Methodenartikel

Scheiding en differentiële karakterisering van microbiële extracellulaire blaasjes in de darm bij zoutgevoelige ratten onder zoutrijke dieetomstandigheden

DOI:

10.3791/68279

⸱

6 juni 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medical Technology, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Pathology Department, Suining Central Hospital, 3School of Health Preservation and Rehabilitation, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Department of Pharmacy, Affiliated Sport Hospital of CDSU, 5Department of Neck, Shoulder, Waist, and Leg Pain, Sichuan Province Orthopedic Hospital, 6Neijiang Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol beschrijft de isolatie van darmmicrobiële EV's uit zoutgevoelige ratten die HSD krijgen met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie. EV's werden gekenmerkt door het volgen van nanodeeltjes, TEM, LPS/BCA-assays en 16S rRNA-sequencing om de grootte, morfologie, samenstelling en oorsprong van de microbiota te analyseren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een hoge zoutinname is een belangrijke risicofactor voor hypertensie en het onderliggende mechanisme kan nauw verband houden met extracellulaire blaasjes (EV's) die worden uitgescheiden door de darmmicrobiota. Deze EV's, geproduceerd door de darmmicrobiota, bevatten verschillende bioactieve componenten die een cruciale rol kunnen spelen bij de ontwikkeling van hypertensie veroorzaakt door een zoutrijk dieet (HSD). Om dit mechanisme te onderzoeken, ontwikkelden we een efficiënte extractiemethode op basis van dichtheidsgradiëntcentrifugatie om EV's te isoleren uit de darmmicrobiota van zoutgevoelige ratten die een HSD kregen. Door middel van deeltjesgrootteanalyse, transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en detectie van lipopolysaccharide (LPS) hebben we de gradiëntverdeling van EV's van de darmmicrobiota geïdentificeerd en een nauwkeurige extractie bereikt. Bovendien werd 16S rRNA-gensequencing gebruikt om de oorsprong en samenstellingsverschillen van EV's tussen de normale en HSD-groepen te analyseren, waarbij de impact van een hoge zoutinname op de genetische kenmerken van EV's in de darmmicrobiota werd onthuld. Deze studie biedt waardevolle hulpmiddelen en wetenschappelijke inzichten in de mechanismen van de darmmicrobiota die ten grondslag liggen aan door zout geïnduceerde hypertensie en biedt nieuwe perspectieven voor de preventie en behandeling van gerelateerde ziekten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De darmmicrobiota, ook bekend als darmmicrobiota microflora of darmmicro-ecologie, is een complex van tienduizenden micro-organismen die zich in het biologische maagdarmkanaal bevinden en een cruciale rol spelen bij het behoud van de menselijke gezondheid1. In de afgelopen jaren is met verder onderzoek gebleken dat de darmmicrobiota extracellulaire blaasjes (EV's) kan produceren2. EV's zijn kleine blaasjes die vrijkomen door cellen, die verschillende moleculen in de cel dragen, zoals eiwitten, nucleïnezuren en lipiden 3,4. Ze kunnen interageren met andere microben5, darmepitheelcellen en zelfs verre weefsels en organen6, waardoor de gezondheid van het menselijk lichaam wordt aangetast 7,8. Er is een nauw verband tussen de EV's die door deze darmmicrobiota worden geproduceerd en voeding9.

EV's geproduceerd door de darmmicrobiota kunnen belangrijke middelen zijn waardoor een zoutrijk dieet (HSD) de gezondheid van het lichaam beïnvloedt. HSD verstoort niet alleen direct het evenwicht van de darmmicrobiota10, wat leidt tot een aanzienlijke vermindering van het aantal nuttige bacteriën (zoals Lactobacillus)11, maar bevordert ook de proliferatie van schadelijke bacteriën (zoals Bacteroides, enz.)12. Deze onbalans vermindert de darmbarrièrefunctie en verhoogt het risico op darmontsteking. Daarnaast beïnvloedt een HSD ook de zuur-base-balans en de opname van voedingsstoffen in de darm door de metabolische activiteiten13 van de darmmicrobiota te veranderen, zoals het verminderen van de productie van vetzuren met een korte keten14,15 met meerdere fysiologische functies.

Deze veranderingen hebben niet alleen invloed op de darmgezondheid, maar kunnen ook indirect de productie en afgifte van EV's reguleren en de samenstelling en functie van de EV veranderen. De zoutrijke omgeving kan de normale fysiologische functies van darmcellen beïnvloeden, waaronder de afgifte en het transport van EV's, waardoor de rol van EV's in intercellulaire informatieoverdracht en immuunregulatie wordt verstoord. Tegelijkertijd kan darmontsteking een verscheidenheid aan EV's met speciale functies bevorderen16 en zich verspreiden naar het hele lichaam via de as van het darmorgaan en op andere manieren17,18, wat nauw verband houdt met het optreden en de ontwikkeling van hypertensie19,20, cardiovasculaire21 en cerebrovasculaire aandoeningen22,23, obesitas24,25, diabetes26 en andere chronische ziekten.

Daarom was het algemene doel van deze studie om een efficiënte en betrouwbare methode te ontwikkelen om EV's te extraheren uit de darmmicrobiota van zoutgevoelige ratten die een HSD kregen en om hun fysische eigenschappen, samenstelling en functies systematisch te bestuderen. Vanwege de kenmerken van de significante verhoging van de bloeddruk na een zoutrijk dieet, werden zoutgevoelige ratten geselecteerd en onthulden ze het effect van HSD op de darmmicrobiota EV door een efficiënte extractiemethode te construeren. De methode was gebaseerd op dichtheidsgradiëntcentrifugatie en combineerde verschillende dynamische identificatietechnieken zoals detectie van deeltjesgrootte, LPS/BCA-meting, transmissie-elektronenmicroscopie en proteomische analyse. Het protocol heeft tot doel de effecten van HSD op de darmmicrobiota EV en de mechanismen ervan bij hart- en vaatziekten aan het licht te brengen. Met zijn hoge efficiëntie, reproduceerbaarheid en brede toepasbaarheid biedt deze benadering niet alleen een belangrijk hulpmiddel voor het onderzoeken van het mechanisme van EV's van de darmmicrobiota bij door zout geïnduceerde hypertensie, maar legt het ook de theoretische basis voor het ontwikkelen van ziekte-interventiestrategieën op basis van EV's. Door middel van deze studie hopen we nieuwe wegen te openen voor de preventie en behandeling van hart- en vaatziekten, zoals hypertensie27,28.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze dierexperimentele studie voldoet aan de relevante ethische richtlijnen en internationale normen. Studies met dieren werden goedgekeurd door het Laboratory Animal Welfare and Ethics Committee van de Chengdu University of Chinese Medicine (instelling: Chengdu University of Chinese Medicine; protocolnummer: 2018-21).

1. Bereiding en dieet van dieren

  1. Acclimatiseer 6 weken oude mannelijke Dahl-zoutgevoelige ratten, lichaamsgewicht 180-200 g, door te kweken bij 50% ± 10% luchtvochtigheid; 12 uur / 12 uur lichtcyclus; 20,0 ± 2,0 °C gedurende 1 week onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden.
  2. Verdeel de ratten vervolgens gelijkmatig in twee groepen (n = 6). Geef elke groep een ander dieet dat 6 weken duurt: een normaal zoutdieet (NSD) met 0,5% natriumchloride en een HSD met 8% natriumchloride, dat vaak wordt gebruikt in gepubliceerde onderzoeken 29,30,31. De muizen hadden gedurende het hele onderzoek onbeperkt toegang tot voedsel en water.

2. Monitoring van de bloeddruk

OPMERKING: Plethysmografie van de staartmanchet werd gebruikt als een niet-invasieve methode voor bloeddrukmeting, en volumetrische drukregistratie (VPR) werd gebruikt wanneer de bloeddruk werd gemeten aan de hand van het bloedvolume van de staart.

  1. Plaats ratten afzonderlijk in kleine kooien met zaagsel, gedurende 10 minuten verwarmd tot ongeveer 37 °C en plaats ze in een op maat gemaakt knaagdierfixatie met een verstelbare neus en deur voor toegang tot dieren. Plaats ratten in buikligging op een verwarmingskussen om hun lichaamstemperatuur op 37 °C te houden.
  2. Sluit de VPR-sensor aan op de onderkant van de staart en stel minimaal 10 aanpassingscycli in om de BP28 te stabiliseren.
    1. Vul de opblaasbare manchet op de staartwortel en plaats de plethysmografische sensor (of foto-elektrische sensor) eronder. Blaas langzaam op tot boven de systolische druk (meestal 200 mmHg) en laat dan langzaam los. Het instrument detecteert automatisch de drukwaarde van het verdwijnen van de pulsgolf (systolische bloeddruk) en herstel (diastolische bloeddruk). Meet 3-5 keer achter elkaar en neem de gemiddelde waarde.
  3. Train alle ratten om de fixatieprocedure aan te passen en voer dit onderzoek rond 9 uur 's ochtends uit in een rustig laboratorium om de effecten van circadiane variatie te minimaliseren.
  4. Meet de systolische bloeddruk (SBP) en diastolische bloeddruk (DBP) om de dag voor het offer. Schatting van de gemiddelde arteriële druk (MAP) van SBP en DBP
    KAART = (SBP + 2 DBP)/3

3. Extractie van EV's

  1. Stalen collectie
    1. Dompel een steriel wattenstaafje in 75% alcohol en gebruik het om de anus van de rat te stimuleren. De stimulatie was bedoeld om de darmperistaltiek te bevorderen en de anale sluitspier te ontspannen, waardoor de ontlasting werd bevorderd. Nadat de ontlasting is verdreven, verzamelt u ze met een steriele tang in steriele containers van de juiste grootte en bewaart u ze onmiddellijk bij -80 °C.
  2. Voorbereiding van het monster
    1. Breng met een lepel 5 g ontlasting over in een vooraf gewogen centrifugebuis van 50 ml. Voeg 50 ml voorverwarmde 37 °C endotoxinevrije PBS (maximale monsterconcentratie 10%) toe aan de buis en draai gedurende 30 minuten. Koel de hogesnelheidscentrifuge af tot 4 °C.
    2. Centrifugeer op 8.000 x g gedurende 15 minuten na het symmetrisch plaatsen van de monsters om de centrifuge in evenwicht te brengen. Zuig na het centrifugeren het bovenstaande op en breng het over in een nieuwe steriele centrifugebuis.
    3. Centrifugeer opnieuw op 8.000 x g gedurende 15 min. Zuig het bovenstaande op en gebruik het voor verdere analyse.
  3. Preparaat van ruw extract
    1. Gebruik een steriele filtereenheid van 0,22 μm. Plaats de filtereenheid op ijs en houd de vacuümpomp stevig vast. Breng het verkregen bovenstaande over naar de bovenkant van het filter. Zet de vacuümpomp aan om de gefilterde monsters op te vangen.
    2. Breng het filtraat over naar een centrifugaalfilter (10 kDa, 15 ml), centrifugeer bij 4 °C, 3.000 x g gedurende 30 min, en concentreer het monster tot ten minste 1400 μl.
    3. Verzamel het geconcentreerde monster en verdun het indien nodig tot 1400 μl met behulp van voorgekoeld endotoxinevrij PBS. Bewaar het monster onmiddellijk na verdunning op ijs.
      OPMERKING: Het ruwe extract kan direct worden gebruikt of enkele maanden bij -80 °C worden bewaard.
  4. Scheiding van EV's
    1. Bereid de gradiëntbuffer A en gradiëntbuffer B voor zoals hieronder beschreven. Bereid de buffer een dag van tevoren voor, want het duurt enkele uren voordat de verbinding volledig is opgelost. De voorbereide buffer kan 6 maanden bij 4 °C worden bewaard.
      1. Bereiding van gradiëntbuffer A: Los 0,25 M sucrose, 6 mM EDTA en 60 mM Tris op in 800 ml endotoxinevrij water door middel van een magnetische mixer onder roer, waarbij de pH wordt aangepast aan 7,4 met behulp van zoutzuur. Verdun tot 1 L met endotoxinevrij water. Gebruik een flessenfilter van 0,22 μm om de buffer te filteren.
      2. Bereiding van gradiëntbuffer B: Los 0,25 M sucrose, 1 mM EDTA en 10 mM Tris op in 800 ml endotoxinevrij water door middel van een magnetische mixer die roert, met een pH aangepast aan 7,4 met zoutzuur. Verdund tot 1 L met endotoxinevrij water. Gebruik een flessenfilter van 0,22 μm om de buffer te filteren.
    2. Meng 1 volume gradiëntbuffer A en 5 volumes dichtheidsgradiëntmedium (het medium bestaat voor 60% uit jodixanoloplossing) om de werkoplossing voor te bereiden.
    3. Bereiding van jodixanoloplossing (10%, 20%, 40%): Om een 10% jodixanoloplossing te bereiden, mengt u 1 eenheid werkoplossing en 4 eenheden buffer B; meng voor 20% jodixanoloplossing 2 eenheden werkoplossing en 3 eenheden buffer B; meng voor 40% jodixanol-oplossing 4 eenheden werkoplossing en 1 eenheid buffer B. Bereid elke oplossing vers en bewaar op ijs.
      OPMERKING: Voor elk experiment moeten nieuwe werkoplossingen worden bereid en kan een extra volume van 10% aan oplossingen worden bereid om rekening te houden met de experimentele fout.
    4. Meng de in stap 3.3.3 bereide oplossing met 7 ml dichtheidsgradiëntmedium tot een 50% jodixanol-oplossing.
    5. Om een dichtheidsgradiënt voor te bereiden, voegt u trypanblauwe oplossing toe aan 40% oplossing en 10% (wt/vol) jodixanoloplossing om een duidelijke omtrek tussen de verschillende lagen te verkrijgen.
    6. Breng 8 ml 50% jodixanoloplossing over op de bodem van de dunwandige polypropyleen centrifugebuis. Kantel de buis tot 70° en breng 8 ml 40% jodixanoloplossing over op het vloeistofoppervlak. Voeg 8 ml 20% jodixanoloplossing toe, vervolgens 7 ml 10% jodixanoloplossing en ten slotte 2 ml endotoxinevrije PBS.
      OPMERKING: Het voorbereiden van een dichtheidsgradiënt vereist oefening. De kwaliteit van de dichtheidsgradiënt heeft een grote invloed op de experimentele resultaten. Plaats de buis niet rechtop tussen verschillende stappen in het optelproces, omdat dit een negatieve invloed heeft op de kwaliteit van de dichtheidsgradiënt.
    7. Koel de centrifuge van tevoren voor en plaats de voorbereide dichtheidsgradiënt in de ultracentrifuge. Invoerparameters om te starten, parameterwaarden: 100.000 x g, 20 uur, 10 °C.
    8. Voor handmatige scheiding van de gradiëntdichtheid trekt u langzaam 2 ml van de oplossing op uit het midden van het oppervlak van het systeem dat in totaal 34 ml vloeistof bevat. Elke 2 ml is een gradiënt, waardoor de oplossing van de dichtheidsgradiënt in 17 gradiënten wordt verdeeld.
    9. Breng de dichtheidsfracties met behulp van een pipet over in een steriel monsterbuisje en plaats ze onmiddellijk op ijs. Klem de centrifugebuis tussen duim en wijsvinger om ervoor te zorgen dat deze rechtop blijft staan.
  5. Terugwinning van EV's
    1. Met behulp van een volledig geautomatiseerd EV-extractiesysteem dat negatieve drukoscillatie toepast via een ultrasoon oscillatiesysteem met dubbele koppeling op de ultrafiltratiechip, worden nucleïnezuur- en eiwitonzuiverheden in het monster door de nanoporie verwijderd en worden EV's onderschept, wat leidt tot verrijking en zuivering van EV's.
      1. Verwijder het filtraat in stap 3.4.7 en voeg het toe aan de ultrafiltratiechip.
      2. Gebruik het instrument volgens de instructies van het instrument en vang het gefilterde filtraat op, namelijk de met exosomen verrijkte oplossing. Het belangrijkste proces wordt weergegeven in figuur 1.

4. Identificatie van EV's

  1. Detectie van deeltjesgrootte en concentratie
    1. Evalueer de grootteverdeling en zeta-potentiaal met behulp van een resistieve pulsdetectie (RPS) -gebaseerde nanocoulometerteller. Selecteer voor dit experiment nanopore-chips met een meetbereik van 60-200 nm. Evalueer verder de deeltjesgrootteverdeling en het zeta-potentieel van de EV's met behulp van een nanobibliotheekteller.
      1. Neem een geschikte hoeveelheid EVs-oplossing en verdun deze in (1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000).
      2. Verschillende verdunningen van EV-oplossingen werden op het instrument geplaatst om te testen.
      3. De verdunningsmultiple met betere stabiliteit werd geselecteerd en opnieuw getest om nauwkeurigere gegevens te verkrijgen.
  2. LPS- en BCA-test
    1. BCA-test: Lyseer EV's met behulp van RIPA-buffer en scheid vervolgens de eiwitten. Bepaal het eiwitgehalte van de EV's met behulp van de BCA-eiwitconcentratiebepalingskit.
    2. LPS-test: Gebruik de endotoxinedetectiekit om monsters, een endotoxinedetector en chromogeen toe te voegen volgens de stappen van de kit. Meet de extinctie bij 545 nm en bereken de LPS-expressie van externe blaasjes volgens de standaardcurve.
  3. TEM-evaluatie: Breng voor negatieve kleuring en TEM-analyse monsters aan op een lichtgevend koperen rooster bedekt met continue koolstoffilm en beits af met 0,75% uranylformiaat. Voor cryo-EM absorbeert u de EV's in een EM-koolstofraster met 300 mazen en een hydrofiel oppervlak en bevriest u ze in vloeibare stikstof. Observeer en analyseer de rasters met behulp van de Cryo-TEM en neem de beelden op met 22.000 vergrotingen32.
  4. Karakterisering van eiwitten: Lyse EV's met behulp van RIPA-buffer en scheid vervolgens de eiwitten. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de BCA-eiwittestkit, scheid gelijke hoeveelheden eiwit van elk monster met SDS-PAGE en kleuring met Coomassie blauwe kleurstofoplossing na elektroforese om de eiwitprofielen te visualiseren33,34.
  5. S-sequencing en -analyse: Extraheer genomisch DNA uit de fecale monsters met behulp van een fecale DNA-extractiekit. Beoordeel de integriteit en concentratie van DNA door middel van agarosegelelektroforese en een spectrofotometer. Amplificeer de V3 - V4-regio van het 16S rRNA-gen met universele primers, zuiver de PCR-producten, kwantificeer ze en sequentie ze op het Illumina-platform. Voer gegevensanalyse uit met behulp van de QIIME2-pijplijn35.
    1. Classificeer ampliconsequentievarianten (ASV's) met behulp van DADA2 en vergelijk ze met de Silva-database met behulp van het VSEARCH-algoritme. Gebruik α-diversiteitsanalyse om de soortenrijkdom en diversiteit binnen de steekproeven te beoordelen, voornamelijk met behulp van indices zoals de Shannon-index en de Chao1-index. β-Diversiteitsanalyse vergelijkt de samenstelling van de microbiële gemeenschap tussen monsters en wordt meestal gevisualiseerd door middel van hoofdcoördinatenanalyse (PCoA). Gebruik differentiële analysemethoden, zoals lineaire discriminantanalyse effectgrootte (LEfSe) en vulkaanplotanalyse, om microbiële taxa met significant verschillende omstandigheden of tussen groepen te identificeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De EV-concentraties werden bepaald in verschillende fracties (Figuur 2A). De experimentele resultaten toonden aan dat de concentratie van de EV's een typisch normaal verdelingspatroon vertoonde in een reeks oplossingen voor dichtheidsgradiënt (Figuur 2B). Concreet bereikte de concentratie van EV's in fractie 9 het hoogste punt (3,85 x 109), wat suggereert dat de belangrijkste verdelingsfractie van EV's 9

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie hebben we ons gericht op de EV's van de darmmicrobiota bij zoutgevoelige ratten op een HSD en hebben we een reeks belangrijke prestaties bereikt. Ten eerste werd met succes een efficiënte extractiemethode op basis van dichtheidsgradiëntcentrifugatie geconstrueerd om EV's te isoleren van zoutgevoelige darmmicrobiota van ratten op HSD, en de meeste niet-EV-componenten werden geïsoleerd door middel van een nauwgezet, gestandaardiseerd dierexperimenteel manipulatie- en monster...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die van invloed zouden kunnen zijn geweest op het werk dat in dit artikel wordt gerapporteerd.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82205240), de Natural Science Foundation van de provincie Sichuan (2025ZNSFSC1836) en het Clinical Basic Project van het Sichuan Provincial Orthopedic Hospital (PY202414).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Essential Supplies
Centrifugaal Filter (10nkDa 2 mL)MilliporeUFC903096
Centrifugebuisjes(50 mL)BKMAN20220404
CentrifugebuisjesBECKMAN COULTERZ30815SCA
VacuumfiltratiesysteemBiosharp24902581
Reagentia
Chromogeen LAL Endotoxine Assay KitBeyotime022124240705
Coomassie Blue Fast Staining SolutionBeyotimeZ972241010
EDTADamas-betaP3117308
Enhanced BCA Protein Assay KitBeyotimeA006241112
EthanolKESH
HCl
OptiPrep (60% wt/vol, iodixanol)Serumwerk00124
PBSLabshark130114005
fosforwolfraamzuurRUIXIN
SucroseDamas-betaP1917057
Tris (VWR)Damas-betaP3061764
Trypan blauw kleuringsoplossing (0,4%)BeyotimeBD07242904
Equipment
Absorbantie Microplate ReaderSpectraMaxABP01690
BiomicroscoopMoticBA210Digital
BureaucentrifugeCenceCHT210R
Bureau high-speed microcentrifugeDLABD3024
Fixed Angle Aluminium Rotor + 500 mL Centrifugale KopCence
Hoge precisie elektronische weegschaalSKRBN-200
Laminaire flow kastNantong Hunan Scientific Instrument Co., Ltd.SW-CJ-2FDS
SW 32.1 Ti Swing bucket turn+ SW 32.1 Ti Rotor bucketBECKMAN COULTER
Transmissie elektronenmicroscoopJEOLJEM-1400FLASH
Buisjesrotator
UltracentrifugeBECKMAN COULTEROptima XE-100
Ultra-puur water systeemULPHWUPR-II-15TNZ
Water-circulatie Multifunctionele VacuümpompQiang QiangSHZ-D(III)

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thursby, E., Juge, N. Introduction to the human gut microbiota. Biochem J. 474 (11), 1823-1836 (2017).
  2. Aschtgen, M. S., et al. Rotation of Vibrio fischeri Flagella Produces Outer Membrane Vesicles That Induce Host Development. J Bacteriol. 198 (16), 2156-2165 (2016).
  3. Gurung, S., Perocheau, D., Touramanidou, L., Baruteau, J. The exosome journey: from biogenesis to uptake and intracellular signalling. Cell Comm Signal. 19 (1), 47(2021).
  4. Avila-Calderón, E. D., et al. Outer Membrane Vesicles of Gram-Negative Bacteria: An Outlook on Biogenesis. Front Microbiol. 12, 557902(2021).
  5. Melo-Marques, I., Cardoso, S. M., Empadinhas, N. Bacterial extracellular vesicles at the interface of gut microbiota and immunity. Gut Microbes. 16 (1), 2396494(2024).
  6. Kim, N. Y., et al. Effect of gut microbiota-derived metabolites and extracellular vesicles on neurodegenerative disease in a gut-brain axis chip. Nano Converg. 11 (1), 7(2024).
  7. Ahmadi Badi, S., et al. Microbiota-Derived Extracellular Vesicles as New Systemic Regulators. Front Microbiol. 8, 1610(2017).
  8. Barathan, M., Ng, S. L., Lokanathan, Y., Ng, M. H., Law, J. X. The Profound Influence of Gut Microbiome and Extracellular Vesicles on Animal Health and Disease. Int J Mol Sci. 25 (7), 4024(2024).
  9. Maukonen, J., Saarela, M. Human gut microbiota: does diet matter. Proc Nutri Soc. 74 (1), 23-36 (2015).
  10. Bier, A., et al. A High Salt Diet Modulates the Gut Microbiota and Short Chain Fatty Acids Production in a Salt-Sensitive Hypertension Rat Model. Nutrients. 10 (9), 1154(2018).
  11. Aghamohammad, S., et al. Anti-inflammatory and immunomodulatory effects of Lactobacillus spp. as a preservative and therapeutic agent for IBD control. Immun Inflamm Dis. 10 (6), e635(2022).
  12. Dong, Z., et al. The Effects of High-Salt Gastric Intake on the Composition of the Intestinal Microbiota in Wistar Rats. Med Sci Monit. 26, e922160(2020).
  13. Yan, X., et al. Intestinal Flora Modulates Blood Pressure by Regulating the Synthesis of Intestinal-Derived Corticosterone in High Salt-Induced Hypertension. Circ Res. 126 (7), 839-853 (2020).
  14. Wang, X., Lang, F., Liu, D. High-Salt Diet and Intestinal Microbiota: Influence on Cardiovascular Disease and Inflammatory Bowel Disease. Biology. 13 (9), 674(2024).
  15. Qi, L., et al. Microbiome-metabolome analysis insight into the effects of high-salt diet on hemorheological functions in SD rats. Front Nutri. 11, 1408778(2024).
  16. Wu, Q., et al. Insights into the unique roles of extracellular vesicles for gut health modulation: Mechanisms, challenges, and perspectives. Curr Res Microb Sci. 7, 100301(2024).
  17. Zhang, H., et al. Effects of bacterial extracellular vesicles derived from oral and gastrointestinal pathogens on systemic diseases. Microbiol Res. 285, 127788(2024).
  18. Wang, H. X., Wang, Y. P. Gut Microbiota-brain Axis. Chinese Med J. 129 (19), 2373-2380 (2016).
  19. Huang, S., et al. A cross-tissue transcriptome association study identifies key genes in essential hypertension. Front Genet. 14, 1114174(2023).
  20. Gao, H., et al. Microbial DNA Enrichment Promotes Adrenomedullary Inflammation, Catecholamine Secretion, and Hypertension in Obese Mice. J Am Heart Assoc. 11 (4), e024561(2022).
  21. Chen, P. Gut Microbiota and Pathogenesis of Organ Injury. , Springer. Singapore. (2020).
  22. Xie, N., et al. hPSCs-derived brain organoids for disease modeling, toxicity testing and drug evaluation. Exp Neurol. 385, 115110(2024).
  23. Liu, N., et al. The underlying mechanisms of DNA methylation in high salt memory in hypertensive vascular disease. Sci Rep. 14 (1), 925(2024).
  24. Li, M., et al. Wheat β-glucan reduces obesity and hyperlipidemia in mice with high-fat and high-salt diet by regulating intestinal flora. Int J Biol Macromol. 288, 138754(2024).
  25. Kerem, G., et al. Small intestinal microbiota composition altered in obesity-T2DM mice with high salt fed. Sci Rep. 13 (1), 8256(2023).
  26. Díez-Sainz, E., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Lorente-Cebrián, S. Effects of gut microbiota-derived extracellular vesicles on obesity and diabetes and their potential modulation through diet. J Physiol Biochem. 78 (2), 485-499 (2022).
  27. Wu, S., et al. Liuzijue training improves hypertension and modulates gut microbiota profile. Front Cardiovasc Med. 10, 1075084(2023).
  28. Qi, L. M., et al. Salvia miltiorrhiza bunge extract improves the Th17/Treg imbalance and modulates gut microbiota of hypertensive rats induced by high-salt diet. J Funct Foods. 117, 106211(2024).
  29. Wilck, N., et al. Salt-responsive gut commensal modulates T(H)17 axis and disease. Nature. 551 (7682), 585-589 (2017).
  30. Jiang, X., et al. Intestinal Gastrin/CCKBR (Cholecystokinin B Receptor) Ameliorates Salt-Sensitive Hypertension by Inhibiting Intestinal Na(+)/H(+) Exchanger 3 Activity Through a PKC (Protein Kinase C)-Mediated NHERF1 and NHERF2 Pathway. Hypertension. 79 (8), 1668-1679 (2022).
  31. Zheng, T., et al. Hypertension of liver-yang hyperactivity syndrome induced by a high salt diet by altering components of the gut microbiota associated with the glutamate/GABA-glutamine cycle. Front Nutr. 9, 964273(2022).
  32. Mulligan, S. K., et al. Multiplexed TEM Specimen Preparation and Analysis of Plasmonic Nanoparticles. Microsc Microanal. 21 (4), 1017-1025 (2015).
  33. Olson, B. Assays for Determination of Protein Concentration. Curr Protoc Pharmacol. 73, A.3a.1-a.3a.32 (2016).
  34. Matsumoto, H., Haniu, H., Komori, N. Determination of Protein Molecular Weights on SDS-PAGE. Methods Mol Biol. 1855, 101-105 (2019).
  35. Sanschagrin, S., Yergeau, E. Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons. J Vis Exp. (90), e51709(2014).
  36. Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization. Nat Protoc. 15 (1), 40-67 (2020).
  37. Ruhal, R., Kataria, R. Biofilm patterns in gram-positive and gram-negative bacteria. Microbiol Res. 251, 126829(2021).
  38. Maldonado, R. F., Sá-Correia, I., Valvano, M. A. Lipopolysaccharide modification in Gram-negative bacteria during chronic infection. FEMS Microbio Rev. 40 (4), 480-493 (2016).
  39. Honda, K., Littman, D. R. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease. Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).
  40. Guzik, T. J., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).
  41. Huang, J., et al. Extracellular vesicles as a novel mediator of interkingdom communication. Cytokine Growth Factor Rev. 73, 173-184 (2023).
  42. Li, W., et al. Alleviation of colitis by honeysuckle MIR2911 via direct regulation of gut microbiota. J Control Release. 376, 123-137 (2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Gut Microbial VesiclesExtracellular VesiclesDensity Gradient CentrifugationHigh Salt DietSalt Sensitive RatsTransmission Electron MicroscopyNanoparticle TrackingLipopolysaccharide Detection16S rRNA SequencingHypertension Mechanism

Gerelateerde artikelen