Iteratief bleken breidt de veelheid uit met behulp van kleurautomatisering voor kernfaciliteiten

Samenvatting

Hier beschrijven we de toepassing van de Iterative Bleaching Extend Multiplicity (IBEX)-methode met behulp van in de handel verkrijgbare, geautomatiseerde weefselkleurers en optimalisatieoverwegingen voor het gebruik van op tyramidesignaalversterking gebaseerde reagentia.

Samenvatting

Iterative Bleaching Extend Multiplicity (IBEX) is een zeer gevoelige tyramidesignaalversterking (TSA)-gebaseerde multi-round fluorescentiebeeldvormingstechniek die gedetailleerd onderzoek van talrijke eiwitbiomoleculen in een enkel weefselmonster mogelijk maakt door middel van herhaaldelijk bleken, opnieuw kleuren en co-registratie van afbeeldingen. Ondanks de groeiende acceptatie voor het genereren van sterk gemultiplexte immunokleuring, biedt de implementatie van IBEX op een geautomatiseerde manier door implementatie in kernfaciliteiten tal van voordelen, waaronder een verhoogde doorvoer, reproduceerbaarheid en algehele efficiëntie van laboratoriumpersoneel. Hier demonstreren we de succesvolle toepassing van IBEX op twee veelgebruikte autostainerplatforms en bespreken we belangrijke optimalisatieoverwegingen voor paneelontwerp met behulp van TSA-gebaseerde reacties voor formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) weefselmonsters. Dit omvat de methodologie voor het testen van de gevoeligheid voor het ophalen van antilichamen, een belangrijke overweging voor het ontwerp van IBEX-panelen bij het bepalen van de volgorde van de ontwikkeling van antilichamen. Daarnaast demonstreren we downstream-beeldvormingsbenaderingen met behulp van in de handel verkrijgbare scanners voor hele dia's en illustreren we kwaliteitsafstemming en -analyse met behulp van in de handel verkrijgbare software voor celfenotypering. Door middel van gedetailleerde beschrijvingen van deze methodologieën en begeleidende video's willen we de veelzijdigheid en het gemak van IBEX benadrukken en praktische richtlijnen bieden voor kernpathologiefaciliteiten om IBEX te integreren in hun bestaande geautomatiseerde kleuringsplatforms.

Inleiding

Iterative Bleaching Extend Multiplicity (IBEX) is een belangrijke vooruitgang in de zeer gevoelige, op TSA gebaseerde, multi-round fluorescerende immunohistochemie, waardoor gedetailleerde visualisatie en kwantificering van talrijke biomoleculen in een enkel weefselmonster mogelijk is. Door gebruik te maken van herhaalde cycli van bleken en opnieuw kleuren, maakt IBEX het mogelijk om complexe cellulaire omgevingen te onderzoeken met een ongeëvenaarde diepte en helderheid, waardoor het een krachtig hulpmiddel is op het gebied van immunokleuring en multiplexed beeldvorming ^1,2.

Veel academische, overheids- en industriële entiteiten hosten kernpathologiefaciliteiten die zich toeleggen op het ondersteunen van een breed scala aan op weefsel gebaseerde onderzoeksmethodologieën die gericht zijn op het genereren van kwalitatieve en kwantitatieve morfomoleculaire datasets. Deze kernen zijn kritieke bronnen en bieden gespecialiseerde op weefsel gebaseerde diensten waarmee onderzoekslaboratoria complexe en arbeidsintensieve moleculaire pathologieprocessen kunnen uitbesteden en rechtstreeks met pathologen kunnen overleggen bij het ontwerpen van onderzoeken, het ontwikkelen van tests en het interpreteren van gegevens. Om consistentie te garanderen en de variabiliteit tussen experimenten te verminderen, vertrouwen deze kernfaciliteiten routinematig op in de handel verkrijgbare autostainers-geautomatiseerde instrumenten die zijn ontworpen om gestandaardiseerde kleuringsprotocollen uit te voeren met een hoge reproduceerbaarheid en efficiëntie³.

Hoewel autostainers de ruggengraat zijn geworden van immunokleuring in kernfaciliteiten, waardoor een hoge doorvoer en consistente resultaten mogelijk zijn, zijn ze nog niet aangepast om plaats te bieden aan recentere ontwikkelingen zoals IBEX. Bovendien voegt de behoefte aan gespecialiseerde kennis op het gebied van paneelontwerp, met name bij het gebruik van op tyramide signaalversterking (TSA) gebaseerde reagentia⁴, een extra laag complexiteit toe, waardoor de bredere acceptatie van IBEX in routinematige onderzoeksworkflows wordt beperkt. Als gevolg hiervan kunnen onderzoekers die willen profiteren van de gemultiplexte beeldvormingsmogelijkheden van IBEX met hoge resolutie, vaak worden beperkt door de bestaande apparatuur van hun kernfaciliteiten. Deze kloof tussen innovatieve beeldvormingstechnieken en de praktische realiteit van de kernactiviteiten van faciliteiten wijst op een barrière voor de bredere acceptatie van IBEX in academisch onderzoek. Dit werk heeft tot doel deze barrière aan te pakken door de succesvolle toepassing van IBEX op gangbare autostainerplatforms aan te tonen, met de nadruk op het gebruik van op TSA gebaseerde reagentia met behulp van formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) weefsels. We bespreken eerst de stappen die nodig zijn om een IBEX-paneel te bouwen met behulp van op TSA gebaseerde kleurstoffen, en de toepassing van deze panelen op twee verschillende in de handel verkrijgbare autostainers. Samen biedt dit praktische richtlijnen voor het testen van de gevoeligheid voor het ophalen van antilichamen en antigeen, het bespreken van belangrijke overwegingen voor het optimaliseren van het paneelontwerp en het bieden van een alternatieve methode voor paneeluitlijning met behulp van commerciële software die mogelijk beschikbaar is en via kernpathologielaboratoria.

Protocol

1. Bouw van IBEX-panelen met kleurstoffen op basis van TSA

OPMERKING: Gebruik altijd een vers preparaat van antilichamen en kleurstoffen en bewaar bij 4 °C wanneer niet in gebruik.

1. Gevoeligheidstesten voor het ophalen van antigeen
   1. Voorbereiding van dia's
      1. Gebruik een microtoom om drie seriële secties voor elk antilichaam te verzamelen om te testen van hetzelfde FFPE-ingebedde weefsel op drie afzonderlijke, positief geladen objectglaasjes.
      2. Label dia's met het te testen antilichaam, samen met het aantal te testen antigeenophaalcycli: 1 cyclus, 3 cycli en 6 cycli.
      3. Droog de objectglaasjes een nacht op kamertemperatuur. Als u alleen met oppervlaktemarkers werkt, bak dan de glaasjes op 60 ^°C gedurende ten minste 20 minuten om de was zachter te maken. Als u met nucleaire markers werkt, bak de dia's dan een nacht op 60 ^°C.
   2. Bereid het programma op de autostainer voor op het verschillende aantal cycli en zorg ervoor dat er drie wasstappen tussen elke stap zijn. Zie Tabel 1 voor bijvoorbeeld protocollen voor tests met 1, 3 en 6 cycli.
      OPMERKING: Zorg voor elk afzonderlijk antilichaam voor een consistente tijd voor de antilichaamstap en het aanbrengen van de TSA-kleurstof.
      Voor verftoepassingen op TSA-basis is een alternatief voor het 3-10 minuten laten incuberen van de kleurstof bij kamertemperatuur om de kleurstof 20 minuten bij 37 °C te laten incuberen.
   3. Laad de monsters op de autostainer en voer het protocol uit voor het bijbehorende aantal cycli.
   4. Herhaal dit proces van stap 1.1.1 tot 1.1.3 voor elk afzonderlijk antilichaam dat moet worden gevalideerd en getest.
   5. Verwijder de dia's uit de autostainer en plaats ze in PBS.
   6. Monteer de dia's met waterige montagemedia (hetzelfde als voor een IBEX-ronde) en een #1.5 dekglaasje voor een optimale beeldvorming.
   7. Gebruik een epifluorescentiemicroscoop om het diaglaasje met 1 cyclus voor de TSA-kleurstof en DAPI af te beelden, noteer de belichtingstijd die nodig is om het signaal te visualiseren.
   8. Herhaal dit voor de dia's met 3 cycli en 6 cycli en noteer de belichtingstijd die nodig is om de TSA-kleurstof te visualiseren.
   9. Vergelijk de belichtingstijden voor de verschillende cyclusnummers. Zie Figuur 1 voor voorbeelden. Zorg voor drie wascycli tussen alle stappen.
      1. Als de belichtingstijd afneemt met verhoogde cycli, plaats dan dit antilichaam en deze kleuring in een latere stap.
      2. Als de blootstellingstijd toeneemt met verhoogde cycli, plaats dit antilichaam dan in een eerdere stap.
      3. Als er geen grote verandering in de blootstellingstijd is, plaats dit antilichaam dan op elk stap.
      4. Groepsantilichamen op basis van cyclusvereisten voor de eerste doorgang bij IBEX-panelen.
         OPMERKING: Voor de beste resultaten voert u deze validatie uit op alle gewenste markeringen voor een bepaald IBEX-paneel. Voer deze validatie uit telkens wanneer weefseltypen worden gewijzigd of wanneer u werkt met polyklonale primaire antilichamen met unieke lotnummers.
2. Adresseer het doorbloeden van het signaal van spectraal nabijgelegen kleurstof door beoordeling van de signaalsterkte.
   1. Groepeer antilichamen in potentiële IBEX-panels op basis van het optimale aantal ophaalcycli, zoals van bovenaf bepaald, in groepen van 1, 3 of 6 cycli.
   2. Voorbereiding van dia's
      1. Gebruik een microtoom om seriële secties te maken van een FFPE-monster, één voor elk antilichaam om te gebruiken in een enkel IBEX-paneel.
      2. Label elk objectglaasje met een van de antilichamen die in het IBEX-paneel moeten worden gebruikt.
      3. Laat de glaasjes een nacht drogen bij kamertemperatuur. Als u alleen met oppervlaktemarkers werkt, laat de dia's dan minstens 20 minuten op 60 ^°C bakken om de was zachter te maken. Als u met nucleaire markers werkt, laat de dia's dan een nacht op 60 ^°C bakken.
   3. Gebruik voor de groep 1, 3 en 6 cycli de instelling met één cyclus uit tabel 1. Zorg voor drie wasbeurten tussen alle stappen
      1. Wijzig het protocol voor elk antilichaam dat moet worden gebruikt met de optimale kleuringstijd.
      2. Gebruik dezelfde TSA-tijd voor alle antilichamen.
   4. Vlek de monsters op de autostainer.
   5. Verwijder de monsters en plaats de dia's in PBS.
   6. Monteer de dia's met waterige montagemedia (hetzelfde als voor een IBEX-ronde) en een #1.5 dekglaasje voor een optimale beeldvorming.
   7. Maak een afbeelding van de dia's op een epifluorescentiemicroscoop met een optimale belichtingstijd voor elk beeld.
   8. Bepaal de signaalsterkte. Dia's met korte belichtingstijden hebben een zeer hoge signaalsterkte, terwijl dia's met een lange belichtingstijd een lage signaalsterkte hebben.
   9. Gebruik de signaalsterkte samen met het cyclusnummer om IBEX-panelen te ontwikkelen.
      1. Groepeer antilichamen op basis van cyclusnummer.
      2. Zorg er voor een bepaalde groep antilichamen met een specifiek cyclusnummer voor dat een sterk signaal niet optisch dicht bij een zwak signaal ligt om de overloop van het signaal te minimaliseren.
3. Valideer de afzonderlijke IBEX-panels om er zeker van te zijn dat elk panel het gewenste resultaat kan genereren.
   1. Bereid de dia's voor.
      1. Gebruik een microtoom om seriële secties te maken, één voor elk multiplex IBEX-paneel, en label met de IBEX-paneelvolgorde die moet worden gebruikt.
      2. Laat de glaasjes een nacht drogen bij kamertemperatuur. Als u alleen met oppervlaktemarkers werkt, laat de dia's dan minstens 20 minuten op 60 ^°C bakken om de was zachter te maken. Als u met nucleaire markers werkt, laat de dia's dan een nacht op 60 ^°C bakken.
   2. Stel de autostainer in.
      1. Stel voor het eerste paneel het autostainer-programma in zonder extra stappen voor het ophalen van antigeen.
      2. Voer voor het tweede paneel extra denaturatiestappen uit vóór het eerste antilichaam die gelijk zijn aan het aantal denaturatiestappen in het eerste paneel. Zie Tabel 2 voor een voorbeeldpaneel 1 met vijf antilichamen, en Tabel 3 voor een voorbeeldpaneel 2 met vier antilichamen. Zorg voor drie wasstappen tussen alle stappen.
      3. Herhaal indien nodig voor extra IBEX-panelen en voeg meer denaturatiestappen toe.
   3. Verwijder de dia's van de autostainer en plaats ze in PBS totdat ze klaar zijn om te monteren.
   4. Monteer de dia's met waterige montagemedia (hetzelfde als voor een IBEX-ronde) en een #1.5 dekglaasje voor een optimale beeldvorming.
   5. Beeld de dia's af op een epifluorescentiemicroscoop met behulp van de optimale belichtingstijd voor elk beeld en elke TSA-kleurstof.
   6. Beoordeel of alle deelvensters correct worden weergegeven. Als dat zo is, ga dan verder met IBEX-beeldvorming. Als dit niet het geval is, moet u de cycli voor het balanceren en ophalen van signalen opnieuw aanpakken.
      OPMERKING: Sommige aanpassingen kunnen binnen een enkel paneel worden gemaakt om het signaal te optimaliseren en het "paraplu-effect" te voorkomen. Sommige zeer overvloedige signalen kunnen de kleuring van stroomafwaartse signalen blokkeren. Kijk binnen een bepaald paneel om eerst meer spaarzaam aanwezige vlekken te gebruiken (zie figuur 2).

2. IBEX-adaptatie met autostainers met behulp van TSA-reagentia en beeldvormingsplatforms voor hele objectglaasjes (Figuur 3)

OPMERKING: Voor vergelijking van de twee gevalideerde autostainers die in dit protocol worden gebruikt en besproken, zie Tabel 4.

1. Bereid alle dia's voor op de IBEX-run.
   1. Gebruik een microtoom om FFPE-secties te maken op een positief geladen dia. Zorg ervoor dat u voor elk experimenteel monster één objectglaasje bijvoegt, positieve controleglaasjes van weefselsecties waarvan bekend is dat ze de te beelden antigenen bevatten, en een negatief controleglaasje waarin PBS wordt gebruikt in plaats van alle primaire antilichamen.
      OPMERKING: Als u in batches werkt, voeg dan een batchcontrolemonster toe. Een batchcontrolemonster is een enkel FFPE-weefselblok dat wordt doorgesneden en opgenomen in elke batch experimentele monsters voor gebruik bij normalisatie en controle van experimentele variatie tussen batches kleuringsmonsters. Dit is alleen nodig als niet alle monsters samen worden verwerkt.
   2. Laat de glaasjes een nacht drogen bij kamertemperatuur. Als u alleen met oppervlaktemarkers werkt, laat de dia's dan minstens 20 minuten op 60 ^°C bakken om de was zachter te maken. Als u met nucleaire markers werkt, laat de dia's dan een nacht op 60 ^°C bakken.
2. Bereid antilichamen en kleurstoffen voor op het eerste IBEX-paneel dat in beeld wordt gebracht.
3. Stel het autokleuringsprogramma in. Zie Tabel 2 voor een voorbeeld van een paneel met 5 markeringen. Zorg voor drie wasbeurten tussen elke stap.
4. Laad monsters en antilichamen in de autostainer en voer het programma uit om de monsters te kleuren.
5. Verwijder de objectglaasjes van de autostainer en breng een dekglaasje aan met behulp van waterige montagemedia die geschikt zijn voor multispectrale beeldvorming en een #1.5 dekglaasje.
6. Maak foto's van de objectglaasjes binnen 2 dagen na het kleuren
7. Fluorescentiebeeldvorming op epifluorescentie- of fluorescentiediascanner
   1. Begin met het goed gecontroleerde positieve controlemonster en laad het positieve controlemonster in de microscoop.
      1. Zoek een positief signaal in het monster voor elk van de verschillende antigenen die moeten worden afgebeeld.
      2. Stel de belichtingstijd in om ervoor te zorgen dat het dynamische bereik van de vlek wordt vastgelegd, terwijl de achtergrond wordt geminimaliseerd door te beginnen met een lage belichting en de belichtingstijd geleidelijk te verlengen totdat het signaal aanwezig is. Doe dit voor elke kleurstof afzonderlijk.
         OPMERKING: Test op de aanwezigheid van zowel hoge als lage expressie van de markeringen om ervoor te zorgen dat het volledige dynamische bereik wordt vastgelegd.
   2. Sla de instellingen op die voor het positieve controlemonster zijn gebruikt en gebruik deze voor alle verdere beeldvormingsstappen.
   3. Laad het negatieve controlemonster en alle experimentele monsters en maak er een afbeelding van met behulp van de instellingen die zijn bepaald door het positieve controlemonster.
   4. Controleer of de afbeeldingen van optimale kwaliteit zijn voordat u doorgaat met de volgende stappen.
8. Dekglaasje verwijderen
   1. Dompel dia's onder in een Coplin-pot met gedemineraliseerd water. Plaats de Coplin pot in een waterbad dat is ingesteld op 65 °C gedurende 15-20 minuten om de natuurlijke verwijdering van het dekglaasje te vergemakkelijken. Als alternatief, als een montagemedium op waterbasis wordt gebruikt of als het montagemedium volledig is uitgehard, verwijder dan dekglaasjes door ze een nacht te weken in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of gedemineraliseerd water om dekglaasjes er op natuurlijke wijze af te laten vallen.
9. Bleken met LiBH₄
   1. Bereid in een zuurkast een verse oplossing van LiBH₄ in een concentratie van 1 mg/ml in gedemineraliseerd water. Maak genoeg om elk monster 3x te bedekken.
      OPMERKING: Bereid niet meer dan 10 ml per keer vanwege de reactie van LiBH₄ met water. Gebruik DI-water en geen Millipore/nanopuur water voor een optimale bleekactiviteit.
   2. Laat de oplossing 20 minuten rusten. Er zullen zich bubbels vormen.
   3. Pipetteer 1 ml LiBH_4-oplossing op elk objectglaasje in een kleurkamer in een zuurkast. Laat de oplossing 10-15 minuten op het glaasje rusten.
   4. Verwijder de LiBH₄ door van de schuif te pipetteren en vervang deze door een verse 1 ml LiBH_4. Laat de oplossing 10-15 minuten rusten.
   5. Verwijder de LiBH₄ door van de schuif te pipetteren en vervang deze door een verse 1 ml LiBH_4. Laat de oplossing 10-15 minuten rusten.
   6. Verwijder de LiBH₄ uit de objectglaasjes door te pipetteren en dompel de objectglaasjes onder in DI-water of PBS voor kortstondige opslag (niet langer dan 1 dag).
   7. Ga binnen een dag over op de volgende IBEX-kleuringsronde.
   8. Optioneel: dia's nat monteren en een snelle visualisatie uitvoeren op een epifluorescentiescoop om het succes van het bleken te verifiëren.
10. Natte montage van de dia in de autostainer en tweede IBEX-kleuringsrun
    1. Bereid alle antilichamen en TSA-kleurstofoplossingen voor op de autostainer.
    2. Voor de Ventana autostainer:
       1. Wanneer u klaar bent om te beginnen met automatisch kleuren, pipetteert u ongeveer 1 ml autostainer-wasbuffer op de dia om uitdroging van de natte houder te voorkomen.
       2. Laad nat gemonteerde dia's in de autostainer.
    3. Voor de Bond Rx:
       1. Plaats afdektegels op dia's.
       2. Pipetteer aan de bovenkant van de dektegel 300 μL wasbuffer om de oplossing in de ruimte tussen het monster en de dektegel te laten stromen.
       3. Laad monsters op de autostainer.
    4. Stel het autostainer-programma in volgens het voorbeeld in tabel 2 , waarbij N is ingesteld op het aantal antilichamen in het paneel.
    5. Verwijder de objectglaasjes van de autostainer en breng een dekglaasje aan met behulp van waterige montagemedia die geschikt zijn voor multispectrale beeldvorming en een #1.5 dekglaasje.
    6. Maak een afbeelding van de objectglaasjes binnen 2 dagen na het kleuren volgens de voorbeeldprocedure beschreven in stap 2.7 voor het opzetten van de beeldvormingssessie en het verzamelen van afbeeldingen.
    7. Bleekmonsters na beeldvorming zoals beschreven in stap 2.8-2.9.
11. Herhaal dit voor alle gewenste IBEX-panelen.

3. Analyse van monsters met in de handel verkrijgbare software

1. Maak volledige scans van de bevlekte dia's voordat u overgaat tot uitlijning.
2. Als de software dit toestaat, voert u spectrale ontmenging uit via de geautomatiseerde ontmengingsfunctie die in de scanfuncties is ingebouwd, inclusief het verwijderen van de autofluorescentiespectra. Als dit een functie is van de software die wordt gebruikt, selecteert u de optie voor ontmengen en voert u uit met behulp van standaardinstellingen en vooraf ingestelde kleurstoffen
   OPMERKING: Aangepaste ontmenging kan worden gegenereerd in de meeste software die ontmenging mogelijk maakt. Om een bibliotheek te maken, worden individuele weefselsecties die zijn gekleurd met een enkele fluorofoor toegevoegd aan de metingen van de software. Een gebied van ongekleurd of autofluorescerend weefsel wordt ook gescand om het autofluorescentiespectrum te karakteriseren, en dit wordt geselecteerd met de autofluorescentietool. Deze spectra worden in het programma gecompileerd door op "afbeelding voorbereiden" te drukken en vervolgens geëxporteerd naar een projectspecifieke ontmengingsbibliotheek. Deze bibliotheek wordt vervolgens geselecteerd als de ontmengingsbibliotheek in de ontmengingsoptie.
3. Importeer de gescande dia's in commercieel verkrijgbare beeldanalysesoftware voor uitlijning.
4. Diaregistratie van meerdere IBEX-rondes
   1. Selecteer twee iteraties van IBEX-rondes die u wilt registreren.
   2. Klik met de rechtermuisknop op de twee en selecteer de optie Registreren .
   3. Selecteer de standaardregistratie met registratie in hoge resolutie voor een eerste poging tot registratie.
   4. U kunt ook Single Channel Registration selecteren in de opties en één kanaal selecteren dat consistent was in alle IBEX-runs.
      OPMERKING: Deze optie is handig voor kleurstoffen die bestand zijn tegen bleken (zie materialen waarvoor kleurstoffen niet bleken).
5. Uitlijning van afbeeldingen
   1. Open een van de geregistreerde afbeeldingen.
   2. Selecteer op het tabblad Extra onder Afbeeldingsregistratie de optie Registratietools om alle geregistreerde afbeeldingen te openen.
   3. Selecteer op het tabblad Registratiehulpmiddelen de oriëntatiepuntfunctie.
   4. Gebruik de oriëntatiepuntfunctie om de uitlijning van hele dia's nauwkeurig af te stellen.
      1. Markeer oriëntatiepunten op één dia-afbeelding handmatig.
      2. Markeer op de andere IBEX-afbeeldingen hetzelfde oriëntatiepunt. Het programma verfijnt de uitlijning met behulp van het geïdentificeerde oriëntatiepunt. Herhaal dit voor fijnafstelling van de uitlijning.
   5. Als u tevreden bent met de uitlijning, smelt u de geleiders samen met behulp van de zekering | Seriële vlekfunctie.
   6. Herhaal dit proces met eventuele extra IBEX-beeldvormingsrondes totdat een definitieve samenstelling van alle afbeeldingen is voltooid.
6. Analyse van afbeeldingen
   1. Segmentatie van cellen
      1. Selecteer en open op het tabblad Analyse de HighPlex-module en selecteer vervolgens de fenotyperingsmodule voor celidentificatie.
         1. Laad alle markeringen en begin met het vinden van alle kernen met behulp van het tabblad Nucleaire detectie in de Highplex-module . Laad markeringen op het tabblad Kleurstofselectie . Identificeer cellen met behulp van de DAPI-kleuring.
         2. Schakel op het tabblad Analyseren de Real-Time Tuning-tool in met behulp van de volgende belangrijke parameters: Minimale nucleaire intensiteit ingesteld om achtergrondsignaal uit te filteren; Maximale beeldhelderheid ingesteld om de algehele zichtbaarheid van het signaal te regelen; Nucleaire segmentatie Agressiviteit ingesteld om de grenzen van gedetecteerde kernen te verfijnen.
         3. Stem elke parameter zorgvuldig af om een nauwkeurige segmentatie te garanderen.
   2. Detecteer het cytoplasma en de membraanmarkers.
      1. Navigeer naar het tabblad Membraan- en cytoplasmadetectie .
      2. Stel de minimale cytoplasmastraal in op een waarde die geschikt is voor het monster voor de verwachte grootte van de cellen.
      3. Geef onder de optie Membraankleurstoffen op welke kanalen membraanmarkeringen zijn.
         OPMERKING: Dit zou moeten resulteren in een betere segmentatie van individuele cellen voor verdere analyse.
   3. Markeringsdrempels en fenotypetoewijzing
      1. Stel voor elke markering de drempels in voor positieve versus negatieve signalen. Doe dit onder de tabbladen die voor elke markering zijn gegenereerd.
      2. Voer de handmatige drempelwaarde voor elke markering uit om populaties te identificeren.
      3. U kunt ook een op bio-informatica gebaseerde geautomatiseerde benadering van drempels gebruiken. In de geavanceerde | Objectgegevens (cel) opslaan, schakelt u de optie in op Waar. In export | Objectgegevens, exporteer de gegevensset om informatie over de markeringsexpressie voor elke geïdentificeerde cel op te halen.
      4. Importeer deze gegevens in aanvullende software voor verdere en op maat gemaakte analyse. Opties voor software voor verdere analyse zijn te vinden in Tabel 5.

Resultaten

We geven een voorbeeld van een IBEX-panel met op TSA gebaseerde reagentia op Autostainer 2 (Figuur 4). Elke marker kan duidelijk worden afgebakend en er is een minimale doorbloeding tussen de markers. Het beeld werd verzameld over twee kleuringsrondes. Het monster is longweefsel na infectie met Mycobacterium tuberculosis. De twee IBEX-kleuringspanelen werden uitgelijnd met behulp van in de handel verkrijgbare software. Met behulp van de IBEX-benadering met geoptimaliseerde TSA-reagentia (zoals hier beschreven) kan de ruimtelijke organisatie van immuuncellen, ontstekingsmarkers en gespecialiseerde longcellen worden gezien en gewaardeerd. Met de juiste optimalisatie kunnen markeringen gemakkelijk verschijnen met een minimale achtergrond.

Figuur 1: Testen van het ophalen van antigeen met een fluorofoor met een emissie van 520 nm van twee verschillende antigenen. RAGE en CD3e werden in beeld gebracht met behulp van geconserveerde belichtingstijden. Het epitoop van dit RAGE-antilichaam is zeer gevoelig en vatbaar voor het herhaaldelijk ophalen van antigeen, waarbij de testgevoeligheid snel afneemt en vervolgens antigeenextracties plaatsvinden. Omgekeerd verbetert de gevoeligheid van de CD3e-test met meerdere rondes van het ophalen van antigeen. Schaal balken = 50 μm. Afkorting: RAGE = Receptor for Advanced Glycation Endproducts. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Voorbeeld van het belang van sequentieontwikkeling ten opzichte van het paraplu-effect. RAGE is een marker die sterk tot expressie komt in AT1-cellen en in combinatie met CD31 effectief de immunoreactiviteit van SARS-CoV-2 blokkeert. Wanneer SARS-CoV-2 IHC echter eerst wordt uitgevoerd, kunnen de signalen allemaal worden gevisualiseerd. Schaalbalken = 25 μm. Afkortingen: RAGE = Receptor for Advanced Glycation Endproducts; AT1 = Alveolair Type 1; SARS-CoV-2 = Ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2; IHC = Immunohistochemie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Overzicht van het proces met behulp van geautomatiseerde kleuringsapparatuur voor het IBEX-protocol. Natte montage voor ronde 2 of hoger van het kleuringsproces om uitdroging van het weefsel te voorkomen. Afkorting: IBEX = Iterative bleaching breidt de veelheid uit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Voorbeeld van IBEX met op TSA gebaseerde kleurstoffen van autostainer 2 op een long die is geïnfecteerd met Mycobacterium tuberculosis. Paneel 1 bevat alle kleurstoffen en paneel 2 bevat kleurstoffen die geschikt waren voor bleken. Er wordt een samengevoegd beeld gepresenteerd van alle kanalen over de volledige IBEX van het longbeeld. Schaalbalken = 200 μm. Afkortingen: IBEX = iteratief bleken breidt de veelheid uit; TSA = Tyramide Signaal Versterking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Een voorbeeldprotocol voor het valideren van de effecten van cyclusnummer op antilichamen voor 1-, 3- en 6-cyclustests. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Een voorbeeldpaneel 1 met vijf antilichamen voor de IBEX-autostainer voor paneelvalidatie. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Een voorbeeldpaneel 2 met vier antilichamen voor de IBEX-autostainer voor panelvalidatie. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4: Vergelijking van twee autostainers. Tabel met een overzicht van de voor- en nadelen van de Ventana Autostainer en de Bond Rx. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 5: Softwaresamenvatting voor beeldanalyse. Tabel met een samenvatting van enkele van de analysebenaderingen en softwaretools die beschikbaar zijn voor de analyse van afbeeldingen na segmentatie. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Hier geven we overwegingen voor het aanpassen van het IBEX-protocol aan de belangrijkste pathologiefaciliteiten met de toepassing van geautomatiseerde kleuringsapparatuur en optimalisatie van op TSA gebaseerde reagentia in het IBEX-protocol. We laten zien hoe we het beste kunnen optimaliseren voor de herhaalde rondes van het ophalen van antigeen en het correct laden in ronde 2 of hoger op de geautomatiseerde apparatuur. Daarnaast demonstreren we een aanvullende methode voor het uitvoeren van uitlijning met behulp van de Halo-software die mogelijk beschikbaar is in kernfaciliteiten. Het is aangetoond dat deze benaderingen nuttig zijn bij het bepalen van de verschillen in longomgevingen in niet-menselijk weefsel van primaten na SARS-CoV-2-infecties⁵.

Een belangrijk onderdeel van dit werk is het benadrukken van de noodzaak van uitgebreide optimalisatie van het IBEX-paneelontwerp voorafgaand aan het kleuren van experimentele weefsels. Met name bij het gebruik van op TSA gebaseerde reagentia moet rekening worden gehouden met enkele overwegingen die niet in de IBEX-basismethoden voorkomen. De eerste is de impact van meerdere rondes van het ophalen van antigeen op de gevoeligheid van antilichamen. Met op TSA gebaseerde reagentia wordt elke nieuwe ontwikkeling van antilichamen voorafgegaan door antilichaamdenaturatie. Sommige antilichamen/antigeenparen zullen vatbaar zijn voor extra rondes van antigeenextractie en de testgevoeligheid verminderen, terwijl andere een verhoogde gevoeligheid zullen verkrijgen bij herhaalde denaturatie/antigeenextractie. Het zorgvuldig testen van elk antilichaam in het doelweefsel voordat de panelen worden ontworpen, is belangrijk om de beste kleuringspraktijken te garanderen en de volgorde van zowel de antilichamen als de fluorescerende kleurstoffen te bepalen. Buffers, waaronder zowel op citraat (pH 6,0) als op basis van Tris-EDTA (pH 9,0), worden getest op alle antilichamen om de optimale omstandigheden voor het ophalen van antigeen te bepalen. Dit omvat het systematisch evalueren van elke buffer om te bepalen welke de blootstelling aan antigeen voor een bepaald antilichaam maximaliseert. Bovendien worden de temperatuur (bijv. 20-37 °C), de incubatietijd (meestal 30-60 min) en de blokkeringsomstandigheden geoptimaliseerd om niet-specifieke achtergrondkleuring te verminderen en indien nodig specifieke binding van de primaire en secundaire antilichamen te garanderen. Blokkering vóór de primaire en secundaire antilichamen kan het gebruik van in de handel verkrijgbare blokkerende reagentia omvatten om rekening te houden met weefselspecifieke autofluorescentie of niet-specifieke interacties. Andere belangrijke overwegingen die moeten worden geoptimaliseerd voordat IBEX-panelen worden afgerond, zijn onder meer het paraplu-effect, waarbij afscherming van de epitopen kan optreden als de bestelling niet wordt afgestemd op de specifieke onderzoeksvraag die wordt gesteld⁶. Om fluorescerende doorbloeding te voorkomen, is het gebruikelijk om antigeendoelen met een hogere expressie in verrode kanalen te plaatsen die de minste doorbloeding en zwakkere markers hebben in het bereik van 480-520 nm, die de beste signaal-ruisverhouding hebben, aangezien deze fluorescerende kleurstoffen de helderste zijn⁷. Er moet echter zorg worden besteed aan sterk autofluorescerende weefselmonsters die in dit bereik het helderst kunnen zijn; We raden aan dit probleem aan te pakken door weefsel zonder kleurstoffen in beeld te brengen om mogelijke niveaus van autofluorescentie aan te pakken. Samen kunnen deze optimalisatiestappen, genomen met alle normale optimalisatie en controles die doorgaans met IBEX worden uitgevoerd, leiden tot het juiste paneelontwerp voor IBEX met TSA-reagentia.

In deze methode hebben we het gebruik van twee veelgebruikte autostainers gedemonstreerd. Deze benaderingen kunnen echter ook worden toegepast op andere autostainer-methoden. Het belangrijkste onderdeel hier is de optimale verwijdering van dekglaasjes en de natte lading voor extra kleurrondes. Bovendien specificeren we geen specifieke microscoopopstelling. Hoewel kits het gebruik met bepaalde beeldvormingssystemen kunnen aanbevelen voor een optimale diascanning, zou elke microscoopopstelling, met name een epifluorescentiemicroscoop met compatibele filterkubussen en een breedspectrum LED-lichtbron, moeten werken. Sommige kleurstoffen vereisen multispectrale detectoren of gespecialiseerde filterkubussen, die mogelijk niet in alle laboratoria beschikbaar zijn en problemen kunnen opleveren bij gebruik met standaard filterkubussen vanwege hun spectrale overlapping. Deze kleurstoffen worden beter gescheiden met behulp van multispectrale beeldvormingssystemen of zeer specifieke filters. Sommige fluoroforen vallen buiten het bereik van conventionele verrode filters (meestal ~700 nm) en vereisen een gespecialiseerde filterkubus of detector die nabij-infraroodsignalen kan opvangen. Met deze filters worden gespecialiseerde microscopen gebouwd, maar er zijn alternatieven beschikbaar. Deze vereisen aanvullende optimalisatie om te bepalen hoe de kleurstoffen presteren in een bepaalde microscoopconfiguratie.

Multispectrale ontmenging wordt ten zeerste aanbevolen voor multiplex fluorescerende IHC, vooral bij het werken met weefsels die gevoelig zijn voor autofluorescentie, omdat het het echte signaal effectief scheidt van achtergrondruis. Autofluorescentie, die vaak overlapt met de emissiespectra van veelgebruikte fluoroforen (vooral in kanalen met een hogere energiegolflengte), kan specifieke signalen verdoezelen of verstoren, waardoor de nauwkeurigheid afneemt. Spectrale ontmenging ontwart wiskundig overlappende emissiespectra, isoleert echte fluorescerende signalen en "ruimt" ongewenste autofluorescentie op. Spectrale ontmenging is vooral waardevol in IBEX-workflows, waar het bereiken van de schoonst mogelijke signalen van cruciaal belang is vanwege de iteratieve aard van het kleurings- en beeldvormingsproces. Bij IBEX worden signalen van meerdere kleuringsrondes afgebeeld, gebleekt en op elkaar gestapeld om een samengesteld beeld te creëren. Elke autofluorescentie of doorbloeding die in één ronde onopgelost blijft, kan zich door de gestapelde beelden voortplanten, wat de stroomafwaartse analyse bemoeilijkt en het vertrouwen in de lokalisatie van markers vermindert. Spectrale ontmenging isoleert effectief echte fluorescentiesignalen van autofluorescentie op de achtergrond, wat zorgt voor een schonere, nauwkeurigere signaaldetectie in elke afzonderlijke ronde. Deze signaalhelderheid is essentieel voor het genereren van betrouwbare samengestelde beelden waarbij meerdere markers samen in rondes worden geanalyseerd, waardoor betrouwbare fenotypering en ruimtelijke analyse mogelijk zijn. Het beeldvormingsplatform dat voor dit protocol wordt gebruikt, heeft on-board ontmengingsmogelijkheden, maar er zijn meer ontmengingsopties nodig voor compatibiliteit met andere fluorescerende beeldvormingsplatforms met hele dia's.

Bovendien is een beperking van dit werk het gepatenteerde karakter van de autostainers, aangezien de bijbehorende reagentia en wasbuffers zijn geoptimaliseerd voor deze systemen, maar de specifieke formuleringen niet worden bekendgemaakt. Bovendien hebben we ons uitsluitend gericht op één in de handel verkrijgbare beeldanalysesoftware voor de analyse van volledige dia's en erkennen we dat de kosten van softwarelicenties voor sommige laboratoria een financiële barrière kunnen vormen. Aanvullende analysesoftware ^8,9 en opties in R lijken veelbelovend; in het bijzonder de Bodenmiller Group¹⁰, die een pakketset heeft gemaakt die optimaal lijkt voor cores, in die zin dat IMCDataAnalysis¹¹ bedoeld is voor reproduceerbare workflow op downstream-analyse van gemultiplexte afbeeldingen in R. Er zijn echter toekomstige inspanningen nodig om toegankelijke en kosteneffectieve alternatieven voor IBEX-analyse van hele dia's te ontwikkelen en te karakteriseren om een bredere acceptatie te garanderen in omgevingen met beperkte middelen. Bovendien kan deze aanpak met het gebruik van de autokleurers voor IBEX worden aangepast voor meer traditionele kleuring bij IBEX, inclusief met fluorescerende geconjugeerde primaire antilichamen, of met standaard secundaire antilichamen zonder de op TSA gebaseerde kleurstoffen als het weefsel van voldoende kwaliteit is en een optimale fixatietijd heeft om een goed signaal mogelijk te maken.

Over het algemeen hopen we dat dit werk zal helpen bij de toepassing van op TSA gebaseerde multiplex fluorescerende IHC met behulp van routinematig gebruikte pathologiekernfaciliteitsapparatuur om IBEX op grotere schaal aan deze omgevingen aan te passen. Dit type toepassing benadrukt echt de veelzijdigheid van het IBEX-protocol en demonstreert het nut ervan, zelfs in moeilijke weefselmonsters of in grote batchbenaderingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Staining reagent Alexa TSA kits	ThermoFisher		Alternatieve TSA kleurstoffen als Opal microscoopfilters niet beschikbaar zijn. Deze omvatten Alexa Fluor 488 (blauw/groen kanaal), Alexa Fluor 555 of 568 (rood kanaal), Alexa Fluor 647 (ver-rood kanaal), Alexa Fluor 750 (nabij-infrarood, indien uitgerust met geschikte filters).
Antibody Arg1	Cell Signaling	93668	Gebruikt in Figuur 4 bij 1:100
Materiaal Mesjes	Leica Biosystems		Of soortgelijk, hoog of laag profiel is afhankelijk van het type weefsel
Antibody CD11b	Abcam	ab133357	Gebruikt in Figuur 4 bij 1:2000
Antibody CD163	Abcam	ab182422	Gebruikt in Figuur 4 bij 1:500
Antibody CD31	Cell Signaling	77699S	Gebruikt in Figuur 2 bij 1:100
Antibody CD3e	Dako	A045201-2	Gebruikt in Figuur 1 bij 1:100
Gereedschap Coplin pot	Fischer Scientific	01-816-21	Of soortgelijk
Materiaal Dekglasjes	VWR	v48393-026	Of soortgelijk
Antibody CX3CR1	Abcam	ab308613	Gebruikt in Figuur 4 bij 1:450
Kleurstof DAPI	Akoya	FP1490
Software FIJI			Gebruikt om signaalintensiteit te meten
Slide Fisher Superfront Slides	Fisher Scientific	22-037-246	Of soortgelijk
Software HALO	Indica Labs		Voorbeeld van commercieel beschikbare beeldanalysesoftware. Gebruikt om afbeeldingen uit te lijnen en te analyseren.
Antibody Iba1	Cell Signaling	17191	Gebruikt in Figuur 4 bij 1:800
Software inForm	Akoya		Gebruikt om signaalintensiteit te meten
Antibody iNOS	Abcam	ab283655	Gebruikt in Figuur 4 bij 1:400
Instrument Leica Bond Rx (of RXm)	Leica Biosystems	21.2201	Verwijst naar als "Autostainer 1" in tekst. Zorg ervoor dat alle bijbehorende reagentia ook beschikbaar zijn, inclusief kleuringsboxen en bulkoplossingen.
Reagens LiBH4	Sigma-Aldrich	62460-5G-F	Bewaar in een watervrij milieu
Instrument Mantra Snap	Akoya		Multispectrale fluorescente microscoop is nodig om de kleurstoffen te detecteren. Voorbeeld microscoop die kan worden gebruikt om Opal kleurstoffen te detecteren.
Gereedschap Microtoom	Leica Biosystems		Of soortgelijk met voorkeursaccessoires zoals borstels
Staining reagent Opal IHC 480 Kit	Akoya	FP1500001KT	Gebruikt in Figuur 4
Staining reagent Opal IHC 6-plex Plex Kit	Akoya	NEL821001KT	520 en 620 bleken niet, gebruikt in Figuur 1, 2 en 4
Staining reagent Opal IHC 780 Kit	Akoya	FP1501001KT	Gebruikt in Figuur 4
Gereedschap Oven	Millipore Sigma	Z683329	Of soortgelijk, kan ook worden gedaan op autostainer
Antibody Pancytokeratine	Abcam	ab9377	Gebruikt in Figuur 4 bij 1:50
Reagens PBS (optioneel)	Fisher Scientific	AAJ61196AP
Instrument PhenoImager	Akoya		Multispectrale whole slide imaging met onboard spectrale unmixing opgenomen in software
Reagens ProLong Gold Antifade	Fisher Scientific	P36961	Of soortgelijk waterige montage media
Antibody ProSP-C n-terminaal (ProSPC)	Seven Hills Bioreagents	WRAB-9337	Gebruikt in Figuur 4 bij 1:250
Antibody RAGE	R&D	MAB1179	Gebruikt in Figuur 1 en 2 bij 1:50
Reagens Reactiebuffer	Roche	NC1895692	Voor gebruik met Ventana autostainer
Antibody SARS-CoV-2-N	Cell Signaling	68344	Gebruikt in Figuur 2 bij 1:1000
Slide TOMO Adhesion CC Microscope Slides-WH	Avantik	SKUSL6519-1	Als weefselhechting een zorg is
Instrument Ventana Discovery Ultra	Roche		Verwijst naar als "Autostainer 2" in tekst. Zorg ervoor dat alle bijbehorende reagentia ook beschikbaar zijn, inclusief kleuringsboxen en bulkoplossingen.
Reagens Wash buffer	Leica Biosystems	AR9590	Voor gebruik met Leica Bond autostainer
Reagens Water	Fisher Scientific	15-230-147	DI is het beste, niet millipore
Gereedschap Waterbad	Leica Biosystems	140607020C1	Of soortgelijk