitsgegevens te produceren. We hebben in de vorige paragrafen aangetoond dat extractie met HCSE-sondes een gevoeligheid oplevert die groter is dan wat nodig is.

Het robuuste ontwerp van HCSE-sondes sluit breuken uit, een probleem dat SPME-workflows kan onderbreken. Na optimalisatie van de methode hebben we geen problemen ondervonden met systeemcontaminatie of carry-over, wat veelvoorkomende problemen zijn met P- en T-methodologieën. De grootste bijdrage aan de hoge doorvoer van deze methode kwam echter ongetwijfeld van het gebruikte autosampler-platform. Met dit systeem ging de analyse de klok rond door, waarbij handmatige tussenkomst nodig was om monsters alleen in de monstertray te leveren. Dit in tegenstelling tot andere sorptie-extractiemethoden met hoge capaciteit, zoals SBSE, die handmatige bediening vereisen. Hoewel SPME gewoonlijk volledig geautomatiseerd is, is de doorvoer beperkt in die zin dat de incubatie van het volgende monster doorgaans pas kan beginnen zodra het vorige monster in de GC-kolom is geïnjecteerd. Ervan uitgaande dat de GC-cyclustijd kort is, kan de GC daarom inactief blijven terwijl het volgende monster de extractie voltooit. Met onze methode kunnen meerdere monsters tegelijkertijd worden voorbemonsterd en geëxtraheerd, zodat de downtime van GC tot een minimum wordt beperkt. Zo konden we 1,8 samples per uur per systeem verwerken.

We hebben MDL's van respectievelijk 1,2 en 1,1 ng/L voor GSM en MIB aangetoond, waarmee we de vereiste gevoeligheid tot nu toe hebben overtroffen. Hoewel andere technieken zoals P en T, LLE, SBSE en SPME onder bepaalde omstandigheden lagere MDL's kunnen bereiken11, zijn deze verhogingen in gevoeligheid van beperkte praktische waarde en rechtvaardigen ze niet het verlies van de hierboven beschreven voordelen van HCSE-sondes. Verder vereisen sommige van deze technieken grote monstervolumes, met daarmee gepaard gaande stijgingen van de afvalproductie en transportkosten. Voor LLE liggen de monstervolumes doorgaans in het bereik van 200 - 500 ml 15,16,17, terwijl voor SPME, SBSE en P en T de typische waarden 10 - 100 ml 18,19,20,21,22 zijn. Uitstekende reproduceerbaarheid werd waargenomen met RSD-waarden van respectievelijk 6,34% en 4,82% voor GSM en MIB. Deze waarden zijn in grote lijnen vergelijkbaar met die van andere methoden11, en overtreffen met name de RSD's in gepubliceerde SPME-methoden23,24. Nogmaals, onze lage RSD-waarden werden bereikt met monstervolumes van slechts 5 ml, lager dan de overgrote meerderheid van gepubliceerde extractietechnieken. We zijn er dus van overtuigd dat HCSE-sondes voldoende gevoeligheid en reproduceerbaarheid bieden, samen met een breed scala aan voordelen die de beste aspecten van alle prominente alternatieven combineren in één eenvoudige, volledig geautomatiseerde en duurzame methode.

Geosmin en 2-methylisoborneol zijn lipofiele verbindingen, wat een uitdaging vormt voor wetenschappers die proberen die verbindingen uit het lipiderijke weefsel te extraheren voor analyse. Daarom hebben we onze pre-sampling condities aangepast, met behulp van een langere en hetere pre-sampling procedure, om meer analyten van de samplematrix naar de headspace te sturen. Nadat we deze aanpassingen hadden gemaakt, hebben we vastgesteld dat de methode goed werkte voor het analyseren van GSM en MIB in visweefsels. Opgemerkt moet worden dat het voor monsters met een zeer hoog lipidengehalte nodig kan zijn om de massa van het gebruikte monster te verminderen, bijvoorbeeld tot 0,50 g. Dit is om te voorkomen dat lipiden een volledige afdichting vormen bovenop het water waardoor analyten de hoofdruimte niet kunnen bereiken.

Deze methode maakt gebruik van evenwichtsprincipes om analyten uit de headspace van een monster te extraheren. Hoewel we hier water- en vismonsters uit de aquacultuur gebruiken, zijn we van mening dat de methode van toepassing is op geurextractie uit elke vaste of vloeibare matrix die kan worden gehomogeniseerd en ondergebracht in een bemonsteringsflacon van 20 ml. Voorbeelden van toepassingen zijn het monitoren van milieuwater en -bodems, het testen van drinkwater en het testen van voedingsmiddelen zoals fruit en groenten, of niet-gekweekt waterleven. In de landbouw worden GSM en MIB vaak aangetroffen in vochtige bodems en kunnen ze een onaangename smaak geven aan gewassen die daarin worden geteeld2, daarom kunnen zowel bodems als gewassen via onze methode worden getest om geurniveaus te controleren als een vorm van kwaliteitscontrole en/of om de bron van onwelriekende klachten te diagnosticeren. Veel milieuwateren, zoals rivieren en meren, ervaren seizoensgebonden pieken in de geurconcentratie als gevolg van algenbloei25, en deze methode biedt een high-throughput, zeer gevoelige manier om de omvang van deze pieken te monitoren. Deze methode is ook geschikt voor academisch onderzoek, bijvoorbeeld om de snelheid van geurproductie door micro-organismen te meten26 of om de relatie tussen geurconcentraties in water en in dierlijke weefsels te onderzoeken27. Andere onderzoeksgroepen hebben het HCSE-proces gebruikt om te extraheren uit een reeks monstertypes, zoals alcoholische dranken28, schapenvlees29, olijfolie30, menselijke celkweekmedia31 en pistachenoten32. Deze studies waren gericht op andere analyten of zijn niet-gerichte profileringsstudies en waren daarom niet geoptimaliseerd voor de analyse van GSM en MIB, maar worden hier gepresenteerd omdat ze algemene inzichten bieden over het voorbereiden van verschillende soorten monsters voor extractie van HCSE-sondes.

Hoewel de beschreven watermethode waarschijnlijk met minimale aanpassingen toepasbaar is op alle water- of watermonsters, kan toepassing op andere vaste of halfvaste monsters enige matrixspecifieke wijziging van de monstervoorbereiding (sectie 3.1) en analytextractie (sectie 3.2) vereisen. Hoewel het niet mogelijk zou zijn om hier elk steekproefscenario te behandelen, bieden we de volgende overwegingen. (1) Vaste monsters moeten worden gehomogeniseerd tot een fijn poeder door middel van raspen, malen of mengen om de representativiteit te garanderen en om een zo groot mogelijk oppervlak te bieden voor het uitgaan van analyten. (2) Vaste monsters met een laag lipidengehalte hoeven geen water of zout toe te voegen - d.w.z. het kan voldoende zijn om 1,00 g in een injectieflacon en dop te wegen. Dit zorgt voor een directere overdracht van analyten van het monster naar de headspace, zonder een tussenliggende overdracht van de monstermatrix naar het toegevoegde water. Dit zal echter de werkzaamheid van het roeren verminderen. Analisten moeten experimenten uitvoeren om de optimale monstervoorbereidingstechniek voor hun monstermatrix te bepalen. (3) Verschillende matrices hebben verschillende affiniteiten voor GSM en MIB. Daarom zijn verschillende incubatietemperaturen nodig om tijdig het analytevenwicht te bereiken. Sommige matrices kunnen echter chemisch worden veranderd door warmte, zodat interferenties worden geproduceerd door chemische reacties bij hoge temperaturen. Nogmaals, er zijn experimenten nodig om de optimale incubatietemperatuur voor een bepaald monstertype te bepalen (opmerking: monsters met een hoog vochtgehalte mogen nooit boven 90 °C worden geïncubeerd om te voorkomen dat flesjes versplinteren door de dampdruk van kokend water).

We hebben methoden ontwikkeld voor de detectie van geosmin en 2-methylisoborneol in water- en visweefsel. Tests op laboratoriumstandaarden bevestigen dat de methoden kwantitatief en reproduceerbaar zijn, terwijl toepassing op real-world monsters (water van recirculerende aquacultuursystemen, visweefsels afgeleid van dergelijke systemen) prestaties aantoont, zelfs in de context van complexe, vuile monsters. Hoewel we onze methoden hebben toegepast op monsters uit de aquacultuur, suggereren we dat ze geschikt zijn voor GSM- en MIB-monitoring in een breed scala aan monstertypes, waaronder water en vaste of halfvaste materialen.

Openbaarmakingen

Auteurs in deze publicatie werkzaam bij Markes International Ltd of Markes International GmbH Assisteerden bij systeemtraining, systeemprotocollen, experimentele ontwerpen en schrijven. Om vooringenomenheid of vermeende vooringenomenheid in ons onderzoek te voorkomen, werd al het laboratoriumonderzoek en de gegevensanalyse uitgevoerd aan de Universiteit van Maine onder direct toezicht van het Amerikaanse ministerie van landbouw - Agriculture Research Service (USDA-ARS) en het Aquaculture Research Institute van de Universiteit van Maine.

Dankbetuigingen

We willen het Amerikaanse ministerie van landbouw, Agricultural Research Service (USDA-ARS) bedanken voor de financiering om de gebruikte apparatuur aan te schaffen en de voortdurende financiering om al dit onderzoek te voltooien. We willen ook Dr. Heather Hamlin, Dr. Amalia Harrington, Dr. Deborah Bouchard, Dr. Sarah Turner, Gareth Dobson, Cameron Coulombe en Abriah James bedanken voor hun hulp en steun tijdens dit onderzoek.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5-10uL pipetteNichipet AirA21405581
1000uL pipette tipsVWR76322-154
100-1000uL pipetteeppendorf285612
100mL glass flaskVWR76008-704
10-100uL pipetteNichipet AirA20814031
10-100uL Pipette tipsmega24502-18
10xL Pipette tipsVWR76322-132
20mL Glass beakersVWR10754-698
2-Isopropyl-3-methoxypyrazineTCII0577Interne standaard
40 ml Amber type-1 (Borosilicate) Glass vialEnvironmental sampling company0040-0400-QCWater Sampling vial
5mL Pipette tipVistaLab technologies4058-5102
BalanceVWRVWR-124B2
Centri 360MarkesU-CENTRI-1691Autosampler
Chromeleon Version 7.3Thermo ScientificGC-MS Software
Focusing trapMarkesU-T12ME-2S
Gas Chromatograph, Trace 1310Thermo Scientific14800403
GC ColumnThermo Scientific26098-1420TG-5MS
Geosmin and 2-Methylisoborneol solutionSIGMA-ALDRICH or MilliporeSigmaCRM47525
Headspace vial, 20 mLMarkesC-VCC20
HiSorb handleMarkesC-HH-6
HiSorb injector capMarkesC-HSPCCS
HiSorb injector linerMarkesU-LINER-HISORB
HiSorb probe, PDMS, short versionMarkesH1-XXABC
HiSorb vial capsMarkesC-HSPCCS
Laboratory metal scoop
Mass Spectrometer, ISQ 7000Thermo ScientificISQ7K-NOVPI
MethanolVWR chemicalsBDH1135-4LP
Methanol, Optima LC-MS gradeFisher-scientificA456-4
O-rings size 201MarkesU-COV201Voor HiSorb injector cap en HiSorb opslag
Ovation automatic pipettor (100-5000uL)VistaLab technologies213626
Purple Nitrile-Xtra Powder Free Exam GlovesKimtech50602-54
Sodium chloride (salt)VWR chemicalsBDH9286-2.5K
Switching adapter (automatic pipettor)CUI INCSMI10-5
Vial crimping toolMarkesU-HSVCR
Vial decapperMarkesU-HSVDC
Weigh boatsGrainger8AG69

Referenties

  1. Zaitlin, B., Watson, S. B. Actinomycetes in relation to taste and odour in drinking water: Myths, tenets and truths. Water Res. 40 (9), 1741-1753 (2006).
  2. Liato, V., Aïder, M. Geosmin as a source of the earthy-musty smell in fruits, vegetables and water: Origins, impact on foods and water, and review of the removing techniques. Chemosphere. 181, 9-18 (2017).
  3. Omür-Ozbek, P., Little, J. C., Dietrich, A. M. Ability of humans to smell geosmin, 2-MIB and nonadienal in indoor air when using contaminated drinking water. Water Sci Technol. 55 (5), 249-256 (2007).
  4. Lindholm-Lehto, P. C., Vielma, J. Controlling of geosmin and 2-methylisoborneol induced off-flavours in recirculating aquaculture system farmed fish-A review. Aquac Res. 50 (1), 9-28 (2018).
  5. Kutovaya, O. A., Watson, S. B. Development and application of a molecular assay to detect and monitor geosmin-producing cyanobacteria and actinomycetes in the Great Lakes. J Great Lakes Res. 40 (2), 404-414 (2014).
  6. Piriou, P., Devesa, R., De Lalande, M., Glucina, K. European reassessment of MIB and geosmin perception in drinking water. AQUA. 58 (8), 532-538 (2009).
  7. Ministry of Health of China. Standards for Drinking Water Quality. GB-5749-2006. , (2006).
  8. McQuarrie, J. P., Boltz, J. P. Moving bed biofilm reactor technology: process applications, design, and performance. Water Environ Res. 83 (6), 560-575 (2011).
  9. Burr, G. S., Wolters, W. R., Schrader, K. K., Summerfelt, S. T. Impact of depuration of earthy-musty off-flavors on fillet quality of Atlantic salmon, Salmo salar, cultured in a recirculating aquaculture system. Aquac Eng. 50, 28-36 (2012).
  10. Piri-Moghadam, H., Ahmadi, F., Pawliszyn, J. A critical review of solid phase microextraction for analysis of water samples. TrAC. 85, 133-143 (2016).
  11. Bristow, R. L., Young, I. S., Pemberton, A., Williams, J., Maher, S. An extensive review of the extraction techniques and detection methods for the taste and odour compound geosmin (trans-1, 10-dimethyl-trans-9-decalol) in water. TrAC. 110, 233-248 (2019).
  12. Baltussen, E., Sandra, P., David, F., Cramers, C. Stir bar sorptive extraction (SBSE), a novel extraction technique for aqueous samples: theory and principles. J Microcolumn Separat. 11 (10), 737-747 (1999).
  13. Chang, J., Biniakewitz, R., Harkey, G. Determination of geosmin and 2-MIB in drinking water by SPME-PTV-GC--MS. , (2008).
  14. Definition and procedure for the determination of the method detection limit, Revision 2. , Environmental Protection Agency EPA. (2016).
  15. Ma, X., Gao, N., Chen, B., Li, Q., Zhang, Q., Gu, G. Detection of geosmin and 2-methylisoborneol by liquid-liquid extraction-gas chromatograph mass spectrum (LLE-GCMS) and solid phase extraction-gas chromatograph mass spectrum (SPE-GCMS). Front Environ Sci. 1, 286-291 (2007).
  16. Li, X., Yu, J., Gu, Q., Su, M., Liu, T., Yang, M., Xhao, Y. Source-water odor during winter in the Yellow River area of China: Occurrence and diagnosis. Environ Pollut. 218, 252-258 (2016).
  17. Lu, J., Willis, P. S., Wilson, P. C. Trace analysis of off-flavor/odor compounds in water using liquid-liquid microextraction coupled with gas chromatography-positive chemical ionization-tandem mass spectrometry. Front Environ Sci. 10, 477-481 (2016).
  18. Ochiai, N., Sasamoto, K., Takino, M., Yamashita, S., Daishima, S., Heiden, A., Hoffman, A. Determination of trace amounts of off-flavor compounds in drinking water by stir bar sorptive extraction and thermal desorption GC-MS. Analyst. 10, 1652-1657 (2001).
  19. Nakamura, S., Daishima, S. Simultaneous determination of 22 volatile organic compounds, methyl-tert-butyl ether, 1,4-dioxane, 2-methylisoborneol and geosmin in water by headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry. Anal Chim Acta. 548, 79-85 (2005).
  20. Sung, Y. H., Lu, T. Y., Huang, S. D. Analysis of earthy and musty odors in water samples by solid-phase microextraction coupled with gas chromatography/ion trap mass spectrometry. Talanta. 65, 518-524 (2005).
  21. Sibali, L. L., Schoeman, C., Morobi, J. S., Molalatladi, B. S. Comparison of two selective methods for determination of geosmin (1,2,7,7-tetramethyl-2-norborneol) and 2-MIB (2-methylisoborneol) in drinking and raw water samples by capillary gas chromatography-mass spectrometry. WQRJ. 42, 491-497 (2010).
  22. Yu, S., Xiao, Q., Zhong, X. x, Su, G., Xu, Y., Zhu, B. Simultaneous determination of six earthy-musty smelling compounds in water by headspace solid-phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry. Anal Methods. 6, 9152-9159 (2014).
  23. Hurlburt, B., Lloyd, S. W., Grimm, C. C. Comparison of analytical techniques for detection of geosmin and 2-methylisoborneol in aqueous samples. J Chromatogr Sci. 47, 670-673 (2009).
  24. Chen, X., Luo, Q., Yuan, S., Wei, Z., Song, H., Wang, D., Wang, J. Simultaneous determination of ten taste and odor compounds in drinking water by solid-phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry. J Environ Sci. 25, 2313-2323 (2013).
  25. Espinosa, C., Abril, M., Bretxa, È, Jutglar, M., Ponsá, S., Sellarès, N., Vendrell-Puigmitjà, L., Llenas, L., Ordeix, M., Proia, L. Driving factors of geosmin appearance in a Mediterranean river basin: The Ter river case. Front Microbiol. 12, 741750(2021).
  26. Lukassen, M. B., Saunders, A. M., Sindilariu, P. D., Nielsen, J. L. Quantification of novel geosmin-producing bacteria in aquaculture systems. Aquaculture. 479, 304-310 (2017).
  27. Howgate, P. Tainting of farmed fish by geosmin and 2-methyl-iso-borneol: A review of sensory aspects and of uptake/depuration. Aquac. 234 (1-4), 155-181 (2004).
  28. Hearn, L., Cole, R., Spadafora, N. D., Szafnauer, R. Volatile and semi-volatile compounds in flavoured hard seltzer beverages: Comparison of high-capacity sorptive extraction (HiSorb) methods. Adv Sample Prep. 3, 100032(2022).
  29. Bu, N., Yang, Q., Chen, J., Li, Y., Liu, D. Characterised and discrimination of volatile compounds in chilled Tan mutton meat during storage using HiSorb-TD-GC-MS and E-nose. Molecules. 28, 4993(2023).
  30. Fella, P., Stylianou, M., Agapiou, A. A green sorptive extraction method (HiSorb-TD-GC-MS) for determining the extra virgin olive oil (EVOO) aroma profile. Pure Appl Chem. 95, 595-610 (2023).
  31. Fenn, D., Lilien, T. A., Hagens, L. A., Smit, M. R., Heijnn, N. F. L., Tuip-de Boer, A. M. Validation of volatile metabolites of pulmonary oxidative injury: a bench to bedside study. ERJ Open Res. 9, (2023).
  32. Schincaglia, A., Purcaro, G., Beccario, M. Unlocking the aroma compounds of pistachios using the power of multi-dimensional gas chromatography. Poster presented at Advances in Separation Science. , (2023).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Geosmin detectie2 methylisoborneol detectieGC MS analysewaterkwaliteitsbewakinganalyse van visweefselvluchtige organische verbindingenkalibratie met interne standaardprobe desorptieaquacultursystemen

Gerelateerde artikelen