Methodenartikel

Niet-invasieve visualisatie van microvasculaire morfologie van nagelbedden bij muizen met behulp van capilloscopie

DOI:

10.3791/67529

⸱

28 februari 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Ophthalmology, Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School, 3Department of Anesthesia and Critical Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 4Department of Ophthalmology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Capillulatoscopie is een toegankelijk hulpmiddel voor directe, goedkope en niet-invasieve visualisatie van microvasculatuur. Het doel van dit protocol is om onderzoekers in staat te stellen capilloscopie te gebruiken voor de visualisatie van perifere microvasculaire morfologie in de nagelbedden van muizen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het in beeld brengen van microcapillaire netwerken van de huid bij mensen met behulp van nagelvouwcapillaroscopie (NFC) heeft het belang van microcirculatie als doelorgaansysteem bij kritieke systemische ziekten onderstreept. Nagelplooi capillaroscopie wordt klinisch toegepast om perifere microvasculaire disfunctie en afwijkingen te detecteren bij een reeks systemische aandoeningen, waaronder reumatische, hart-, oog- (bijv. glaucoom) en endocriene aandoeningen (bijv. hypertensie en diabetes mellitus). NFC is niet alleen nuttig bij het detecteren van perifere systemische verstoring van het microvasculatuur, maar ook bij het beoordelen van de werkzaamheid van geneesmiddelen. Het vertalen van klinische NFC-bevindingen naar dierziektemodellen kan echter een uitdaging zijn. Het detecteren van microvasculaire disfunctie of afwijkingen bij dieren is vaak invasief (bijv. endoscopisch), ex vivo uitgevoerd (bijv. post-mortem beeldvorming van weefsels) of duur, en vereist gespecialiseerde apparatuur zoals die wordt gebruikt in microcomputertomografie en fotoakoestische beeldvormingstechnieken. Het ontwikkelen van snelle, niet-invasieve en goedkope technieken om perifere microvasculatuur in diermodellen van ziekten in beeld te brengen, is gerechtvaardigd om de onderzoekskosten te verlagen en de vertaalbaarheid naar de kliniek te vergroten.

Caprouoscopie is eerder gebruikt om de microvasculatuur van de nagelplooi te visualiseren in diermodellen, waaronder bij cavia's en muizen, waardoor het vermogen van capillaroscopie als niet-invasief beeldvormingsinstrument in diermodellen wordt aangetoond. Deze studie biedt een protocol dat capilloscopie toepast op een nagelbed van een muis, waardoor onderzoekers gemakkelijk en goedkoop de morfologie van de microvasculatuur kunnen beoordelen. Representatieve beelden van typische microvasculaire architectuur met nagelbedden in wildtype muizen met behulp van twee veelgebruikte laboratoriumstammen, SV129/S6 en C57/B6J, worden verstrekt. Verdere studies met deze methode zijn essentieel voor het toepassen van nagelbedcapilloscopie op een breed scala aan muisziektemodellen met perifere microvasculaire afwijkingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beeldvorming van perifere microcapillaire netwerken bij mensen met behulp van nagelvouwcapillaroscopie (NFC) heeft het belang van microcirculatie als doelorgaansysteem bij een breed scala aan systemische ziektenbenadrukt1. Capillulatoscopie omvat het gebruik van een microscoop om bloedvaten in de nagelplooi in vivo te vergroten en te visualiseren. Als zodanig is het een techniek die veel wordt gebruikt in de kliniek om perifere microvasculaire disfunctie en afwijkingen te detecteren bij een reeks systemische aandoeningen, waaronder reumatisch 2,3, cardiaal4, oculair (bijv. glaucoom)5,6 en endocriene ziekten (bijv. hypertensie en diabetes mellitus 7,8). Morfologische veranderingen in de nagelplooicapillairen, waaronder bloedingen, verhoogde kronkeligheid van de bloedvaten en avasculaire gebieden, worden gemakkelijk gedetecteerd met behulp van NFC. Deze morfologische afwijkingen vertegenwoordigen pathologische processen zoals overmatige of gebrekkige microvasculaire remodellering 9,10. NFC is een nuttig diagnostisch hulpmiddel voor het detecteren van deze pathologieën. Bovendien is deze techniek nuttig bij de beoordeling van de werkzaamheid van geneesmiddelen11.

Het vertalen van klinische NFC-bevindingen naar diermodellen van ziekten is echter om vele redenen een uitdaging. Het visualiseren van microvasculatuur bij dieren is doorgaans invasief (bijv. endoscopisch), ex vivo uitgevoerd (bijv. postmortale beeldvorming van weefsels) of duur, en vereist gespecialiseerde apparatuur zoals microcomputertomografie12,13, coherentietomografie, angiografie14 en fotoakoestische beeldvormingstechnieken15. Aangezien perifere microvasculaire pathologie duidelijk is bij een breed scala aan systemische ziekten en ziekten van het centrale zenuwstelsel, waaronder myocardinfarct16, hypertensie17, leeftijdsgebonden neurodegeneraties van het centrale zenuwstelsel zoals de ziekte van Alzheimer18 en optische neuropathieën zoals glaucoom19, is een niet-invasieve, kosteneffectieve in vivo visualisatietechniek zeer nuttig.

Capillulatoscopie is gebruikt om de microvasculatuur van de nagelplooi te evalueren in diermodellen, waaronder cavia's20 en muizen21, waarmee het vermogen ervan als niet-invasief beeldvormingsinstrument wordt aangetoond. Hier passen we capilloscopie toe op een ander deel van de nagel, het nagelbed. Door gebruik te maken van de transparantie van de muizennagel, introduceert genagelde capilloscopie een nieuwe locatie voor de visualisatie van perifere microvasculatuur. In vergelijking met NFC, dat vooral nuttig is voor het monitoren van de beweging van bloedcellen21,22, biedt het hier beschreven nagelbed capillairoscopieprotocol een groter gebied voor een betere observatie van microvasculaire morfologie en structuur. We bieden een protocol waarmee onderzoekers gemakkelijk en goedkoop de morfologie van microvasculatuur met nagelbed bij muizen kunnen beoordelen, wat een nieuwe locatie is voor niet-invasieve perifere vasculaire beeldvorming. Dit protocol biedt representatieve beelden van de typische microvasculaire architectuur van spijkerbedden bij wildtype muizen met behulp van twee veelgebruikte laboratoriumstammen (SV129/S6 en C57/B6J). We laten zien dat nagelbed capilloscopie een goedkope, niet-invasieve microvasculaire beeldvormingsmodaliteit is. Verdere studies met behulp van deze verkennende methode zullen essentieel zijn om nagelbed capilloscopie toe te passen op een breed scala aan muismodellen van ziekten waarbij perifere microvasculaire afwijkingen duidelijk aanwezig zijn in pathologie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Vanderbilt University Medical Center en het Massachusetts General Hospital.

1. Voorbereiding van muisnagels voor beeldvorming

OPMERKING: Voor een optimale helderheid van de bloedvaten en huidherstel, wacht ten minste 24 uur voor de beeldvorming.

  1. Om onbelemmerde beeldvorming van het nagelbed van muizen mogelijk te maken, moet de vacht van de poten van knaagdieren ten minste 24 uur vóór de capillaire beeldvorming worden verwijderd (Figuur 1A). Volg de stappen 1.1.1-1.1.6 om de vacht van muizenpoten te verwijderen.
    1. Smeer het dier met behulp van ingeademde isofluraan-anesthesie (2% isofluraan in 5% kooldioxide/95% zuurstof). Controleer of de muis voldoende verdoofd is door het voetkussen op beide achterpoten samen te knijpen. Als u goed verdoofd bent, mag er geen schokkende beweging zijn (pedaalterugtrekkingsreflex). Als er een reflexbeweging is, geef de muis dan meer tijd onder isofluraan om volledig verdoofd te raken. Test opnieuw op de pedaalterugtrekreflex en ga verder.
    2. Nadat de muis goed is verdoofd, brengt u een glijmiddel ooggel of steriele niet-medicinale oogzalf aan op beide ogen om uitdroging van het hoornvlies tijdens de narcose te voorkomen.
    3. Houd het dier onder narcose met behulp van een neuskegel en breng een royale hoeveelheid ontharingscrème aan op de hele poot met behulp van een applicator. Zorg ervoor dat u de hele poot en het nagelbed bedekt, zoals weergegeven in Afbeelding 1B.
    4. Laat de ontharingscrème 2 minuten op de poot zitten bij kamertemperatuur (RT).
    5. Verwijder de ontharingscrème voorzichtig door er voorzichtig over te wrijven met een schone tissue.
    6. Was de poot in lauw, steriel water.
      OPMERKING: Poten moeten vrij zijn van vacht en spijkers vrij zijn van onbelemmerde beeldvorming, zoals weergegeven in afbeelding 1C.
    7. Breng de muis terug naar zijn kooi om een veilig herstel van de anesthesie te garanderen. Laat de muis niet onbeheerd achter totdat hij weer bij bewustzijn is. Zodra de muis weer bij bewustzijn is, brengt u hem terug naar de oorspronkelijke kooi in het gezelschap van andere dieren.

2. In vivo nagelbed capillaire beeldvorming

  1. Na een hersteltijd van minimaal 24 uur na het verwijderen van de vacht, stelt u de capillaire scopieapparatuur in een ruimte met temperatuurregeling (tussen 21,5-22,5 °C), zoals weergegeven in figuur 2A. De complete opstelling voor beeldvorming met nagelbedden omvat 1) isofluraan-anesthesieapparatuur, 2) een anesthesieneuskegel, 3) een instelbaar dierstadium, 4) een capillairoscopiemicroscoop en 5) een laptop met videosoftware voor beeldvorming.
  2. Smeer het dier met behulp van ingeademde isofluraan-anesthesie (2% isofluraan in 5% kooldioxide/95% zuurstof).
    1. Controleer of de muis voldoende verdoofd is door het voetkussen op beide achterpoten samen te knijpen. Als u goed verdoofd bent, mag er geen schokkende beweging zijn (pedaalterugtrekkingsreflex). Als er een reflexbeweging is, keer dan terug naar stap 1.1.1 en geef de muis meer tijd om volledig verdoofd te zijn. Test vervolgens opnieuw op de terugtrekreflex van het pedaal en ga verder.
    2. Nadat de muis goed is verdoofd, brengt u glijmiddel ooggel of steriele niet-medicinale oogzalf aan op beide ogen om uitdroging van het hoornvlies tijdens de anesthesie te voorkomen.
  3. Houd het dier onder sedatie en plaats de achterpoot met de volaire kant naar boven op het laboratoriumtapeplatform onder het objectief, zoals weergegeven in afbeelding 2B, zoom.
  4. Spreid de tenen voorzichtig om de nagels onder het microscoopobjectief te scheiden met behulp van een applicator. Zorg ervoor dat nagelbedden van elkaar gescheiden zijn voor een optimale beeldvorming van het vat.
    OPMERKING: Figuur 2C toont de volledige beeldvormingsopstelling met het beeld van het schip op de videosoftware van de laptop.
  5. Om schittering te verminderen en de focus te verbeteren, brengt u royaal onderdompelingsolie (maïsolie) aan op de poot, zodat de nagel volledig wordt bedekt. Voeg witte tape of iets dergelijks toe onder de muispoot om het contrast te verbeteren en de visualisatie van het vaatbed te verbeteren (Figuur 3; pijl 3).
  6. Concentreer u op de nagel op de tweede vinger van de achterpoot; Bij muizen is dit de grootste nagel en het gemakkelijkst af te beelden. Om de muisnagel scherp te stellen, gebruikt u de x- en y-trapafstellers (Figuur 3; pijl 4) en het vergrotingswiel (tot 280x op dit instrument; Figuur 3; pijl 1).
  7. Draai het objectief om de positionering van schittering te verminderen om het netwerk van spijkervaten in beeld te brengen (Figuur 3; pijl 2).
    OPMERKING: Als bloedvaten moeilijk te zien worden of de beeldvormingstijd langer wordt, breng de dompelolie dan royaal opnieuw aan. De poten van muizen zijn kleiner dan de achterpoten; Daarom wordt aanbevolen om beeldvorming op de achterpoten uit te voeren.
  8. Sluit de capilloscoop aan op een laptop via een universele seriële bus (USB) aansluiting.
  9. Open de Debut video-softwaretoepassing op de laptop.
    OPMERKING: Controleer of het apparaat correct is aangesloten op de laptop in de instellingen.
  10. Visualiseer op het laptopscherm wat er door de capillaire scoop wordt vergroot en stel scherp op het nagelbed door de x- en y-trap-regelaars en het vergrotingswiel aan te passen om een helder beeld te verkrijgen.
  11. Zodra de microscoop is scherpgesteld en er een duidelijk beeld van het vatnetwerk in het nagelbed te zien is, neemt u een video op door op de rode opnameknop in Debut of een vergelijkbaar videosoftwareprogramma te drukken (Figuur 2C).
  12. Sla elke video op in de juiste projectmap en label elke video dienovereenkomstig.

3. Nailbed-afbeeldingen opslaan

  1. Open de nagelbedvideo in de software en kies handmatig een frame in de video waar de bloedvaten duidelijk scherp zijn.
  2. Maak met behulp van de Screenshot-tool op de computer een screenshot van het debuutvideoscherm met een duidelijk vaatstelsel in de nagel. Afbeelding opslaan.
  3. Open de schermafbeelding in de ImageJ-software door op Bestand en Openen te klikken; Selecteer het bestand in de doelmap.
  4. Pas indien nodig de helderheid en het contrast aan door Afbeelding te selecteren > Pas > helderheid/contrast aan. Deze tool kan helpen het contrast van de afbeeldingen te veranderen om de morfologie van het schip beter te visualiseren.
  5. Nadat de afbeelding is aangepast, klikt u op Instellen in de tool Helderheid/contrast .
  6. Sla de afbeelding op als een TIFF-bestand door op Bestand en vervolgens op Opslaan als te klikken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van de hier beschreven capilloscopiemethode kan de vasculaire morfologie van het nagelbed gemakkelijk in beeld worden gebracht, zoals weergegeven in figuur 4A. Het typische nagelbed bij een muis vertoont drie consistente kenmerken, zoals aangegeven in figuur 4B: elk nagelbed heeft 1) een afferent vat, 2) een efferent vat en 3) een netwerk van haarvaten die zowel de afferente als de efferente vaten met elkaar verbinden...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Samenvattend bieden we een protocol waarmee onderzoekers gemakkelijk en goedkoop de morfologie van microvasculatuur met nagelbedden van muizen kunnen beoordelen, een nieuwe locatie voor niet-invasieve perifere vasculaire beeldvorming. Net als NFC-methoden die worden gebruikt bij cavia's20 en muizen21, is de belangrijkste kracht van het hier beschreven protocol dat het een snelle en niet-invasieve evaluatie van perifere microvasculatuur in m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niet gerelateerd aan dit werk, was Dr. Pasquale een betaalde consultant voor Twenty Twenty. Clara Cousins, die niets met dit werk te maken heeft, is een betaalde consultant bij Cartography Biosciences. De andere auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door onbeperkte departementale fondsen die werden toegekend aan Lauren K. Wareham. Dr. Pasquale wordt ondersteund door The Glaucoma Foundation (NYC) en door een onbeperkte uitdagingsbeurs van Research to Prevent Blindness (NYC).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anesthetic Charcoal Filter CannisterReFreshEZ-258
Capillaroscoop Jiahua Electronic Instrument Co., Jiangsu, ChinaJH-1004
Gecomprimeerd gas (5% koolstofdioxide, 95% zuurstof)AirgasUN3156
MaïsolieSigmaC8-267 
Debut video-opnamesoftwareDebutBeschikbaar gratis online.
OogspeersBVI Weck- Cel0008680Voor het aanbrengen en verwijderen van haarcremo.
HaarcremoNair 610370323649
Isofluraan 250 mL flesPiramal critical careNDC  6679401725
Lab jack Fisherbrand14-673-52Gebruikt als platform om de muis vast te houden.
Neuskoker (laagprofiel anesthesiemasker)Kent ScientificSOMNO-0801
TransferpijpjesFisherbrand13-711-9AMBreng maïsolie royaal aan op de muispoot als een onderdompelingsolie.
USB-videokaartVIXLWBR116
VetequipVWR89012-492Isofluraanutrusting
Witte labeltape Fisherbrand15-958Gebruikt om een ​​witte/contrasterende achtergrond onder de muispoot te creëren bij het maken van foto's.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. El Miedany, Y., Ismail, S., Wadie, M., Hassan, M. Nailfold capillaroscopy: tips and challenges. Clin Rheumatol. 41 (12), 3629-3640 (2022).
  2. Etehad Tavakol, M., Fatemi, A., Karbalaie, A., Emrani, Z., Erlandsson, B. -E. Nailfold capillaroscopy in rheumatic diseases: Which parameters should be evaluated. BioMed Res Int. 2015 (1), 974530(2015).
  3. Cutolo, M., Smith, V. Detection of microvascular changes in systemic sclerosis and other rheumatic diseases. Nat Rev Rheumatol. 17 (11), 665-677 (2021).
  4. Lim, M. W. S., et al. Nailfold video-capillaroscopy in the study of cardiovascular disease: a systematic review. Blood Press Monit. 28 (1), 24-32 (2023).
  5. Philip, S., Najafi, A., Tantraworasin, A., Pasquale, L. R., Ritch, R. Nailfold capillaroscopy of resting peripheral blood flow in exfoliation glaucoma and primary open-angle glaucoma. JAMA Ophthalmol. 137 (6), 618-625 (2019).
  6. Taniguchi, E. V., et al. Peripheral microvascular abnormalities associated with open-angle glaucoma. Ophthalmol Glaucoma. 6 (3), 291-299 (2023).
  7. Maldonado, G., Guerrero, R., Paredes, C., Ríos, C. Nailfold capillaroscopy in diabetes mellitus. Microvasc Res. 112, 41-46 (2017).
  8. Gurfinkel, Y. I., Sasonko, M., Priezzhev, A. Digital capillaroscopy as important tool for early diagnostics of arterial hypertension Proc. SPIE 9448, Saratov Fall Meeting 2014: Optical Technologies in Biophysics and Medicine XVI; Laser Physics and Photonics XVI; and Computational Biophysics. , 944804(2015).
  9. Santamaría, R., González-Álvarez, M., Delgado, R., Esteban, S., Arroyo, A. G. Remodeling of the microvasculature: May the blood flow be with you. Front Physiol. 11, 586852(2020).
  10. Pries, A. R., Secomb, T. W. Making microvascular networks work: angiogenesis, remodeling, and pruning. Physiology. 29 (6), 446-455 (2014).
  11. Cutolo, M., Smith, V. State of the art on nailfold capillaroscopy: a reliable diagnostic tool and putative biomarker in rheumatology. Rheumatology. 52 (11), 1933-1940 (2013).
  12. Bentley, M. D., Ortiz, M. C., Ritman, E. L., Romero, J. C. The use of microcomputed tomography to study microvasculature in small rodents. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282 (5), R1267-R1279 (2002).
  13. Zagorchev, L., et al. Micro computed tomography for vascular exploration. J Angiogenes Res. 2, 7(2010).
  14. Untracht, G. R., et al. Pilot study of optical coherence tomography angiography-derived microvascular metrics in hands and feet of healthy and diabetic people. Sci Rep. 13 (1), 1122(2023).
  15. Mirg, S., Turner, K. L., Chen, H., Drew, P. J., Kothapalli, S. -R. Photoacoustic imaging for microcirculation. Microcirculation. 29 (6-7), e12776(2022).
  16. Gkontra, P., et al. Dynamic changes in microvascular flow conductivity and perfusion after myocardial infarction shown by image-based modeling. J Am Heart Assoc. 8 (7), e011058(2019).
  17. Laurent, S., Agabiti-Rosei, C., Bruno, R. M., Rizzoni, D. Microcirculation and macrocirculation in hypertension: A dangerous cross-link. Hypertension. 79 (3), 479-490 (2022).
  18. Kisler, K., Nelson, A. R., Montagne, A., Zlokovic, B. V. Cerebral blood flow regulation and neurovascular dysfunction in Alzheimer disease. Nat Rev Neurosci. 18 (7), 419-434 (2017).
  19. Wareham, L. K., Calkins, D. J. The neurovascular unit in glaucomatous neurodegeneration. Front Cell Dev Biol. 8, 452(2020).
  20. Mandujano, A., Golubov, M. Animal models of systemic sclerosis: using nailfold capillaroscopy as a potential tool to evaluate microcirculation and microangiopathy: a narrative review. Life. 12 (5), 703(2022).
  21. Kim, M. Nail fold capillaroscopy as a potential tool to evaluate breast tumor. J Anal Sci Technol. 15 (1), 35(2024).
  22. McKay, G. N., et al. Visualization of blood cell contrast in nailfold capillaries with high-speed reverse lens mobile phone microscopy. Biomed Opt Express. 11 (4), 2268-2276 (2020).
  23. Zhang, X., Qian, X., Tao, C., Liu, X. In vivo imaging of microvasculature during anesthesia with high-resolution photoacoustic microscopy. Ultrasound Med Biol. 44 (5), 1110-1118 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Nagelbedcapillaroscopiemicrovasculatuur van de muisperifere microcirculatieniet invasieve beeldvormingcapillair netwerkvasculaire dysfunctienagelvalcapillaroscopiemicrovasculaire abnormaliteitenImageJ analyse

Gerelateerde artikelen