Tracking van enkele eiwitten in lipide-dubbellagen met behulp van fluorescentiemicroscopie

Summary

Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van hoe monsters te maken voor single-eiwittracking in solid-supported lipid bilayers. Het verklaart ook een eenvoudige fluorescentiemicroscoop met enkelvoudige moleculegevoeligheid en een hoge framerate. Tot slot beschrijven we de procedure voor het extraheren van single-protein trajecten.

Abstract

Directe observatie is een fundamentele methode voor wetenschappelijke ontdekking en begrip. Time-lapse fluorescentiebeeldvorming met één molecuul maakt het mogelijk individuele eiwitten te observeren terwijl ze bewegen en interageren met hun omgeving, waardoor toestanden zichtbaar worden die normaal gesproken verborgen zouden zijn in ensemblemetingen. Single-protein tracking is vooral geschikt voor het bestuderen van membraaneiwitten, waarbij het tweedimensionale karakter snelle, breedveldbeeldvorming met single-fluorofoorgevoeligheid mogelijk maakt. Het gebruik van kunstmatige lipide-dubbellagen die membranen nabootsen waar transmembraan- of perifere membraaneiwitten voorkomen (zoals plasmamembranen of membranen van intracellulaire organellen van verschillende celtypen), maakt het mogelijk specifieke interacties in nabijgelegen omgevingen te meten. Het maakt ook de geleidelijke toevoeging van complexiteit mogelijk, component voor component, terwijl achtergrondinterferentie door fluorescentie en Ramanverstrooiing wordt onderdrukt. Door temperatuurregeling toe te voegen, wordt het ook mogelijk om de thermodynamische eigenschappen van interacties tussen enkeldeeltjes te bepalen. In dit werk beschrijven we een protocol voor monstervoorbereiding, gegevensverzameling, het volgen van fluorescentie van één molecuul en de analyse van membraaneiwittrajecten in lipide-dubbellagen met behulp van Aquaporine-4. Dit werk dient als fundamenteel voorbeeld en kan worden aangepast aan verschillende eiwitten en samenstellingen van dubbellagen.

Introduction

Onder natuurlijke biologische omstandigheden worden membraaneiwitten omgeven door een uitgebreid netwerk van interacties, waaronder andere membraaneiwitten, eiwitten in de intra- en extracellulaire vloeistoffen, verschillende soorten lipiden en cholesterol, substraten of liganden, oplossingsinteracties en interacties tussen extracellulaire en intracellulaire matrices. Een klassieke biofysische benadering om specifieke en collectieve interacties beter te begrijpen begint met één component, waarbij geleidelijk extra componenten één voor één worden geïntroduceerd totdat de complexiteit de oorspronkelijke omgeving weerspiegelt – een "Divide and Conquer"-benadering van biofysica. Een moderne methode op moleculaire schaal om deze interacties te bestuderen is directe observatie, waarbij gebruik wordt gemaakt van time-lapse fluorescentiebeeldvorming op één molecuul om individuele eiwitten te volgen terwijl ze bewegen en interageren met hun omgeving. In dit artikel beschrijven we de fundamentele stappen van deze benadering, waaronder de vorming van lipide-dubbellagen op kwarts-dekkingsslippen en het inbrengen van een groot membraaneiwit in deze voorgemaakte dubbellagen op een manier die geschikt is voor enkelproteïnebeeldvorming. Hierop volgt een 'werkpaard'-protocol voor het volgen van enkele eiwitten in ondersteunde dubbellagen.

Dit artikel beschrijft hoe je vaste-ondersteunde lipide-dubbellagen kunt creëren met kleine unilamellaire blaasjes (SUV's) die breken op hydrofiele kwarts-dekmantels. De kwartsoppervlakken worden voorbereid door een zuurwassing of ultraviolet (UV) ozonreiniging. Het lipide dat wordt gebruikt om de SUV's te maken, moet, indien mogelijk, overeenkomen met de belangrijkste chemische samenstelling van het biologische membraan van belang (bijv. aquaporine-4 (AQP4) wordt gevonden in het plasmamembraan van astrocyten en de belangrijkste componenten zijn POPC (46,4%), POPE (8,5%), PS (5,6%), cholesterol (30%), PI (2,5%) en SM (5,6%))^1,2. Om interactie met het vaste substraat te voorkomen, tillen toevoegingen zoals polyethyleenglycol (PEG) die aan een lipide worden getransplanteerd de dubbellaag van het oppervlak ^3,4. De hoeveelheid van elke toevoeging moet zorgvuldig worden aangepast om te voorkomen dat eiwitdiffusie wordt belemmerd, terwijl er ook voldoende ondersteuning wordt geboden om het membraan van het substraatoppervlak te tillen. Additieven zoals PEGylated lipiden vertonen doorgaans twee fasen: een 'borstelfase' en een 'paddenstoelfase'. De borstelfase vindt plaats wanneer de PEG in hoge concentratie is, waardoor het polymeer rechtop staat om sterische hindernissen te verminderen. De paddenstoelenfase vindt plaats bij lage concentraties, wanneer de polymeren voldoende gescheiden zijn om als willekeurige spoelen te bestaan. Over het algemeen belemmert de borstelfase de diffusie, maar de paddenstoelfase biedt weinig ondersteuning. De concentratie tussen de borstel- en paddenstoelfase is optimaal en biedt ondersteuning met minimale impact op diffusie ^3,4.

Sommige membraaneiwitten zullen spontaan worden ingebracht in vast gedragen lipidemembranen, zoals P450s en cytochroom P450-reductase⁵, terwijl andere met detergenten moeten worden ingebracht, wat een delicaat proces is. Zorgvuldig wassen is noodzakelijk om deze wasmiddelen te verwijderen, evenals om eventuele niet-geïntegreerde eiwitten die het volgen van enkelproteïne kunnen verstoren – een proces dat in detail zal worden beschreven. De hoofdfocus van dit artikel is de voorbereiding van een monster voor single-molecule tracking (SMT) met behulp van time-lapse fluorescentiebeeldvorming. Dit vereist een objectief met hoge vergroting en numerieke apertuur (NA) – meestal een 100x en 1,45 NA olie-immersieobjectief ^6,7. Het vereist ook een snelle, zeer gevoelige camera (EMCCD, CMOS of ICCD-camera) en laserexcitatie. Laserexcitatie moet een groot genoeg gezichtsveld bestrijken om lange eiwittrajecten te meten, wat vaak wordt bereikt met totale interne reflectie om een evanescent veld van ongeveer 50 μm x 100 μm te creëren of epi-verlichting met bundelvormende optiek (Gaussisch tot top-hat) van ongeveer 80 μm x 80 μm⁸ of een sterk hellende en gelamineerde optische plaat (HILO) met een veld vergelijkbaar met TIRF. Total internal reflection fluorescentie (TIRF) microscopie heeft het voordeel dat het achtergrondsignaal wordt verminderd. Hieronder wordt een eenvoudig, relatief goedkoop TIRF-microscoopontwerp gepresenteerd. Door temperatuurregelingen toe te voegen, is het mogelijk om verschillende thermodynamische eigenschappen te meten, zoals enthalpie, entropie en Gibbs vrije energie⁹. De techniek vereist ook fluorescentielabeling van het membraaneiwit op een mate van labeling die ervoor zorgt dat de meeste membraaneiwitten een fluorescerende tag dragen.

Het transmembrane eiwit dat in dit artikel wordt geïnteresseerd is AQP4. AQP4 is een waterkanaal dat gepolariseerd is in de uiteinden van astrocyten en andere delen van de bloedvaten^van het centrale zenuwstelsel. Het kan tot 3 miljard watermoleculen per seconde transporteren en is betrokken bij waterhomeostase, celmigratie, hersenoedeem, leren en geheugenvorming via synaptische plasticiteit¹¹. Ontregeling van de AQP4-functie is in verband gebracht met diverse neurologische aandoeningen, waaronder hersenoedeem, neuromyelitis optica en epilepsie 12,13,14,15. AQP4 is een eiwit van 32-37 kD, afhankelijk van zijn isoform, en heeft een tetramere quaternaire structuur met acht hydrofobe membraandomeinen die verbonden zijn door verbindende lussen, een intracellulair N-terminale domein en een groot intracellulair C-terminale domein¹⁶. Er zijn twee hoofdisoformen van AQP4, M1 en M23; Het verschil ontstaat door de initiatie bij het methionine 1-residu of het methionine 23-residu. Onderzoek heeft aangetoond dat de M1-isoform dyaden of triaden met zichzelf kan vormen, afhankelijk van zijn palmitoylatietoestand⁹. De M23-isoform assembleert zich tot grote eiwitaggregaten die bekend staan als Orthogonale Arrays of Particles (OAP's). Wanneer het samen tot expressie wordt gebracht, beperkt de M1-isoform de groei van OAP door een perifere eiwitcoating rond de buitenkant te vormen 17,18,19. De dynamiek van OAP-aggregatie kan een belangrijke factor zijn bij het moduleren van waterpermeabiliteit en homeostase in de hersenen. In dit artikel beschrijven we de noodzakelijke stappen om individuele AQP4's in een membraan te volgen en observeren we interacties tussen enkele eiwitten en eiwitten.

Protocol

1. Bereiding van kleine unilamellaire blaasjes

1. Haal de lipidenbouillonoplossingen uit de vriezer en laat ze op kamertemperatuur komen.
2. Haal een schone 10 mL kolf uit de oven en laat hem afkoelen tot kamertemperatuur.
3. Voeg 900 μL spectroscopisch chloroform en 100 μL spectroscopisch methanol toe aan de koele rondbodemkolf, en voeg vervolgens de juiste hoeveelheden van elk lipide toe in de mengsel. Draai de kolf om te zorgen dat de lipiden goed gemengd zijn.
   OPMERKING: Andere auteurs gebruiken verschillende verhoudingen tussen chloroform:methanol, maar we hebben gevonden dat de beste verhouding voor het vormen van uniforme lipidekoeken 9:1 was.
   Een spreadsheet voor het berekenen van de juiste hoeveelheden lipiden is beschikbaar in Supplemental File 1. Bij het voorbereiden van lipiden om de vorming van de lipide-dubbellaag op het oppervlak van het substraat te verifiëren, gebruik dan een fluorescerend gelabeld lipide.
4. Plaats een vacuümdestillatieconnector bovenop de rondbodemkolf, zoals weergegeven in figuur 1, en verbind deze met de stikstofleiding (droogapparaat).
   OPMERKING: Gebruik gezuiverde N₂(g) en laat het door een 0,22 μm filter gaan voordat het wordt aangesloten op het droogapparaat.
5. Zet de N₂(g) aan en stel de druk zo aan dat de doorstroming zo is dat hij nauwelijks voelbaar is op de achterkant van de hand.
   OPMERKING: Het nat maken van de achterkant van de hand kan helpen om de verdamping te voelen.
6. Laat het monster 2,5-3 uur drogen onder een stroom van N₂(g), waarbij je periodiek controleert of de stikstof blijft stromen. Het monster zal waarschijnlijk binnen het eerste half uur droog lijken; blijf echter nog eens 2-2,5 uur stikstof laten stromen om eventueel resterende oplosmiddel te verwijderen.
   OPMERKING: Het monster kan ook een nacht worden gedroogd.
7. Voeg 1 ml buffer toe voor elke 5,0 μmol totale lipide in de rondbodemkolf.
   OPMERKING: De buffer die in deze studie werd gebruikt, bestond uit 100 mM HEPES, 5 mM CaCl₂ en 140 mM NaCl; dit is dezelfde buffer die tijdens de voorbereiding van het monster wordt gebruikt.
8. Plaats een glazen stop op de kolf en wikkel deze in paraffinefolie.
9. Plaats de kolf in een klem op een ringstandaard en dompel de bodem van de fles onder in een bad van een sonicator die op 60 °C is ingesteld. Laat de kolf 1 uur incuberen, waarbij je zachtjes elke 15 minuten draait om multi-lamellaire liposomen te creëren, die verschijnen als een ondoorzichtige oplossing zonder lipiden aan de kolf vast.
10. Na de 1 uur incubatie zet je de sonicator (~35 kHz) aan en zet je de amplitude op de hoogste instelling. Beweeg vervolgens de kolf in het bad om de plek te vinden waar de grootste beweging plaatsvindt, zodat de oplossing tegen de ingang van de kolf botst en spuit. Sonicate 30 minuten, op zoek naar een verandering van ondoorzichtig naar transparant en licht opaal.
11. Verwijder de lipideoplossing uit de kolf en plaats deze in een microcentrifugebuis, en centrifugeer vervolgens op 100.000 × g gedurende 1 uur bij 4 °C. Verwijder het supernatant uit de microcentrifugebuis.
    OPMERKING: Er kan een kleine pellet ontstaan aan de onderkant van de buis. Als de pellet groot is, gooi deze weg en herhaal het proces.
12. Gebruik de SUV's na centrifugatie, bewaar ze een week op 4 °C, of houd ze op -80 °C met wat trehalose.
    OPMERKING: De aanbevolen hoeveelheid trehalose is 1 mg per mL lipideoplossing. Voor optimale resultaten kunnen nieuwe SUV's wekelijks worden gemaakt en in de koelkast worden bewaard.
    OPMERKING: Dit is slechts één methode om SUV's voor te bereiden. Naast SUV's kunnen kleine, middelgrote en grote unilamellaire blaasjes worden geproduceerd met extrusie of gigantische unilamellaire liposomen via elektroformatie 20,21,22,23.

2. Eiwitlabeling

OPMERKING: Het labelen van eiwitten met fluorescerende probes met behulp van verschillende geconjugeerden, zoals NHS-esters en maleimiden, is goed gedocumenteerd en goed begrepen. De mate van labeling (DOL) is echter vooral belangrijk bij het volgen van één eiwit. In deze studie was het essentieel om te bepalen welk percentage transmembraaneiwitten was gelabeld en de verdeling van fluoroforen op elk AQP4-tetrameer.

1. Plaats een dialysebuis in een beker met 0,1 M fosfaatbuffer bij pH 8,3 die door een 0,22 μm filter is gegaan. Laat het vervolgens een nacht in de buffer in omgekeerde positie liggen, zodat het membraan kan conditioneren.
2. Vervang de volgende dag de buffer in de dialysebuis door de eiwitoplossing.
   OPMERKING: Het volume van de eiwitoplossing moet binnen 20-250 μL liggen. Er zou ~1-5 mg opgelost eiwit in de oplossing moeten zitten.
3. Zodra het eiwit in de dialysebuis is geplaatst, laat het dan een nacht omgekeerd in de 0,1 M fosfaatbuffer staan.
4. Na de dialyse wordt het eiwit overgebracht naar een microcentrifugebuis.
5. Bereid een nieuwe dialysebuis voor door stap 2.1 te herhalen.
6. Bereid de NHS-kleurstof voor door een paar korrels (3-4) op een klein stuk weegpapier te plaatsen, het vervolgens over te brengen in een 1,5 mL microcentrifugebuis en op te lossen in 100 μL DSMO. Volg dit met twee 1 mL 10-voudige verdunning in DMSO, waarbij de laatste verdunning de concentraties van elk monster wordt bepaald met UV-vis spectroscopie. Om een gemiddelde DOL van 2-3 te bereiken, voeg je een drievoudig molair overschot reactieve kleurstof toe aan de eiwitoplossing terwijl je voorzichtig schudt.
   OPMERKING: Een standaard UV-vis-spectrometer is hiervoor voldoende, hoewel een spectrometer met klein volume voordelig is vanwege de steekproefgrootte.
7. Voeg de reactieve kleurstof toe aan de microcentrifugebuis waarin het eiwit in gelijke volumes aanwezig is. Zodra de reactieve kleurstof en eiwitten samen zijn gemengd, nutate minimaal 8 uur.
8. Na de nutatie brengt u het gelabelde eiwit over in de dialysebuis die in stap 2.5 is voorbereid en plaatst u deze in een beker met verse fosfaatbuffer. Plaats een roerbalk in de buffer en laat deze zachtjes 6 uur draaien, gevolgd door een bufferwissel en nog eens 6 uur dialyse.
9. Na de twee bufferwissels plaats je de dialysebuis met het gelabelde eiwit in een schoon bekerglas met de uiteindelijke werkende buffer.
   OPMERKING: De uiteindelijke werkbuffer die in deze studie werd gebruikt, bestond uit 100 mM HEPES, 5 mM CaCl₂ en 140 mM NaCl bij pH 7,4.
10. Na de dialyse meet je het DOL met een UV-vis spectrometer.
    OPMERKING: Het is belangrijk om standaardmethoden te volgen voor het meten van het DOL. Hieronder staat een vergelijking voor de berekening.
    (1)
    Waarbij de absorptie gemeten op de piek van de kleurstof is en de eiwitpiek bij 280 nm . De extinctiecoëfficiënt van het eiwit is (berekend uit het molecuulgewicht van het eiwit), terwijl en worden geleverd door de kleurstoffabrikant.

3. Voorbereiding van kwarts-dekmantels met een diameter van 25 mm diameter

OPMERKING: Hieronder staan twee verschillende methoden:

1. Acid wash
   OPMERKING: Er zijn verschillende gepubliceerde zuurwasmethoden, waaronder piranha- en basisets. We hebben vastgesteld dat de onderstaande procedure een extreem schoon en hydrofiel oppervlak biedt zonder etsen, wat de voorkeur heeft voor enkelmolecuulstudies met fluorescentiebeeldvorming.
   1. De Acid Wash-methode vereist een afzuigkap tijdens het verwarmen van de oplossing en persoonlijke beschermingsmiddelen (bril, labjas, handschoenen). Er moet een spuitfles natriumbicarbonaat in de afzuigkap liggen voor het geval er gemorst wordt.
   2. Plaats de dekfolies in een beker en vul met nanozuiver water, 30% waterstofperoxide en geconcentreerd salpeterzuur in gelijke delen volume (1:1:1 oplossing).
   3. Verwarm de dekfolies in deze oplossing gedurende 30 minuten totdat de oplossing begint te bubbelen.
   4. Controleer de oplossing en meng door voorzichtig elke 10 minuten te draaien zodat de dekfolies niet aan elkaar plakken. Bij het draaien van de oplossing moet je de slips zien die uit elkaar glijden en dan weer losgaan. Zodra ze gescheiden zijn, vertraag je geleidelijk om ze uit elkaar te houden, zodat de bubbelende oplossing de slibbels kan omhullen.
      OPMERKING: De oplossing mag niet te krachtig worden verwarmd, omdat de reactie warmte produceert. Stel de kookplaat in op een zacht bubbelen, meestal op de laagste stand. Bij deze instellingen blijft de oplossing op ~70 °C. Vers waterstofperoxide wordt ook aanbevolen.
   5. Zodra er 30 minuten zijn verstreken of de oplossing stopt met bubbelen, laat je de 1:1:1-oplossing afkoelen tot kamertemperatuur en spoel je de dekfolies grondig af met gezuiverd water met zacht draaien.
2. UV-ozon
   1. Maak de kwarts-dekfolies schoon met n-hexaan, daarna methanol, met lensweefsels.
   2. Plaats de dekfolies in een UV-ozonreiniger met het te behandelen oppervlak naar de lamp gericht.
   3. Laat zuurstof 5 minuten bij 5 psi de kamer in; Zet dan de zuurstofstroom uit.
   4. Zet vervolgens de UV-lampen 15 minuten aan en laat de dekfolies minimaal 10 minuten staan zodat de ozonlaag kan ontsnappen.
   5. Na het gebruik van beide reinigingsmethoden, zorg ervoor dat je direct de schoongemaakte dekfolies gebruikt. Als je eerder schoongemaakte slips gebruikt, herhaal je het proces om het oppervlak te regenereren.
      OPMERKING: UV-ozonering vereist consistente circulatie om ozon uit de lucht te verwijderen. Het systeem moet onder een luchtbehandelingssnorkel of in een afzuigkap worden geplaatst.

4. Vorming van de dubbellaags en opname van AQP4 in een dubbellaagmembraan

OPMERKING: De buffer die in deze studie werd gebruikt bestond uit 100 mM HEPES, 5 mM CaCl₂ en 140 mM NaCl bij pH 7,4.

1. Plaats het pas schoongemaakte dekpapier in een 25 mm monsterhouder met een 1/4 inch SM1 lensbuis. Snijd vervolgens een dubbellaagse parafilmpakking van 8 mm diameter en plaats deze in het midden van de monsterhouder (zie Figuur 3).
2. Breng een druppel van 50 μL van de SUV's aan in het midden van de 8 mm pakking, sluit deze af en incubeer dan 1 uur bij 37 °C.
   OPMERKING: Hierdoor kunnen de liposomen fuseren met het hydrofiele kwartsoppervlak en breken, waardoor een continue dubbellaag ontstaat.
   Het is hoogstwaarschijnlijk dat de hoeveelheid liposomen die aan het pakkinggebied worden toegevoegd kan variëren, en een grotere pakking kan meer liposomen vereisen om een continue dubbellaag te vormen. De hoeveelheden die in stap 4.2 worden gespecificeerd, bevorderen echter bijna altijd de vorming van een continue dubbellaag.
3. Spoel na de incubatie het monster af met een pipet om de oplossing te verwijderen. Voeg vervolgens 50 μL verse buffer toe aan de dubbellaag. Herhaal het proces vervolgens in totaal 10 keer.
   OPMERKING: Het is cruciaal dat de pipettip de lipide-dubbellaag niet raakt en dat er nog wat oplossing achterblijft om de dubbellaag gehydrateerd te houden. Wanneer je de punt naar de top van de druppel brengt, zie je dat hij contact maakt. Je kunt de oplossing verwijderen zonder de dubbellaag te beschadigen door minimaal contact met het druppeloppervlak te houden. Uiteindelijk zal de druppel omkeren en naar de pakking toe trekken; Dit is het ideale moment om te stoppen met het verwijderen van oplossing. Het gereflecteerde licht zou op dit punt moeten veranderen en kan dienen als signaal om te stoppen. Als je bang bent dat je te veel oplossing verwijdert, verlaag dan de pipetinstelling tijdens het wassen om een comfortabele buffer boven de lipide-dubbellaag te laten.
   De integriteit van lipide-dubbellaagvorming onder deze omstandigheden kan vooraf worden beoordeeld met behulp van fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP). Dit vereist een component in het lipidenmengsel dat fluorescerend is gelabeld^als 6,7,24,25.
4. Na het voltooien van de laatste wasbeurt verwijder je de buffer opnieuw en voeg je een 50 μL aliquot van het gewenste eiwit toe in detergent op of onder de kritische micellaire concentratie. Sta minstens 1 uur in voor eiwitopname bij 37 °C.
   OPMERKING: Het wasmiddel zal de dubbellaag zachtjes verzachten en het eiwit helpen zich in het membraan op te nemen. In dit protocol werd het detergent gebruikt 50 μM n-Dodecyl-beta-D-thiomaltoside (DOTM), een niet-ionisch detergent, en de eiwitconcentratie was 2 nM.
5. Spoel na een uur het monster af met een buffer om eventuele niet-verwerkte eiwitten en detergenten te verwijderen.
6. Voeg 5 mg condition-polystyreen kralen (Bio-beads) toe aan het monster, laat het minimaal 1 uur intrekken voordat het wordt verwijderd. Het monster is vervolgens klaar voor beeldvorming (zie hieronder).

5. Antifade-additief

1. Los 5 mg Trolox en 80 mg D-glucose op in 10 ml buffer (zie hierboven). Schud en draai rond tot er geen vaste stoffen meer overblijven. Nutaat een nacht in het donker en filter de oplossing vervolgens door een 0,22 μm filter. Maak wekelijks verse klaar.
2. Los 6,5 mg glucoseoxidase (1650 U) en 8 μL Catalase (29.200 U/mL in buffer) op in 92 μL buffer. Meng de oplossing voorzichtig zonder vortex, centrifugeer dan en breng het supernatant over in een nieuwe buis. Bewaar op 4 °C en bescherm tegen licht.
   OPMERKING: Deze oplossing kan enkele maanden in de koelkast worden bewaard; Als er echter troebelheid ontstaat, gooi deze weg en bereid een nieuwe oplossing voor.
3. Meng 99 μL oplossing uit 5,1 met 1 μL uit stap 5,2 in een nieuwe buis. Na de laatste spoeling van het monster voeg je de antifade-oplossing bovenop het monster (de zogenaamde beeldvormingsoplossing).
   OPMERKING: Antifade-oplossingen kunnen de functies van transmembraaneiwitten veranderen; Het is belangrijk om de compatibiliteit met het systeem te verifiëren.

6. Microscoopopstelling en -instellingen

OPMERKING: Voor deze enkelmolecuulstudie werd een op maat gemaakte TIRF-microscoop gebruikt. Deze sectie beschrijft de belangrijkste componenten en belangrijkste uitlijningstechnieken voor een basis fluorescentiemicroscoop die geschikt is voor snelle time-lapse beeldvorming (Figuur 4), die een betrouwbaar instrument is.

1. Gebruik een 633 nm He:Ne-laser om de monsters te exciteren. De laser gaat door een banddoorlaatfilter en een kwart golfplaat om de laserlijn te verfijnen en de excitatie van lineair gepolariseerd licht om te zetten naar circulair gepolariseerd licht.
   OPMERKING: Circulaire polarisatie vermindert het effect van de oriëntatie van de sonde.
2. De bundel gaat door een 300 mm lens en een 633 nm laserlijnfilter, weerkaatst op een 633 nm long-pass dichroïsche spiegel en wordt gefocust op de achterkant van een 100x, 1,45 N/A oliemicroscoopobjectief. Lijn de balk zo uit dat deze soepel door het midden van het objectief gaat en recht blijft bij het verlaten van het objectief.
   OPMERKING: Op dit punt is de microscoop ingesteld op epifluorescentie (epi). Een kleine hoeveelheid melkpoeder kan aan een cuvette met een heldere bodem worden toegevoegd. De cuvette wordt vervolgens op het microscoopobjectief geplaatst, met een druppel dompelolie ertussen. Hierdoor kun je zien dat de straal recht door het objectief heen gaat.
3. De emissie van de fluorescentie-gelabelde eiwitten gaat door het objectief, de dichroïsche spiegel, het long-pass filter en een 300 mm lens, en wordt vervolgens afgebeeld op een EMCCD-camera. Gebruik buislenzen met een langere brandpuntsafstand om beelden op de camera te vergroten en de superlokalisatienauwkeurigheid te verbeteren, wat gunstig is voor langzaam bewegende transmembraaneiwitten en aggregaten. Zorg ervoor dat je de camerapixels kalibreert tot nanometers.
   OPMERKING: 1x vergroting wordt echter bereikt met de buislens die door de fabrikant van het objectief is gespecificeerd, wat de signaal-ruisverhouding verhoogt door fluorescentie op minder pixels te focussen. Veelvoorkomende brandpuntsafstanden zijn onder andere lenzen van 200 mm, 180 mm, 165 mm en 164,5 mm. We raden aan een 1951 USAF vergrotingsdoel te gebruiken. Met een 300 mm lens in deze opstelling werd een pixelkalibratie van 74 nm gemeten bij een totale vergroting van 170x.
4. Regel de temperatuur van het monster met een objectiekraag en een monsterhouder uitgerust met een Peltier-verwarmer/^{koeler 26}.
   OPMERKING: Het handhaven van een stabiele temperatuur is cruciaal om de thermische stabiliteit van de microscoop te waarborgen en nauwkeurige temperatuurafhankelijke metingen en instrumentfocus mogelijk te maken.
5. Piezo-actuatoren bewegen het monster in de XYZ-richting. Zodra een monster scherp is, stel je de bundel af naar de rand van het microscoopobjectief (zie Figuur 4) met behulp van het podium dat aan de uiteindelijke draaispiegel is bevestigd, totdat een kritische hoek is bereikt. Dit genereert een evanescente excitatieveld. De microscoop staat nu in TIRF.
   OPMERKING: Je kunt bepalen dat de microscoop in TIRF staat wanneer de terugreflectie van de laser een lijn is (geen vlek), en de achtergrond van het monster in intensiteit afneemt en verlengt.

7. Gegevensverzameling

OPMERKING: De camera moet worden ingesteld voor snelle gegevensverzameling.

1. Stel de verticale pixelverschuiving in op ongeveer 600 ns en overklok de verticale klokspanning (meestal +4). Vervolgens zet je de horizontale pixelweergave op de maximale instelling (30 MHz bij 16-bit in dit voorbeeld). Stel de versterking van de voorversterker in op 2 en configureer de versterkeruitgang voor elektronenvermenigvuldiging. Zet tenslotte de versterking van de elektronenmultiplicator op het hoogste niveau.
2. Stel de belichting in op 25 ms. Bij 25 ms belichting zorg ervoor dat de framerate iets langer is (25,802 ms op de hier gebruikte camera).
3. Stel het laservermogen zo aan dat het signaal duidelijk boven de achtergrond is.
   OPMERKING: Het aanpassen van de laserkracht kan uitdagend zijn. Te hoog, en de sonde bleekt te snel; te laag maakt de signaal-ruisverhouding tracking moeilijk. We raden aan het vermogen zo in te stellen dat het signaal de achtergrond met 3-5 keer overtreft voor de deeltjes met het zwakste signaal. Sectie 2 legt uit waarom moleculaire helderheid een verdeling vertoont.
4. Verzamel genoeg data om minstens 1.000 tracks per sample te leveren.

8. Trackinganalyse

OPMERKING: In onze laboratoria wordt enkeldeeltjes-tracking analyse meestal uitgevoerd met aangepaste scripts in MATLAB, gebaseerd op werk van Crocker en Grier en aangepast door de auteurs ^3,26,27. Hieronder volgt een beschrijving met behulp van ImageJ, een vrij beschikbare software voor de onderzoeksgemeenschap. Beide methoden leveren identieke resultaten op.

1. Snijd datasets bij tot een consistente grootte en correcteer daarna de achtergrond met ImageJ.
   OPMERKING: Als de verzamelde gegevens tussen sets hetzelfde zijn, is het niet nodig om te croppen. Dit gebeurt meestal alleen als het interessegebied op de camerasensor tussen dataverzamelingen is verschoven. De mogelijkheden van ImageJ kunnen aanzienlijk worden uitgebreid met plugins. Een optie is om FIJI te installeren en te gebruiken, wat ImageJ is gebundeld met een set standaardplugins. Onder deze plugins bevindt zich TrackMate, dat gebruikt zal worden voor het protocol hier^28,29.
   De ImageJ Wiki-site biedt walkthroughs en voorbeelden van veel plugins. Het bevat ook videotutorials.
2. Binnen FIJI sleept u de film of het gestapelde *.tif bestand dat geanalyseerd moet worden slepen en neerzetten (zie Supplemental File 2).
3. Voer de pixelkalibratiedetails in. Selecteer in het tabblad Analyseren Schaal instellen en pas de pixel-naar-afstand kalibratie toe voor het instrument.
4. Sla een kopie op om eventuele wijzigingen ten opzichte van het origineel bij te houden.
5. Trek de achtergrond af van het gekozen venster en pas deze toe op de opgeslagen kopie van de originele data. Kies in het tabblad Proces Achtergrond aftrekken.
   OPMERKING: Dit wordt geoptimaliseerd op basis van de data. Een goed beginpunt is het gebruik van een "rollende bal" die groter is dan de deeltjes die worden afgebeeld.
6. Selecteer in het tabblad Plugins Tracking | TrackMate. Dit opent het dialoogvenster TrackMate , dat de gebruiker door het trackingproces leidt.
   OPMERKING: Zodra Tracking voltooid is, is het mogelijk om de sporen buiten ImageJ verder te analyseren.

9. Gegevensverwerking

OPMERKING: Hier wordt besproken hoe de representatieve data verwerkt en hoe je stapgrootteverdelingen berekent en een gemiddelde diffusieconstante krijgt.

1. Sleep en laat de afbeeldingsstapel vallen in FIJI; Vervolgens pas je de kalibratie toe (74 nm/pixel).
2. Trek de achtergrond af met de rollende bal-subtractie met een breedte van 5 pixels. Snoei het veld in vier afzonderlijke secties van 11 μm x 11 μm en analyseer apart.
   OPMERKING: Dit is om eventuele drempelvariatie door het excitatieveld te minimaliseren bij het volgen van membraaneiwitten.
3. Start de TrackMate-plugin . Controleer of de kalibratie op de pixels is toegepast (zie Supplemental File 3) en dat de tijd het gewenste bereik bestrijkt.
   1. Selecteer in TrackMate de Laplaceaan van Gaussisch (LoG) als detectiemethode voor de deeltjes, met een geschatte diameter van 350 nm met behulp van het preproces-mediaanfilter. Klik op de knop Voorbeeldweergave om te controleren of de gedetecteerde deeltjes redelijk zijn.
      OPMERKING: Sommige deeltjes kunnen duidelijk op de achtergrond zijn; Maak je hier geen zorgen over – ze worden in de volgende stap geëlimineerd.
   2. Wanneer je tevreden bent met de telinstellingen, verwerk je de rest van de stapel, gevolgd door drempelwaarde. Gebruik automatische drempel of sleep het selectievak om de drempel aan te passen.
   3. Na het kiezen van hoe de gedetecteerde deeltjes te visualiseren, kies je de trackingmethode: Advanced Kalman Tracker voor deze dataset, met de volgende instellingen: 350 nm voor de zoekradius en een maximale framegap van 2 frames.
      OPMERKING: Het is ook mogelijk om straffen, sporensplitsing en sporensamenvoeging toe te voegen. Voor deze dataset werd alleen tracking uitgevoerd.
   4. Bepaal hoe je de tracks filtert en visualiseert.
      OPMERKING: In deze dataset worden alleen gedetecteerde vlekken weergegeven (zie Supplemental File 4).
   5. Na het verwerken van de afzonderlijke sporen exporteert u de trackinggegevens als een XML-bestand voor gebruik in een spreadsheetbewerkingssoftware (zie Supplemental File 5).

Results

Zoals beschreven in protocolsectie 2, werden lysines gelabeld met NHS-esters geconjugeerd aan een fluorescerende kleurstofmolecuul (NHS-kleurstof). Na conjugatie met het eiwit meet je de DOL met een UV-Vis spectrometer. Voor dit experiment was de DOL van AQP4-tetrameren 4,12. Bepaal vervolgens de kans dat elk AQP4-tetrameer ten minste één kleurstofmolecuul bevat met behulp van de hieronder gegeven Poisson-verdeling.

(2)

Waar P de kans is dat elke AQP4 gelabeld is, is de kans dat elke AQP4-tetrameer een fluorescerend label heeft 98% volgens vergelijking 2. De verdeling van labels per tetrameer wordt weergegeven in Figuur 2 en weerspiegelt de helderheidsverdeling die in het monster is waargenomen.

De signaal-ruisverhouding die in deze voorbeeldgegevens werd bereikt, was 8-9x boven de achtergrond voor een enkele fluorofoor en meer dan 15-20 voor de helderste deeltjes. Deze variantie komt voort uit de positie in de excitatiestraal en de DOL zoals beschreven in protocol stap 2.

Binnen het gegenereerde XML-bestand zijn de kolommen van belang J, K, L en M, die respectievelijk overeenkomen met het deeltjenummer-ID, het frame waarin het deeltje werd gedetecteerd, de X-positie van het deeltje en de Y-positie van het deeltje (zie Supplemental File 6). Op het tweede vel van het bestand worden de stapgrootteverdeling en gemiddelde diffusiecoëfficiënt berekend, waarbij de staplengtes de afstanden zijn die een deeltje tussen frames aflegt, en de gemiddelde diffusie wordt gegeven door vergelijking 3:

(3)

Waarbij D_ave de gemiddelde diffusiecoëfficiënt is, en Δt de framerate. Deze vergelijking gaat uit van Brownse beweging, wat over het algemeen geldig is voor kleine verplaatsingen en kan worden bevestigd door het gemiddelde kwadraat-verplaatsing-tegen-tijd-label te analyseren uit een steekproef van individuele sporen ^3,30,31.

Een histogram van stapgroottes toont een verdeling van deeltjes die diffunderen, wat kan worden toegeschreven aan OAP's van verschillende grootte (Figuur 5).

Figuur 1: Lipidendroogapparaat. Het apparaat bestaat uit een 10 mL rondbodemfles met een vacuümdestillatieconnector. Stikstof komt onder lage druk binnen via een 0,2 μm spuitfilter met een naald die is bevestigd aan een gele synthesekap, die is aangesloten op een vacuümdestillatieconnector. De druk wordt afgevoerd via Tygon-buis die aan een spuit met een afgesneden naald is bevestigd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Verwachte verdeling van fluorescentielabels op elke AQP4-eenheid met behulp van vergelijking 2. Het meest waarschijnlijke aantal fluoroforen is 4, en 98% van alle AQP4's heeft een fluorescerende label. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Monsterhouder-assemblage. De assemblage bestaat uit een 1" SM1 lensbuis waarbij de mannelijke schroefdraad is verwijderd en afgeschuind om interferentie met het microscoopobjectief te voorkomen. Bevat een kwarts deklaag en een parafilmpakking. De hele constructie wordt vastgezet met een SM1-retainering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Microscoop. Aan de rechterkant staat een vereenvoudigd diagram van de microscoop; De groene lijn toont het excitatielicht dat van de laser komt. Beginnend rechts gaat het laserlicht door een 1/4 golfplaat, waarna het wordt gefocust door een 300 mm lens. Het licht wordt door een lange dichroïsche spiegel op het objectief weerkaatst, waar het wordt gefocust op de achterste opening. Door een translatiespiegel te gebruiken om de excitatiebundel te verschuiven, wordt de bundel aan de rand van de opening van het objectief geplaatst, waardoor een evanescent veld in het monster ontstaat. Het in-focus uitgezonden licht wordt door het objectief opgevangen en wordt weergegeven door de rode lijn. Het uitgezonden licht gaat vervolgens door het dichroïsche filter, vervolgens een longdoorlaatfilter, en wordt door een 300 mm lens op de camera gefocust, wat een 1,7x optische vergroting oplevert (170x totale vergroting van het objectief en de buislens). Aan de linkerkant staat een afbeelding van de microscoop. Let op dat extra draaispiegels worden gebruikt om de laser correct te positioneren. Tegelijkertijd is de detectiearm zo ingericht dat de verzameling fotonen uit de fluorescentief-gelabelde transmembraaneiwitten maximaal wordt geoptimaliseerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Histogram van stapgroottes. De blauwe lijn met rode cirkels is een histogram van alle stapgroottes. De zwarte lijn past bij meerdere diffusiecoëfficiënten. De stapgrootte-kansverdeling wordt gegeven door: waarbij f_i de fractiepopulatie is van elk type diffunderend deeltje, ervan uitgaande dat elk een Brownse beweging ondergaat. Het histogram en de passing tonen een heterogene verdeling van langzamer en sneller bewegende deeltjes, toegeschreven aan een verdeling van meerdere OAP-groottes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Supplemental File 1: Spreadsheetcalculator gebruikt om mol% samenstellingen, totale lipidenniveaus en optionele fluorescerende/FRAP-componenten voor SUV-voorbereiding te bepalen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Supplemental File 2: Ruwe single-molecule fluorescentiemicroscopie time-lapse beeldstack gebruikt bij trajectorentracking (bronbestand voor TrackMate-tutorial). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Supplemental File 3: Geanimeerde preview van ruwe fluorescentiegegevens uit één molecuul met intensiteit en achtergrond vóór de verwerking. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Supplemental File 4: Animatie van gefilterde deeltjespaden (na drempelwaarde) die representatieve AQP4-trajecten in de tijd tonen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Supplemental File 5: Geanimeerde overlay die volledige veld-deeltjestracking van AQP4-moleculen toont met behulp van TrackMate-uitvoer. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 6: Spreadsheet met geëxtraheerde trajectcoördinaten en berekende stapgrootteverdelingen gebruikt voor diffusieanalyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

In dit artikel presenteren we een enkeldeeltjes-trackingmethode om individuele membraaneiwitten direct te observeren terwijl ze door een solide-ondersteunde lipide-dubbellaagmembraan bewegen en met elkaar interageren. AQP4 werd gekozen als representatief voorbeeld vanwege zijn vermogen om dynamische zelfassemblages te vormen die worden gereguleerd door de verschillende isovormen 32,33,34. Hierboven beschrijven we een betrouwbare methode voor monstervoorbereiding en belangrijke parameters om enkelmembraaneiwitten op millisecondetijdschalen te volgen. De stappen omvatten: (1) het voorbereiden van SUV's, (2) het bepalen van het juiste niveau van fluorescerende labeling, (3) het voorbereiden van vaste onderlagen, (4) het creëren van transmembraaneiwitmonsters binnen een vaste-ondersteunde lipide-dubbellaag, (5) het voorbereiden van antifade-middelen, (6) het bouwen van een eenvoudige microscoop van één molecuul, (7) het verzamelen van trackinggegevens van één molecuul, en (8) het analyseren van de trackinggegevens met behulp van ImageJ.

De beschreven stapsgewijze methode is conceptueel eenvoudig; Echter, elke cruciale stap heeft zijn eigen valkuilen en beperkingen. Hiervan is de voorbereiding van het monster het moeilijkst (stappen 1-5). Daarom moeten verschillende details in gedachten worden gehouden. De eerste is hoe je een vast ondersteunde lipidendubbellaag creëert. Er zijn drie hoofdmethoden: (1) Langmuir-Blodgett (LB), (2) SUV-fusie en rupture, en (3) spin-coating 35,36,37,38,39. Elke methode heeft zijn voor- en nadelen. Zo biedt de Langmuir-Blodgett-methode meer controle over de eigenschappen en chemische samenstelling van dubbellagen, inclusief asymmetrische samenstellingen tussen de twee bladjes, en maakt het de vorming van meerdere lagen op een gecontroleerde manier mogelijk. Het gebruik van een LB-trog is echter technisch veeleisend, tijdrovend en kostbaar om^{35 te} verkrijgen. Spin-coating is een relatief eenvoudige techniek om lipide-dubbellagen te creëren; het heeft echter de neiging om meerdere lagen te produceren en vereist een groot overschot aan materiaal, vaak een onpraktisch grote hoeveelheid³⁹. Blaasfusie en ruptuur zijn eenvoudige processen die slechts een kleine hoeveelheid materiaal vereisen. Het creëren van een hydrofiel oppervlak is echter cruciaal, en sommige lipidensamenstellingen vormen dubbellagen via blaasfusie gemakkelijker dan andere (bijvoorbeeld in ons laboratorium hebben we ontdekt dat blaasjes met een netto negatieve lading alleen door blaasfusie dubbellagen vormen met toevoeging van divalente kationen en verlengde incubatietijden)⁴⁰. Naast het vestigen van een hydrofiel oppervlak (stap 3), zijn andere belangrijke overwegingen bij het vormen van een solide ondersteunde dubbellaag door vesikelfusie het wassen van de nieuw gevormde dubbellaag zowel vóór als na het opnemen van het membraaneiwit. De pre-insertion wash verwijdert overtollige SUV- en grotere multilamellaire blaasjes (MLV's), terwijl de laatste wash na het inbrengen van het membraan het niet-ingenomen eiwit verwijdert. Onvoldoende wassen kan achtergrondsignalen introduceren tijdens trackingstudies.

We hebben talrijke detergenten gescreend om te bepalen of ze geschikt zijn voor transmembraaneiwitinvoeging in vaste-ondersteunde lipide-dubbellagen, waaronder C12E9, Tween-20, TritonX-100 en vele anderen. Ons favoriete wasmiddel is DOTM omdat het makkelijk te verwijderen is en het meest mild is voor het membraan (minder snel het membraanbestand verstoort). De hoeveelheid toegevoegde eiwitten is cruciaal. Te veel, en het zal onmogelijk zijn om single tracks te observeren. Bij het aanpassen van deze procedure aan andere transmembrane eiwitten moet de hoeveelheid worden aangepast door trial-and-error. De hoeveelheden die in deze procedure worden gegeven, zijn echter een uitstekend beginpunt. De hoeveelheid detergent moet op of onder de kritische micellaire concentratie worden gehouden; anders wordt de dubbellaag opgelost en verwijderd van het kwartssubstraat.

Het inbrengen van membraaneiwitten in de ondersteunde lipide-dubbellaag moet worden geoptimaliseerd voor elke set experimentele voorwaarden. Er zijn echter enkele gangbare methoden om dit te bereiken, waaronder het gebruik van proteoliposomen en de directe opname van membraaneiwitten in een vooraf gevormde dubbellaag⁴¹. Een proteoliposoom is een liposoom, zoals een SUV, met een eiwit erin ingebed. Deze proteoliposomen kunnen fuseren met een vooraf gevormde, solide ondersteunde lipide-dubbellaag of gelijktijdig worden opgenomen met de SUV's tijdens de vorming van de dubbellaagvorming⁴². De fusie veroorzaakt een ruptuur, waarbij het eiwit in het membraan vrijkomt. Het is eenvoudig te implementeren, maar het resulteert in een willekeurige oriëntatie van de membraaneiwitten. Dit kan leiden tot sterke interacties met de vaste ondersteuning, wat resulteert in verschillende diffusie-eigenschappen afhankelijk van de oriëntatie van het eiwit³. Dit protocol beschrijft een methode die directe incorporatie gebruikt, wat een oriëntatievoorkeur oplevert voor AQP4 en andere membraaneiwitten met grote hydrofiele domeinen aan één kant van het eiwit ^2,5,43,44.

Directe observatie is een krachtig hulpmiddel dat wordt gebruikt bij wetenschappelijke ontdekkingen. Dynamische beeldvorming van één molecuul is vooral belangrijk in de membraan-eiwitbiofysica, waar het observeren van de beweging en interacties van individuele eiwitten wordt gebruikt om hypothesen te testen of nieuwe te genereren die beter beschrijven hoe een eiwit zich gedraagt. Het hier beschreven protocol en de methoden zijn ideaal voor tweedimensionale, vaste, ondersteunde lipide-dubbellagen, maar kunnen worden uitgebreid naar complexere omgevingen met meerdere componenten:², levende cellen^{34, 45, 46, 47} en drie dimensies⁴⁸. Single-molecule tracking opent de deur naar vele andere experimenten, waaronder tweekleurige single-molecule tracking⁴⁹, single-molecule FRET^50,51, en dynamische superresolutiebeeldvorming zoals Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) en Point Accumulation Imaging Nanoscale Topography (PAINT). Door het instrument uit te breiden met temperatuurregeling, kunnen ook de thermodynamische eigenschappen van membraaneiwitten worden onderzocht 26,43,52.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4 Waveplate	Thorlabs	WPQ05M-633	zorg ervoor dat het overeenkomt met de laser
100X Oil Objective	Olympus	12-563-659	1.45 N/A apochromatisch
16:0-18:1 PC	Avanti Polar Lipids	850457	POPC Fosfolipiden
18:0 PEG2000 PE	Avanti Polar Lipids	880210	Ammoniumzout
300mm Lens	Thorlabs	AC254-300-A-ML
633 nm He:Ne Laser	Melles Griot	05-LHP-927	Kan worden gewijzigd naar andere bronnen en naar andere golflengten
633nm band-pass filter	Chroma Tech	633/10X	Aanpassen aan de gebruikte laser
655nm Long-Pass Filter	Chroma Tech	ET655lp	Veranderen om te passen bij de golflengten van de kleurstof/laser
Andor Solis I	Andor	Andor Solis I	Software voor beeldopname
ATTO 655	ATTO-TEC	AD 655	NHS-Ester modificatie, elke kleurstof met de modificatie die geschikt is voor enkelmolecuulwerk kan worden gebruikt. ATTO wordt aanbevolen, maar Cy5/7 kan worden gebruikt
Bio-beads SM-2 Resin	BioRad	1523922
Calcium Chloride	Millipore Sigma	C4901
Catalase	Sigma-Aldrich	C3155-50MG	uit runderlever, waterige oplossing, ≥30000 eenheden/mg
Chloroform	Fisher Scientific	C547-1	HPLC of spectroscopische kwaliteit
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667-500MG
Coverslips	ESCO Optics	R525000	25mm Quartz
Dichroic Beamsplitter	Semrock	FF545/650-Di01-25x36	Aanpassen aan de golflengten van de kleurstof/laser
EMCCD Camera	Andor	iXon Ultra 888
Falcon Tubes 15mL	Greiner Bio-one	188261	cellestar cell cultuurbuizen
Glucose Oxidase	Sigma-Aldrich	G2133-50KU	uit Aspergillus niger, typer VII, ≥100000 eenheden/g vast (zonder toegevoegde zuurstof)
Heat Gun	Harbor Freight	56434	Gebaten bij het verwarmen van het parafilm, over het algemeen kan elke hittepistool worden gebruikt
HEPES	Fisher Bioreagents	BP310-500
Low Autofluorescence Immersion Oil	Thorlabs	MOIL-30
Methonal	Fisher Scientific	A452-1	HPLC of spectroscopische kwaliteit
Micro Centrifuge Tube	VMR	525-1126	1,5 mL
Micro Pipetters	Ependorf		Verschillend; 1000 µL, 100 µL en 10 µL worden aanbevolen
Ø1.5" Lens Tubes	Thorlabs	SM1.5L10	De buitenste draad is geschaafd voor monstervoorbereiding
Optical Table	Newport	RPR Reliance	De grootte van de tafel is afhankelijk van de beschikbare ruimte
Optical Tissues	Thorlabs	MC-50E	Reiniging van verschillende componenten
Parafilm	Millipore Sigma	P7669	Controleer of er geen fluorescerende gassen vrijkomen tijdens het proces
Piezo Actuator	Newport	PZA12
Pneumatic Vibration Isolators	Newport	I-2000 Series	gebruikt om de optische tafel te stabiliseren voor eventuele ongelijkheden
Refrigerated Bath	Fisher Scientific	Isotemp 3016
Shutter Controller	Thorlabs	SC10	Gelinkt aan de beeldsoftware
Sodium Chloride	Millipore Sigma	S988
Steritop Filter	Millipore Sigma	S2GPT05RE
Switchbox Driver and Controller	Newport	PZC200	Stage controller
Syringe Filter	J.T. Baker	SF01-98	PES 25mm 0.2 µM
TEC Element	Thorlabs	TEC3-2.5	Wordt gebruikt om de Peltier-warmtepomp op de monsterhouder en objectiefkraag aan te sluiten
Temperature contoller	Meerstetter Engineering	TEC-1091
Temperature Detector	Thorlabs	TH100PT
Thermistor	Thorlabs	TH10K
Tube-O-Dialyzer	G Biosciences	786-611	4K MWCO
UV Ozone Cleaner	Novascan	PSDP_UV	Pro Series - Digital
Zoom Optics	Thorlabs	SM1NR1