Methodenartikel

Bereiding van in agarkraal ingebedde Mycobacterium abscessus om immunocompetente muizen intratracheaal te inoculeren

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67602

⸱

25 april 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health, 2Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology, Immunology and Pathology, Colorado State University, 3Department of Biological Sciences, College of Science, University of Tabuk, 4Emerging Bacterial Pathogens Unit, Division of Immunology, Transplantation and Infectious Diseases, IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 5Department of Medical Sciences, Hackensack Meridian School of Medicine, 6Department of Microbiology and Immunology, Georgetown University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Muizen zijn over het algemeen resistent tegen infecties door Mycobacterium abscessus, wat de ontdekking en ontwikkeling van de broodnodige antibiotica tegen longinfecties bemoeilijkt. Hier beschrijven we een methode van inoculumbereiding en intratracheale infectie waarvan is aangetoond dat deze een aanhoudende infectie veroorzaakt bij immunocompetente muizen.

Samenvatting

Robuuste muismodellen van chronische infectie met Mycobacterium abscessus, een omgevingspathogeen die bij voorkeur de longen infecteert, zijn hard nodig. Jaarlange multidrug-therapieën leveren onaanvaardbaar slechte genezingspercentages op bij patiënten, ongeveer 50%, vandaar de behoefte aan voorspellende preklinische hulpmiddelen om betere antibiotica te ontwikkelen. Immunocompetente muizen zijn echter over het algemeen resistent tegen longinfectie door M. abscessus. In de literatuur zijn talrijke pogingen gerapporteerd om een aanhoudende infectie met M. abscessus bij immunocompetente muizen vast te stellen. Hiervan zijn methoden die gebaseerd zijn op in agar kralen ingebedde bacteriën die via de intratracheale route in C57BL/6-muizen zijn geënt, het meest veelbelovend gebleken. De belangrijkste beperking van deze aanpak is de technische uitdaging die gepaard gaat met de bereiding van agarkorrels van reproduceerbare grootte en bacterieaantallen, gevolgd door intratracheale inoculatie. Hier geven we eerst een gedetailleerde beschrijving van een geoptimaliseerd protocol dat met M. abscessus beladen agarkorrels met een optimale diameter en reproduceerbare bacteriële belasting levert. Vervolgens bieden we een gedetailleerd protocol voor intratracheale inoculatie, geoptimaliseerd om verlies van kralen en bacteriën als gevolg van hechting aan de oppervlakken van de inoculatieapparaten te voorkomen en om reproduceerbare pulmonale afzetting van in agar ingebedde M. abscessus te bereiken. Het doel is om een gemakkelijke implementatie en een uitstekende reproduceerbaarheid van lab tot lab te garanderen.

Inleiding

Behandelingsopties voor Mycobacterium abscessus (Mab) longziekte zijn beperkt en omvatten een jaar lang multidrug-regimes met orale, parenterale en af en toe geïnhaleerde antibiotica, waarvan de meeste geen optimale bacteriedodende activiteit hebben en geassocieerd zijn met significante toxiciteit 1,2,3,4,5 . Er is dringend behoefte aan kortere, veiligere en effectievere therapieën. Muismodellen van mycobacteriële infecties hebben een belangrijke rol gespeeld bij de ontdekking en optimalisatie van effectieve medicijnen en medicijnregimes 6,7. De preklinische evaluatie van antibiotica tegen Mab-infecties is echter een uitdaging gebleken vanwege de moeilijkheid om progressieve en aanhoudende longinfecties bij muizen vast te stellen 8,9.

Infectie van immunocompetente muizenstammen met Mab resulteert grotendeels in voorbijgaande kolonisatie, gevolgd door snelle klaring van de ziekteverwekker10,11. Om chronische infectie te bereiken, zoals klinisch waargenomen, zijn immobiliserende middelen zoals agarose of agar gebruikt voor het bevorderen van de persistentie van en immunopathologische reacties op opportunistische pathogenen zoals Pseudomonas aeruginosa of Haemophilus influenza bij immunocompetente muizen 12,13,14. Dit model is onlangs aangepast om chronische luchtweginfectie te bereiken door Mab ATCC 19977 bij immunocompetente C57BL/6N-muizen 15,16,17,18. De methode induceerde aanhoudende infectie tot 45 dagen na intratracheale inoculatie met ~1 × 104 tot 1 × 106 kolonievormende eenheden (CFU), met een incidentie van chronische infectie bij geïnfecteerde muizen van 90%-100%19 en de vorming van georganiseerde granulomen rond de uiteenvallende agarkraal18. Het lijkt erop dat het inbedden van Mab in kralen beschermt tegen snelle klaring door het aangeboren immuunsysteem en dat kralen vol bacteriën brandpunten vormen voor de rekrutering van immuuncellen, wat leidt tot de vorming van granulomen en het ontstaan van chronische infectie18. Agar/agarose-kralen vormen een relatief inert biomateriaal dat minimale ontstekingsreacties veroorzaakt. Bovendien vallen de kralen langzaam uiteen, waardoor allergische reacties van een vreemd lichaam of geïnduceerde fibrose worden voorkomen. Intratracheale infectie met of zonder een microspray-apparaat zorgt voor een effectieve afzetting van het inoculum in de longen 8,20,21 en reproduceert klinische blootstelling en infectie beter dan intraveneuze of intranasale inoculatie.

Het model biedt dan ook veel voordelen. Het brengt echter ook een paar uitdagingen van technische aard met zich mee, namelijk (i) het bereiken van reproduceerbare korrelgrootte, (ii) het verkrijgen van reproduceerbare bacteriële belasting van de kraal, en (iii) het zorgen voor consistente intratracheale toediening van het inoculum. Hier bieden we gedetailleerde protocollen om deze doelstellingen op betrouwbare wijze te bereiken en de reproduceerbaarheid van lab tot lab te garanderen.

Protocol

Alle dierstudies zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health met goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee van de NIAID (NIH), Bethesda, MD. Alle procedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee. Alle onderzoeken met M. abscessus werden uitgevoerd in een laboratorium met bioveiligheidsinperkingsniveau 2.

1. Bereiding van in agarkraal ingebedde M. abscessus inoculum

  1. Bereid een precultuur van M. abscessus ATCC 19977 voor door 1,5 ml optische dichtheid (OD600) 1 (met behulp van een spectrofotometer) cultuur te inoculeren in 200 ml Middlebrook 7H9-medium aangevuld met 0,05% (v/v) Tween 80, 0,5% (v/v) glycerol en 10% (v/v) Middlebrook albumine-dextrose-catalaseverrijking (ADC).
  2. Incubeer de culturen in een rollerfles bij 37 °C gedurende 24 uur tot ze de mid-logfase bereiken (OD600 = 0,4-0,6).
  3. Suspendeer 1,2 g tryptische sojabouillon (TSB) in 40 ml ultrapuur water en voeg 0,6 g Difco Agar toe tot een eindconcentratie van 1,5%.
  4. Breng 60 ml zware minerale olie over in een erlenmeyer van 500 ml en steriliseer zowel de minerale olie als de tryptische soja-agar (TSA) gedurende 15 minuten bij 121 °C en breng vervolgens in evenwicht bij 50 °C in een oven.
  5. Bemonster 1 ml van de cultuur en meet de OD600.
  6. Oogst de cellen door centrifugeren bij 3700 g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Resuspendeer de cellen in 4 ml 1x Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) om een OD600 van ongeveer 30 te bereiken.
  7. Meng 3 ml bacteriële suspensie met 27 ml gesmolten TSA voorgeëquilibreerd bij 50 °C in een centrifugebuis van 50 ml. Meng snel door vortexen of pipetteren.
  8. Giet het bacterie-agarmengsel (30 ml) voorzichtig in 60 ml minerale olie en plaats de kolf in een secundaire container. Stel het mengsel snel in op gemiddelde snelheid (420 tpm) op een magnetische roerder die is ingesteld op 50 °C, met behulp van een magnetische roerstaaf. Zorg ervoor dat er een zichtbare draaikolk ontstaat in het olie-agarmengsel. Roer gedurende 6 minuten op kamertemperatuur (RT).
  9. Koel het mengsel af door ijs in de secundaire kom te doen en blijf 35 minuten roeren.
  10. Stop met roeren en laat de agar-parelbrij 20 minuten rusten (vul het ijs indien nodig bij).
  11. Breng het slurrymengsel over in twee centrifugebuisjes van 50 ml en was 10 keer met één volume DPBS om olie en vrije bacteriën te verwijderen (3700 g, 6 min, 4 °C, gedurende de eerste 5 cycli).
    1. Combineer de agarkralensuspensies in één tube bij de derde wasbeurt. Gebruik tijdens de eerste 5 wascycli een serologische pipet om de parels voorzichtig opnieuw te suspenderen.
    2. Gebruik voor de volgende 5 wascycli de volgende centrifugatieparameters: 2000 g gedurende 5 minuten, gevolgd door 1000 g gedurende respectievelijk 4, 3, 2 en 2 minuten.
  12. Resuspendeer de agarkorrels in DPBS tot een eindvolume van 40 ml, breng over naar een steriele fles van 125 ml en verdun 4x door 120 ml DPBS toe te voegen.
  13. Leid de suspensie door een celzeef van 200 μm.
    1. Bevestig de zeef aan een steriele centrifugebuis van 50 ml. Voeg vervolgens monstermateriaal toe aan de zeef en filtreer de kralensuspensie.
    2. Om het filtratieproces te vergemakkelijken, combineert u een celzeef, een trechter, een verbindingsring en een buis van 50 ml tot een eenheid. Monteer de onderdelen in de volgorde van trechter, celzeef, connectorring en buis van 50 ml en trek langzaam aan de zuiger van een spuit van 30 ml die aan de connectorring is bevestigd.
  14. Spoel indien nodig de zeef vanaf de andere kant af met DPBS om eventuele achtergebleven grotere parels weg te spoelen. Concentreer de verdunde suspensie door 2 minuten op 1000 g te draaien of door de korrels door de zwaartekracht te laten bezinken. Bewaar de agarkorrels na het oogsten maximaal 1 week bij 4 °C. Voor elke batch experimenten wordt een nieuwe bereiding aanbevolen.
  15. Pipetteer 5 μL van de kralenophanging op een glasplaatje, bedek deze met een dekglaasje en maak foto's op een paar willekeurige posities met behulp van een licht- of fluorescentiemicroscoop met een 10× objectieflens. Sla de afbeeldingen op en meet de korreldiameter met ImageJ (gewenst formaatbereik: 200 ± 50 μm).

2. Titratie van in agarkraal ingebedde M. abscessus inoculum

  1. Voeg 1 ml van de kralensuspensie toe aan een M-buis en homogeniseer aseptisch om bacteriën vrij te maken die in kralen zijn ingebed met behulp van een dissociator die is ingesteld op het vooraf gedefinieerde programma RNA.02.01.
  2. Neem 100 μL van het homogenaat en verdun 1:10 tot 1 × 10-5 verdunning. Verdunningen verdelen op 7H10 agar aangevuld met 10% oliezuur-albumine-dextrose-katalase (OADC) en 2% glycerol. Vermeld CFU na 3 tot 5 dagen incubatie.
  3. Pas de inoculumtiter indien nodig aan. Als elke muis bijvoorbeeld 100 μL kralensuspensie met 1 × 105 CFU aan 10 muizen krijgt, wordt in totaal 2 ml suspensie met 1 × 106 CFU/ml bereid plus ~25% om rekening te houden met verliezen in spuiten.

3. Testen van de druppelafgifte via de spuit en de naald

OPMERKING: De volgende stappen zijn opgenomen om ervoor te zorgen dat kralen niet aan de oppervlakken van de spuit of naald hechten. Het bleek dat het belangrijk is om een glazen spuit en een metalen voedingsnaald van 24 G te gebruiken om te voorkomen dat kralen verloren gaan door hechting aan plastic oppervlakken.

  1. Bereid PBST voor door 1.25 ml steriele Tween 80 tot 500 ml steriele PBS toe te voegen.
  2. Voeg 900 μL PBST toe aan vijf M buisjes voor het testen van de agar kralen die door de voedingsnaald gaan, evenals 900 μL PBST aan 2 ml steriele buisjes om -2 tot -6 verdunningen van elk push-through monster te bereiden.
  3. Meng de eerder bereide agarparel ingebedde M. abscessus met een P1000-pipet om ervoor te zorgen dat alle kralen gelijkmatig worden verspreid.
  4. Bevestig een metalen voedingsnaald van 24 G aan de glazen spuit en zuig de agardruppelsuspensie op, waarbij u ervoor zorgt dat er geen luchtbellen ontstaan.
  5. Zodra de spuit vol is zonder luchtbellen, plaatst u nylon clips of stoppen op de zuiger van de spuit, zonder ruimte tussen de clips. De stoppers zorgen voor een nauwkeurige dosering van 50-100 μL. Het is mogelijk om tot 6 clips langs de plunjer te plaatsen.
  6. Doseer 100 μL kralen ("push-through") in de M-buisjes in hun respectievelijke volgorde.
  7. Nadat 5 push-throughs zijn verzameld, homogeniseert u de kralen met behulp van de weefseldissociator die is aangepast aan de RNA.02.01-instelling, geschikt voor RNA-preparaat uit bevroren organen en waarvan werd vastgesteld dat deze M. abscessus effectief uit de kralen losmaakte zonder de levensvatbaarheid van de cellen aan te tasten.
  8. Voer een seriële verdunning uit voor de homogenaten in het bereik van -1 tot -6. Plaat de verdunningen op 7H11 agarplaten aangevuld met OADC. Tel CFU na 5 dagen.

4. Intratracheale inoculatie van muizen

  1. Bereid CD-1-muizen van 6 tot 8 weken voor.
  2. Smeer de muizen met behulp van een isofluraan-aerosolblootstellingssysteem, met een debiet van 1-5%, zoals eerder beschreven1.
  3. Houd de muizen in bedwang met behulp van een driedimensionale (3D) geprinte gekantelde standaard (op maat ontworpen en geproduceerd). De staaf in het midden van de standaard heeft een hechtkoord dat de muis verticaal omhoog houdt aan de snijtanden, waardoor de muis in een buiklighouding wordt geplaatst met het hoofd omhoog.
  4. Bevestig een metalen 24 G voedingsnaald aan een glazen spuit gevuld met agarkraal ingebed in M. abscessus. Plaats nylon clips of stoppen op de zuiger van de spuit om elke muis te infecteren met 50 μL inoculum.
  5. Zodra de verdoofde muis is vastgehouden aan de hechtdraad, verplaatst u de tong naar de zijkant van de mond met behulp van een wattenstaafje.
  6. Visualiseer de achterkant van de mond van de muis om het witte gedeelte achter in de mond duidelijk te identificeren en richt je op de luchtpijp van de muis.
  7. Kantel de metalen sondenaald verticaal boven de muis en steek deze aan de bovenkant van de luchtpijp in. Er kan een lichte weerstand zijn tijdens het passeren van de epiglottis.
  8. Schuif de sondenaald naar beneden in de luchtpijp, verwijder de nylon clip of stop en doseer 50 μL agarkraal ingebedde M. abscessus.
  9. Laat de muis 5 minuten rusten en herhaal stap 4.2-4.8 een tweede keer. Het doel van een inoculatieprocedure in twee stappen is om te zorgen voor een reproduceerbare en diepe afzetting van het volledige inoculum in de long.
  10. Laat de infectie 24 uur voortduren, waarna de muis wordt geëuthanaseerd om bacteriële afzetting in de longen op te sommen.

Resultaten

Grootte en last van de kraal
Om agarkorrels en hun bacteriële belasting te visualiseren, werd het mCherry rood fluorescerende eiwit tot expressie gebracht onder de constitutieve Hsp60-promotor in de Mab-type stam ATCC 19977 en deze stam ingebed in agarkralen zoals hierboven beschreven. Figuur 1A toont het bereik van de kraalgrootte (schaalbalk = 200 μm). Figuur 1B toont de last van 6 onafhankelijke kralenpreparaten, die de reproduceerbaarheid van de beschreven procedure aantonen.

Uitplating van de doordrukking van de spuit en bacteriële implantatie na intratracheale inoculatie
De intratracheale inoculatie werd in twee stappen geoptimaliseerd. CFU/ml werd in het entmateriaal geteld voor en na het passeren van de glazen spuit om er zeker van te zijn dat er geen parel- of bacterieverliezen optraden wanneer de korrels door de spuit en de aangesloten buis gingen. Tabel 1 toont de initiële bacteriële titer van twee onafhankelijke parelpreparaten (onderzoek 1 en 2) en het aantal CFU dat wordt teruggewonnen per 100 ml 'doorgeduwde' monsters van een enkele spuitlading. Om parel- en bacterieverliezen te voorkomen, is een glazen spuit nodig die is aangesloten op een metalen buis. Agar-kralen hebben de neiging zich aan plastic oppervlakken te hechten.

CFU-telling in de tijd in het kralenpreparaat toonde aan dat de bacteriële belasting van de kralen gedurende 1 week stabiel bleef bij 4 °C, met een ~2-voudig verlies van bacteriële belasting per 2 weken en onaangetaste longafzetting. Vervolgens werden groepen van 5 tot 8 muizen geïnfecteerd met drie onafhankelijke kralenpreparaten om de reproduceerbaarheid van de intratracheale inoculatieprocedure te testen. Tabel 2 toont het aantal long-CFU's per muis, geteld 24 uur na infectie zoals beschreven.

Ten slotte werd de reproduceerbaarheid van de infectie tussen operators beoordeeld door drie groepen van 10 CD-1-muizen te infecteren, elk uitgevoerd door een andere operator. Long-CFU's die 24 uur na infectie worden opgesomd, worden weergegeven in figuur 2.

figure-results-1
Figuur 1: Pilotexperiment om de grootte van de kraal te beoordelen, de bacteriële belasting van M. abscessus te visualiseren en te kwantificeren. (A) Agarkorrels die M. abscessus ATCC 19977-stam bevatten, gemanipuleerd om het mCherry red fluorescerende eiwit tot expressie te brengen onder de constitutieve hsp60-promotor. Vijf μl kralensuspensie werd op een glasplaatje uitgespreid en afgebeeld met een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een camera (10x objectief). Elke rode stip is een fluorescerende bacteriële cel, ingesloten in agarkralen met een diameter van ~70-250 μm. (B) Bacteriële belasting, in CFU/ml, van 6 individuele kralenpreparaten die de reproduceerbaarheid van de methode aantonen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Reproduceerbaarheid van de infectie tussen operators. Groepen van 10 CD-1 vrouwelijke muizen werden intratracheaal geïnfecteerd door drie onafhankelijke operators zoals beschreven, met behulp van hetzelfde kralenpreparaat. Long-CFU's die 24 uur na infectie zijn opgesomd, worden weergegeven. O1, O2, O3: operatoren 1, 2 en 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

KVE/100 μL
Kralen voorbereidingProef 1Proef 2
1,13E+052.40E+05
Spuit push-through monster
11,14E+055.10E+05
21.36E+054.10E+05
39.30E+043.90E+05
49.80E+043.60E+05
51,14E+05
Gemiddeld1.11E+054.18E+05
SD1.69E+04 (15%)6.50E+04 (16%)

Tabel 1: Kolonievormende eenheden (CFU) per monster van 100 μL na het passeren van de glazen spuit en de metalen voedingsnaald.

Proef 1Proef 2Proef 3
Muis-IDLong CFU/muisMuis-IDLong CFU/muisMuis-IDLong CFU/muis
M-16.50E+03M-62.20E+05M-116.80E+04
M-21.10E+04M-72.70E+05M-121.70E+05
M-31.40E+04M-88.10E+04M-132.10E+05
M-43.20E+03M-91.40E+05M-144.40E+04
M-54.50E+03M-101.30E+05M-157.50E+04
M-161.01E+05
M-177.00E+04
M-185.80E+03
Gemiddeld7,84E+03Gemiddeld1,68E+05Gemiddeld9.30E+04
SD4.54E+03 (58%)SD7.57E+04 (45%)SD6.67E+04 (72%)

Tabel 2: Implantatie van agarkraal ingebed in M. abscessus in de longen van muizen 24 uur na inoculatie

Discussie

Om een gelijkmatige verdeling van bacteriën in de agarkorrels te garanderen, is het belangrijk om het gesmolten agar-bacteriemengsel gelijkmatig te suspenderen voordat het aan de oliefase wordt toegevoegd. De volumeverhouding tussen olie en agar-bacteriën is van cruciaal belang bij het beheersen van de korrelgrootte. Een hogere olie-tot-agarverhouding leidt tot de vorming van kleinere agarkorrels. Bij het mengen van de agar-bacteriesuspensie met de oliefase is temperatuurregeling van cruciaal belang. Het olie-agarmengsel moet warm genoeg zijn om emulgeren en druppelvorming mogelijk te maken, maar koel genoeg om de bacteriën niet te beschadigen. Door continu te roeren terwijl het mengsel wordt afgekoeld tot kamertemperatuur of lager, kunnen agardruppels zich vormen en stollen.

Een goede kalibratie van de roerplaat, de grootte van de roerstaaf en de vorm en grootte van de kolf zijn belangrijke determinanten van een uniforme vortex. Een roerstaaf in het midden van de kolf creëert een symmetrische draaikolk, wat zorgt voor een gelijkmatige menging. Een niet-gecentreerde roerstaaf kan leiden tot een onstabiele draaikolk, wat resulteert in onregelmatig gevormde kralen en de introductie van luchtbellen in de kralen. Real-time monitoring en aanpassing van de positie van de roerstaaf wordt aanbevolen. Het volume van de kolf moet in verhouding staan tot het volume van het olie-agarmengsel. Een kolf van 500 ml is ideaal voor het centrifugeren van een olie-agarmengsel van 90 ml, waardoor een zichtbare draaikolk ontstaat. Bij het gebruik van grotere kolven is het belangrijk om het volume van het olie-agarmengsel, de grootte van de roerder en de vortexsnelheid aan te passen om een evenwicht te bereiken tussen effectief mengen en stabiele vortex. Het handhaven van een consistente vortexsnelheid tijdens het proces en bij de bereiding van rupsen is van cruciaal belang voor de reproduceerbaarheid van batch tot batch.

Het bereidingsproces van de agarparel, met name de vortexsnelheid en de olie-agarverhouding, zijn aangepast van 16,22, met kleine aanpassingen. Schuifkrachten in de draaiende draaikolk produceren inherent kralen van verschillende groottes. Om deze variabiliteit in grootte te minimaliseren, werd de stap voor het oogsten van kralen gewijzigd door verschillende wasstappen te introduceren, waarbij een gradiënt van afnemende centrifugatiesnelheid en -tijd werd gebruikt om ervoor te zorgen dat kleine kralen (en vrije bacteriën) worden verwijderd. Een micro-mesh-filter werd gebruikt om kralen van de gewenste grootte te verrijken, waardoor grotere kralen en kralen die mogelijk zijn gevormd door willekeurige samensmelting, effectief worden uitgefilterd. Om verlies van kralen of bacteriën te voorkomen wanneer de kralenslurry door de spuit en de aangesloten buis gaat voor intratracheale inoculatie van de muis, is het van cruciaal belang om een glazen spuit, 24 G metalen voedingsnaalden en een metalen slang te gebruiken.

De belangrijkste beperking van de methode is de technische complexiteit van de parelvoorbereiding en intratracheale inoculatie om een reproduceerbare parelbelasting en longimplantatie te bereiken. Aandacht voor detail en de mogelijkheid om problemen op te lossen zijn vereist. Bovendien is het model niet volledig gevalideerd door het testen van de werkzaamheid van standaardbehandeling van antibiotica en de meest frequente antibioticacombinaties die aan Mab-patiënten worden toegediend.

Momenteel is er geen muismodel van chronische Mab-infectie gevalideerd in die mate dat de werkzaamheid van enkelvoudige middelen en geneesmiddelcombinaties bij patiënten redelijkerwijs kan worden voorspeld door model9. Het in agar kralen ingebedde C57BL/6-muissysteem is gebruikt om de werkzaamheid van antimicrobiële behandelingen te testen 15,19,23. Het dichtstbijzijnde alternatief voor het in agar kralen ingebedde C57BL/6-muissysteem is het C3HeB/FeJ-muismodel, dat vertrouwt op dexamethason-immunosuppressie om een duurzame chronische infectie te bereiken24,25. De voordelen van het hier beschreven protocol zijn dat (i) volledig immunocompetente en meest betaalbare C57BL/6-muizen kunnen worden gebruikt, (ii) een productieve en chronische infectie kan worden verkregen met de goed gekarakteriseerde typestam ATCC 19977, en (iii) er geen chemisch geïnduceerde immunosuppressievereiste is, waardoor de noodzaak van dagelijkse dexamethason-injecties wordt omzeild, waardoor mogelijke geneesmiddelinteracties en impact op de longimmunopathologie worden vermeden.

Gezien het gebrek aan gevalideerde muismodellen van chronische Mab-infectie om nieuwe kandidaat-geneesmiddelen en geneesmiddelregimes te evalueren 8,9, heeft de hier beschreven techniek het potentieel om het veld vooruit te helpen, de voorspellende waarde van preklinische werkzaamheidsgegevens te verbeteren, te helpen bij het prioriteren van medicijnregimes met het hoogste potentieel om duurzame genezing te bieden en in het algemeen de ontdekking en ontwikkeling van geneesmiddelen voor Mab-longziekte te versnellen. De methode kan worden toegepast op andere longpathogenen en heeft een gevestigde staat van dienst voor P. aeruginosa of Haemophilus influenza. Het belangrijkste doel van het hier beschreven protocol is om voldoende details en aanbevelingen te verstrekken om een gemakkelijke implementatie en een uitstekende reproduceerbaarheid van lab tot lab te garanderen.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflict

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door de Cystic Fibrosis Foundation, award DICK24XX0, aan TD en VD, en R01-AI132374 van NIH-NIAID aan TD en VD.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
125-mL flesCorning8388Sterieel
3 x 3 buisjeshouderFisher5972-0030PKGedesinfecteerd voor gebruik
3D geprinte muisstandaardTransworld Marketing op maat ontworpen en geproduceerdGedesinfecteerd voor gebruik
48-wel plate voor verdunningCelltreat 229192Sterieel
50-mL centrifugeerbuizenGreiner Bio-One227261Sterieel
Anesethia-machineE-Z SystemsEZ-AF9000 SYSTEMn/a
Avanti J-15R Beckman Coulter B99517Centrifuge
Barrier Pipette Tips in Lift-off Lid Rack 1000GThermo Scientific ART 21-236-2ASterieel
Biohazard-zakFisherbrand22-044561
Connectorring pluriSelect41-50000-03
Wattenstaafjes met katoenen puntPuritan 22-029-571Sterieel
Beschikbare inoculatieschrapers Geel Sterieel 100 in ritssluitingszakCole-Parmer Essentials 03-391-562Sterieel
Beschikbare poly-gelamineerde doekDynarex19-310-671Sterieel
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineThomas Scientific21-031-CMSterieel
TrechterpluriSelect42-50000Sterieel
GE Ultrospec 10Sigma-AldrichGE80211630Spectrofotometer
Gentlemacs Tissue DissociatorMiltenyi Biotec130-096-427Niet hitte geactiveerd
Hamilton-spuit Hamilton 80801Gedesinfecteerd voor gebruik
Zware minerale olieSigma-Aldrich330760-1LSterieel
Isofluraanoplossing 250 ml flesCovetrus29405Huidcorrosie/-irritatie: categorie 2, Ernstig oogletsel/oogirritatie: categorie 2A, Specifiek toxische werking voor bepaalde organen (éénmalige blootstelling): categorie 3
Kan slaperigheid en duizeligheid veroorzaken, veroorzaakt ernstige oogirritatie, veroorzaakt huidirritatie. Niet inhaleren, gebruik in goed geventileerde ruimte.
M-buizen (gentleMACS)Miltenyi Biotec130-096-335Sterieel
Magneetschudden MR Hei-Connect Heidolph505-40000-13-1
MagneetschudbeugelThomas Scientific 1181L08Sterieel
Mechaans Pipet 100–1000 µL Gilson PIPETMAN L FA10006MGedesinfecteerd voor gebruik
Mechaans Pipet 20–200 µL Gilson PIPETMAN L FA10003MGGedesinfecteerd voor gebruik
Metaal Animal Feeding Needle 24 GBraintree ScientificN-VP 24G-1SMoet worden gesteriliseerd (geautoclaveerd)
Middlebrook 7H10 AgarSigma-AldrichM0303-500GGesteriliseerd (geautoclaveerd)
Middlebrook 7H11 AgarThermo FisherR4554002Gesteriliseerd (geautoclaveerd)
Middlebrook 7H9 mediumBeckton Dickinson271310Gesteriliseerd (geautoclaveerd)
Muis standaard onderdelenTriMech Solutions SRV-AMS-FDMGedesinfecteerd voor gebruik
Niet absorberende zijde hechtdraadFisher Scientific18020-50n/a
OADC vloeibare verrijking voor gebruik met Middlebrook-media 500 mlThermo Scientific Remel R450605Sterieel
PBS (10x), pH 7.4 Sterieel gefilterd 500 mLGibco70-011-044Sterieel
Peroxiguard-doekjesPeroxigard29221n/a
Petrischalen met helder deksel Rond 100mmx 15mmFisherbrand FB0875712Sterieel
PluriStrainer 200 mmpluriSelect43-50200-03Sterieel; celzeef
Roller-flessenCorning430165Sterieel
Serologische pipetCorning4489Sterieel
Spectrofotometercuvettes 1.5 mLFisher Scientific14955127Gesteriliseerd (geautoclaveerd)
Spuitstoppen of klemmen (nylon)Trimech SRV-AMS-MJFGedesinfecteerd voor gebruik
Tryptische sojabouillonSigma-AldrichT8907-500GSterieel
Tween 80 Fisher170793Gefilterd gesteriliseerd 
Wide Bore Filtered Pipette Tips Lift-off Lid Rack 200G Thermo Scientific ART21-236-1ASterieel

Referenties

  1. Dartois, V., Dick, T. Drug development challenges in nontuberculous mycobacterial lung disease: Tb to the rescue. J Exp Med. 219 (6), e20220445(2022).
  2. Martiniano, S. L., Nick, J. A., Daley, C. L. Nontuberculous mycobacterial infections in cystic fibrosis. Clin Chest Med. 43 (4), 697-716 (2022).
  3. Maurer, F. P., et al. Lack of antimicrobial bactericidal activity in mycobacterium abscessus. Antimicrob Agents Chemother. 58 (7), 3828-3836 (2014).
  4. Wu, M. L., Aziz, D. B., Dartois, V., Dick, T. Ntm drug discovery: Status, gaps and the way forward. Drug Discov Today. 23 (8), 1502-1519 (2018).
  5. Egorova, A., Jackson, M., Gavrilyuk, V., Makarov, V. Pipeline of anti-mycobacterium abscessus small molecules: Repurposable drugs and promising novel chemical entities. Med Res Rev. 41 (4), 2350-2387 (2021).
  6. Nuermberger, E. Using animal models to develop new treatments for tuberculosis. Semin Respir Crit Care Med. 29 (5), 542-551 (2008).
  7. Nuermberger, E. L. Preclinical efficacy testing of new drug candidates. Microbiol Spectr. 5 (3), (2017).
  8. Nicola, F., Cirillo, D. M., Lore, N. I. Preclinical murine models to study lung infection with mycobacterium abscessus complex. Tuberculosis (Edinb). 138, 102301(2023).
  9. Dartois, V., et al. Preclinical murine models for the testing of antimicrobials against mycobacterium abscessus pulmonary infections: Current practices and recommendations. Tuberculosis (Edinb). 147, 102503(2024).
  10. Obregon-Henao, A., et al. Susceptibility of mycobacterium abscessus to antimycobacterial drugs in preclinical models. Antimicrob Agents Chemother. 59 (11), 6904-6912 (2015).
  11. Lerat, I., et al. In vivo evaluation of antibiotic activity against mycobacterium abscessus. J Infect Dis. 209 (6), 905-912 (2014).
  12. Saliu, F., et al. Chronic infection by nontypeable haemophilus influenzae fuels airway inflammation. ERJ Open Res. 7 (1), (2021).
  13. Rodgers, A. M., et al. Biologically relevant murine models of chronic pseudomonas aeruginosa respiratory infection. Pathogens. 12 (8), 1053(2023).
  14. Hoover, J. L., et al. A robust pneumonia model in immunocompetent rodents to evaluate antibacterial efficacy against s. Pneumoniae, h. Influenzae, k. Pneumoniae, p. Aeruginosa or a. Baumannii. J Vis Exp. (119), e55068(2017).
  15. Lore, N. I., et al. The aminoglycoside-modifying enzyme eis2 represents a new potential in vivo target for reducing antimicrobial drug resistance in mycobacterium abscessus complex. Eur Respir J. 60 (6), 2201541(2022).
  16. Riva, C., et al. A new model of chronic mycobacterium abscessus lung infection in immunocompetent mice. Int J Mol Sci. 21 (18), 6590(2020).
  17. Chang, V., Phillips, P. P. J., Imperial, M. Z., Nahid, P., Savic, R. M. A comparison of clinical development pathways to advance tuberculosis regimen development. BMC Infect Dis. 22 (1), 920(2022).
  18. Yang, S. J., et al. Pathological granuloma fibrosis induced by agar-embedded mycobacterium abscessus in c57bl/6jnarl mice. Front Immunol. 14, 1277745(2023).
  19. Poerio, N., et al. Combined host- and pathogen-directed therapy for the control of mycobacterium abscessus infection. Microbiol Spectr. 10 (1), e0254621(2022).
  20. Pearce, C., et al. Inhaled tigecycline is effective against mycobacterium abscessus in vitro and in vivo. J Antimicrob Chemother. 75 (7), 1889-1894 (2020).
  21. De Groote, M. A., et al. Gm-csf knockout mice for preclinical testing of agents with antimicrobial activity against mycobacterium abscessus. J Antimicrob Chemother. 69 (4), 1057-1064 (2014).
  22. Facchini, M., De Fino, I., Riva, C., Bragonzi, A. Long term chronic pseudomonas aeruginosa airway infection in mice. J Vis Exp. (85), e51019(2014).
  23. Degiacomi, G., et al. The novel drug candidate vomg kills mycobacterium abscessus and other pathogens by inhibiting cell division. Int J Antimicrob Agents. 64 (4), 107278(2024).
  24. Rimal, B., et al. T405, a new penem, exhibits in vivo efficacy against m. Abscessus and synergy with beta-lactams imipenem and cefditoren. Antimicrob Agents Chemother. 66 (6), e0053622(2022).
  25. Maggioncalda, E. C., Story-Roller, E., Ammerman, N. C., Nuermberger, E. L., Lamichhane, G. Progressive mycobacterium abscessus lung infection in c3heb/fej mice associated with corticosteroid administration. bioRxiv. , (2018).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Bereiding van agar beadsintratracheale inoculatiechronische longinfectiepulmonaal infectiemodeltesten van antibioticageficaciebacteri le enumeratiemuisinfectieprotocolpreklinische geneesmiddelentesten

Gerelateerde artikelen