Methodenartikel

Modellering van mitochondriale ziekten met behulp van hersenorganoïden: een focus op mitochondriale encefalomyopathie, lactaatacidose en beroerte-achtige episodes

DOI:

10.3791/69303

⸱

10 oktober 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Kitasato University School of Medicine, 2Molecular Genetics Unit, Kitasato University Graduate School of Medical Science, 3Department of Otolaryngology, Head & Neck Surgery, Gene Therapy for Hearing Impairment and Deafness, Tübingen Hearing Research Center, University of Tübingen, 4Department of Physiology, Keio University School of Medicine, 5Department of Physiology and Cellular Biophysics, Columbia University Medical Center, 6Institute for Disease Modeling, Kurume University School of Medicine, 7Department of Diabetes, Endocrinology and Nutrition, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 8Department of Clinical Biology and Hormonal Regulation, Tohoku University Graduate School of Medicine, 9Keio University Regenerative Medicine Research Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hersenorganoïden dienen als een waardevol model voor studies naar mitochondriale encefalomyopathie, lactaatacidose en beroerte-achtige episodes (MELAS), bieden inzicht in hun onderliggende pathofysiologie en bieden een platform voor het screenen van geneesmiddelen. Organoïden afgeleid van cellijnen met verschillende niveaus van heteroplasmie van ziekteverwekkende genen vertonen significante fenotypische verschillen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriale encefalomyopathie, lactaatacidose en beroerte-achtige episodes (MELAS) zijn mitochondriale aandoeningen die meestal worden veroorzaakt door een m.3243A>G-variant in mitochondriaal tRNALeu. Om de pathofysiologie van MELAS te onderzoeken, hebben we hersenorganoïden gegenereerd uit meerdere geïnduceerde pluripotente stamcellijnen (iPSC) afkomstig van een patiënt met MELAS die de m.3243A>G-variant draagt. Deze lijnen delen een identieke nucleaire genetische achtergrond, maar verschillen in hun heteroplasmieniveaus waarbij de m.3243A>G-variant betrokken is. We zagen significante verschillen in organoïdegrootte, morfologie en neurale inductie-efficiëntie, die correleerden met de mate van heteroplasmie. Gedissocieerde neuronen van de organoïden werden overgebracht naar een 2D-cultuursysteem, wat handig en geschikt is voor high-throughput drugsscreening. De organoïden vertoonden ook significante verschillen in de vorming van neurale netwerken, afhankelijk van de heteroplasmieniveaus. Onze resultaten suggereren dat patiënt-afgeleide iPSC-gebaseerde organoïdemodellen een nuttig platform vormen voor het bestuderen van MELAS-mechanismen en voor het screenen van geneesmiddelen. Deze video presenteert uitgebreide en gebruiksvriendelijke methoden, inclusief protocollen voor het genereren van organoïden en het evalueren van fenotypes.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriale myopathie, encefalopathie, lactaatacidose en beroerte-achtige episodes (MELAS) zijn mitochondriale ziekten die worden gekenmerkt door neurologische disfunctie, beroerte-achtige episodes en verschillende systemische symptomen. De meest voorkomende oorzaak is een m.3243A>G-variant in het mitochondriaal leucine-tRNA-gen, MT-TL11. Aangenomen wordt dat deze variant de taurinemodificatie van het anticodon verslechtert, waardoor de efficiëntie van de leucinevertaling wordt verminderd en wordt bijgedragen aan mitochondriale disfunctie in MELAS 2,3,4. Er zijn met name verbeteringen in de symptomen gemeld na toediening van hoge doses taurine 5,6. De aanwezigheid van non-responders suggereert echter dat aanvullende, nog niet geïdentificeerde, pathofysiologische mechanismen kunnen bijdragen aan de ziekte bij personen met de m.3243A>G-variant.

Om ziektemechanismen veroorzaakt door genetische varianten op te helderen, is het ideaal om experimentele modellen te gebruiken waarin alle variabelen identiek zijn, behalve de causale variant, waardoor nauwkeurige fenotypische vergelijkingen mogelijk zijn. Genoombewerkte cellijnen en diermodellen met gecorrigeerde varianten worden vaak gebruikt als controles voor nucleaire genaandoeningen. Het herstel van mtDNA-varianten blijft echter technisch uitdagend, zelfs met geavanceerde genoombewerkingstechnologieën7. Daarom blijft het opzetten van experimentele modellen met identieke nucleaire achtergronden een uitdaging. Om dit probleem aan te pakken, gebruikten we twee geïnduceerde pluripotente stamcellijnen (iPSC) die waren afgeleid van dezelfde patiënt met MELAS die alleen verschillen in hun heteroplasmieniveaus (d.w.z. het aandeel mitochondriaal DNA dat de MT-TL1 m.3243A>G variant8 draagt), en genereerden we hersenorganoïden als een ziektemodel. Hoewel heteroplasmieniveaus kunnen fluctueren tijdens celpassage of differentiatie, waardoor fenotypes mogelijk worden beïnvloed en batch-tot-batch variabiliteit in experimentele resultaten kan ontstaan, blijven van de patiënt afgeleide cellen die mitochondriale genvarianten dragen waardevol voor het onderzoeken van de pathogenese van de ziekte.

In deze studie genereerden we hersenorganoïden uit iPSC's afkomstig van een patiënt met MELAS en onderzochten we hun pathofysiologie om ziektemechanismen beter te begrijpen. Met behulp van twee iPSC-lijnen met hoge en lage heteroplasmatieniveaus zagen we significante verschillen in neurale inductie-efficiëntie, die correleerden met de mate van heteroplasmie. Onze bevindingen suggereren dat patiënt-afgeleide iPSC-gebaseerde hersenorganoïden een waardevol platform bieden voor het ophelderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan MELAS en voor het vergemakkelijken van medicijnscreening.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De twee iPSC-lijnen (2-6 en 2-8) werden afgeleid van de fibroblasten van dezelfde MELAS-patiënt met behulp van gevestigde methoden8. Ze verschillen alleen in hun heteroplasmieniveaus. De 414C2 iPSC-lijn, vastgesteld van een gezond persoon, werd gebruikt als controle. Het protocol dat in deze studie werd gebruikt, volgde de richtlijnen van de ethische commissie van de Kitasato University School of Medicine (#G22-02).

1. Celcultuur

  1. Ontdooien van diepgevroren celvoorraden
    1. Bereid 6-well platen voor door ze te coaten met laminine volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Verwarm het kweekmedium voor feedervrije iPSC's met 10 μM ROCK-remmer tot 37 °C.
    3. Haal de bevroren iPSC-injectieflacon uit de tank met vloeibare stikstof (LqN2) en ontdooi snel in een waterbad van 37 °C.
    4. Breng de ontdooide suspensie over in 10 ml voorverwarmd medium. Centrifugeer bij 120 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (22 °C).
    5. Verwijder voorzichtig het bovenstaande middel en suspendeer de pellet voorzichtig opnieuw door op de buis te tikken. Voeg vers medium en zaadcellen toe aan platen met 6 putjes die vooraf zijn gecoat met laminine. Incubeer bij 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO2 .
  2. Gemiddelde verandering
    1. Vervang het medium (zonder ROCK-remmer) elke 1-2 dagen.

2. Genereren van cerebrale organoïden

  1. Initiatie van differentiatie (dag 0)
    1. Verwijder het medium van iPSC (~70-80% confluent) kweekplaten. Cellen wassen met PBS.
    2. Voeg enzymoplossing toe en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C.
    3. Voeg medium toe om de reactie te stoppen. Breng de cellen over in een buis van 15 ml. Centrifugeer bij 190 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (22 °C).
    4. Resuspendeer de pellet in 1 ml differentiatiemedium met 30 μM ROCK-remmer, 5 μM SB431542 en 2,5 μM IWP-2.
      OPMERKING: Het basismedium is hetzelfde als dat gebruikt in stap 1.1.2.
    5. Tel de cellen. Zaad 3 × 103 cellen in 100 μL per putje in U-vormige, 96-wells, laag hechtende platen. Incubeer gedurende 6 dagen bij 37 °C, 5% CO2.
  2. Gemiddelde verandering (dag 6)
    1. Breng organoïden (uit stap 2.1.5) over van een plaat met 96 putjes naar een schaaltje van 10 cm met behulp van een pipet met brede boring. Voeg 50 μL medium (DMEM/F12 met 1% N2, 1% glutaminevervanger, 1% NEAA, 2,5 μM IWP-2, 5 μg/ml heparansulfaat en 1% PS) toe aan elk putje van een nieuwe plaat met 96 putjes.
      OPMERKING: Gebruik tijdens de experimenten pipetten met een brede boring bij het overbrengen van organoïden om te voorkomen dat hun 3D-structuur wordt verstoord. Bovendien zijn 8-kanaals pipetten handig om experimenten snel en nauwkeurig uit te voeren.
    2. Verzamel organoïden in tubes van 2 ml. Verwijder het medium voorzichtig om de organoïden niet aan te zuigen en voeg 1,5 ml DMEM/F12 toe. Herhaal 3x om de organoïden te wassen.
    3. Verwijder het medium en voeg 500 μL vers medium toe aan de tubes met organoïden. Breng alle organoïden over in een schaal van 10 cm en voeg vervolgens 5 ml medium toe om het gemakkelijker te maken om elke organoïde op te nemen.
    4. Pak een enkele organoïde op met behulp van een micropipet die is ingesteld op 50 μl en breng deze over in een putje met een plaat met 96 putjes. Herhaal dit totdat alle organoïden zijn overgebracht naar de plaat met 96 putjes (eindvolume 100 μL). Incubeer gedurende 3 dagen bij 37 °C, 5% CO2.
  3. Gemiddelde verandering (dag 9)
    1. (Optioneel) Breng de organoïden over in een schaaltje van 10 cm met behulp van 8-kanaals pipetten. Sla stap 2.3.1 over bij het gebruik van enkelkanaals micropipetten en ga verder met stap 2.3.2.
    2. Verzamel organoïden in tubes van 2 ml. 3x wassen met DMEM/F12 als stap 2.2.2.
    3. Resuspendeer in differentiatiemedium (1:1 DMEM/F12 en neurobasaal) met 1% N2, 2% B27 zonder vitamine A, 100 μM 2-mercaptoethanol (ME), 2,5 μg/ml insuline, 1% glutaminevervanger, 0,5% NEOA en 1% basaalmembraanextract.
      OPMERKING: Bereid kleine hoeveelheden basaalmembraanextract voor eenmalig gebruik en bewaar ze bij -20 °C tot ze nodig zijn. Ontdooi het extract bij 4 °C zonder het boven de 8 °C te laten komen, meng het vervolgens tot een koud medium en verwarm het medium ongeveer 30 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Breng ~10 organoïden per putje over in een plaat met 6 putjes. Stel het uiteindelijke volume van het medium voor 1 putje in op 2 ml. Kweek statisch gedurende 6 dagen bij 37 °C, 5% CO2.
  4. Gemiddelde verandering (dag 15)
    1. Verzamel organoïden in tubes van 15 ml. Laat de buis ongemoeid totdat alle organoïden zich hebben gevestigd. Verwijder het bovenstaande en voeg een vers differentiatiemedium toe (hetzelfde als in stap 2.3.3 maar dan met B27 + vitamine A).
      OPMERKING: Meestal nestelen organoïden zich op de bodem van de buis zonder centrifugatie. Het is echter mogelijk dat kleine organoïden die zijn afgeleid van iPSC's van patiënten niet efficiënt zinken. Centrifugeer in dat geval de buisjes bij 120 × g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur om de organoïden op te vangen.
    2. Breng ~10 organoïden per putje over in een plaat met 6 putjes. Kweek statisch gedurende 15 dagen bij 37 °C, 5% CO2.
    3. Vervang het medium elke 5-7 dagen tot dag 30.

3. Dissociatie van cerebrale organoïden voor 2D-cultuur (dag 30)

  1. Coating van platen met poly-L-ornithine (PO)
    1. Bereid PO-voorraadoplossing door 10 mg PO op te lossen in 66,7 ml H2O en maak kleine hoeveelheden voor eenmalig gebruik. Bewaar ze bij -20 °C tot gebruik.
    2. Verdun de PO-stockoplossing 1:5 met H2O en bestrijk de kweekplaten met de verdunde oplossing. Incubeer een nacht bij 37 °C.
  2. Laminine coating
    1. PO verwijderen en goed 3 x 5 minuten wassen met PBS.
    2. Voeg laminine toe (1:1.000 in PBS) en incubeer bij 37 °C gedurende 3 uur of een nacht.
      OPMERKING: Standaardoplossing van laminine is 1 mg/ml. Bereid kleine hoeveelheden voor en bewaar ze bij -80 °C tot ze nodig zijn.
  3. Dissociatie in afzonderlijke neuronen
    1. Ontdooi de dissociatieoplossing voor gebruik gedurende 1 uur bij 4 °C.
    2. Breng de organoïden over in een tube van 15 ml en laat de tube ongestoord staan totdat alle organoïden zijn neergestreken. Verwijder het bovenstaande en voeg 5 ml PBS toe om de organoïden te spoelen.
    3. Voeg na het verwijderen van PBS 1 ml enzymoplossing toe en pipetteer voorzichtig 1-2x. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C; pipetteer meerdere keren. Incubeer indien nodig nog 2-3 minuten. Pipetteer opnieuw om de dissociatie te voltooien.
    4. Centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 min. Verwijder supernatant, voeg 1 ml dispersieoplossing toe en pipetteer.
    5. Laagisolatieoplossing eronder en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 × g .
    6. Voeg 1 ml neuronaal medium toe (neurobasaal met 1% B27, 0,25% glutaminevervanger, 1% PS) en meng. Leid de suspensie door een zeef van 70 μm in een buis van 50 ml.
    7. Tel de cellen. Zaadcellen op 1 × 105 cellen/cm2 op PO/laminine gecoate platen. Vervang het medium elke 4-7 dagen tot dag 60.

4. Oogsten van cellen en organoïden voor cellulaire en moleculaire analyse

  1. Organoïde fixatie voor immunofluorescentie (dag 30)
    1. Oogst organoïden (stap 2.4.3) in microbuisjes.
    2. Verwijder het medium voorzichtig om de organoïden niet aan te zuigen en voeg 1 ml PBS toe om de organoïden te spoelen.
    3. Verwijder PBS voorzichtig om geen organoïden aan te zuigen en voeg 4% paraformaldehyde (PFA) toe om 30 minuten bij kamertemperatuur te fixeren.
    4. 3x wassen met PBS.
    5. Bewaren bij 4 °C tot gebruik.
  2. Organoïde collectie voor RT-qPCR (dag 30)
    1. Breng organoïden (stap 2.4.3) over in microbuisjes. Wassen met PBS zoals beschreven in stap 4.1.2.
    2. Voeg lysisbuffer toe en vries in vloeibare stikstof (LqN2). Bewaren bij -80 °C tot gebruik.
  3. Celfixatie voor immunofluorescentie (dag 60)
    1. Verwijder het kweekmedium en voeg PBS toe aan de wascellen.
    2. Fixeer in 4% PFA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Verwijder PFA en voeg PBS toe aan wascellen. Herhaal deze stap 3x.
    4. Bewaren bij 4 °C tot gebruik.

5. RT-qPCR

  1. Extraheer het totale RNA uit organoïden volgens de instructies van de fabrikant van de kit.
  2. Synthetiseer cDNA uit 1 μg totaal RNA bereid in stap 5.1 volgens de instructies van de fabrikant van de kit in een totaal reactievolume van 20 μL.
  3. Voer kwantitatieve PCR uit met behulp van de volgende primers: FOXG1_forward: CGCCAGATTTCCATGTGTGC; FOXG1_reverse: GTTCTCAAGGTCTGCGTCCA; ACTB_forward: TGAAGTGTGACGTGGACATC; ACTB_reverse: GGAGGAGCAATGATCTTGAT. Stel de eindconcentratie voor elke reactie als volgt in: 1x fluorescerende mastermix, 0,25 μM voorwaartse primer, 0,25 μM omgekeerde primer. Het totale reactievolume is 15 μl, inclusief 0,2 μl cDNA uit stap 5.2. Gebruik de volgende PCR-omstandigheden: eerste denaturatie bij 95 °C gedurende 1 minuut; 40 cycli van 95 °C gedurende 15 s en 60 °C gedurende 30 s.
  4. Normaliseer FOXG1-expressie naar ACTB als de interne controle.

6. Immunofluorescentie kleuring

  1. Incubeer de organoïden (dag 30) in 10% sacharose gedurende 1 uur bij 4 °C en vervolgens 30% sacharose gedurende ≥3 uur bij 4 °C.
  2. Monteer organoïden in inbeddingsmedium en bereid cryosectie (10 μm) voor met behulp van cryostaat. Bewaar secties op glaasjes bij -20 °C tot gebruik.
  3. Verwijder het inbeddingsmedium door PBS-wash (2 x 5 min).
  4. Permeabiliseren in 0,3% PBST gedurende 10 minuten. Wassen met PBS.
  5. Blokkeer in 10% normaal geitenserum in 0,1% PBST gedurende 1 uur. Incubeer een nacht bij 4 °C met primaire antilichamen: anti-FOXG1 (1:200), anti-TUBB3 (1:500-1:1.000). 3x wassen met PBS.
  6. Incubeer met secundair antilichaam (1:500) + Hoechst 33258 (1:500) gedurende 1 uur. 3x wassen met PBS.
  7. Monteer en observeer onder een confocale microscoop.

7. Heteroplasmie-analyse

  1. Oogst iPSC's met behulp van celschrapers en breng ze over naar microbuisjes. Voeg 0,5 ml PBS toe en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 100 × g . Verwijder het bovenstaande en ga verder met stap 7.2.
  2. Extraheer het totale DNA volgens de instructies van de fabrikant van de kit.
  3. Stel de eindconcentratie voor elke PCR-reactie in: 1x fluorescerend mastermengsel, 0,25 μM voorwaartse primer, 0,25 μM omgekeerde primer. Het totale reactievolume is 15 μl, inclusief 50 ng totaal DNA uit stap 7.2. Gebruik de volgende PCR-omstandigheden: eerste denaturatie bij 95 °C gedurende 1 minuut; 40 cycli van 95 °C gedurende 15 s en 60 °C gedurende 30 s. De inleidingssequenties zijn als volgt: MELASwt_foward: gtttgttaagatggcagagc; MELASwt_reverse: ggaattgaacctctgactgtaaagttt; MELASmut_foward: gtttgttaagatggcagg; MELASmut_reverse: ggaattgaacctctgactgtaaagttt; FBXO15_ vooruit: gccaggaggtcttcgctgta; FBXO15_ keerzijde: aatgcacggctagggtcaaa.
  4. Gebruik drempelcycluswaarden om het aantal mitochondriale DNA-kopieën te berekenen (mutant versus wildtype).
  5. Normaliseren naar FBXO15 nucleair genkopienummer.

8. Evaluatie van de grootte en vorm van organoïden

  1. Maak afbeeldingen van organoïden met behulp van een microscoop met TIFF-formaat.
  2. Meet grootte en circulariteit met behulp van open-source beeldanalysesoftware. Open de TIFF-bestanden die in stap 8.1 zijn opgeslagen door te klikken op Bestand | Open en selecteer het bestand. Kies Selecties uit de vrije hand en trek de organoïde over. Klik vervolgens op Analyseren | Meten. De waarden voor Oppervlakte en Circulariteit in de resultaten zijn gebruikt voor de analyse in stap 8.3.
  3. Analyseer de gegevens door een t-test uit te voeren om te evalueren of er significante verschillen zijn in vergelijking met de controlelijnen met behulp van statistische software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We genereerden hersenorganoïden en voerden 2D-neuronale culturen uit met behulp van een relatief eenvoudig protocol met kleine aanpassingen op basis van Nakamura et al.9 (Figuur 1). In het vorige protocol werden V-vormige platen met 96 putjes gebruikt, terwijl we in deze studie U-vormige platen met 96 putjes met lage hechting gebruikten om de cellen op natuurlijke wijze in het midden van elke put te laten aggregeren. Met behulp van de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoïden geïnduceerd uit menselijke embryonale stamcellen (ESC's)/iPSC's vertegenwoordigen veelbelovende ziektemodellen voor zeldzame hardnekkige ziekten, terwijl het genereren van hersenorganoïden doorgaans langere kweekperioden van enkele maanden vereist10 en het gebruik van dure apparatuur, zoals een gemanipuleerde container die het kweekmedium continu roert en stabiele omstandigheden handhaaft voor langdurige 3D-celcultuur. In deze studie hebben we in korte ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De 414C2 iPSC's zijn verkregen van RIKEN BRC. Financieringsondersteuning werd verleend door JSPS KAKENHI (24H00648 tot M.F., 23K08971 tot C.S.) en AMED Translational Research Network Program (25yf0126001j002 tot M.F.). Dit werk werd ondersteund door een fellowship van de Duitse Academische Uitwisselingsdienst (DAAD) aan F.B.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 cm celkweekschaaltjecorning353003
6 wel plaatje ultra lage hechtingsoppervlakcorning3471
70 μm cel zeefcorning352350
Accutasenacalai tesque12679-54enzymen gebruikt om iPSC's te dissociëren
B27 supplementThermofischer scientific17504001
B27 supplement minus vitamine AThermofischer scientific12587010
β-mercaptoethanol (2-ME)sigmaM3148Weggooien volgens de regels van de instelling.
Cell Culture 6 wel multi plaatcorning353046
cel saver tipBMBio ECOBMT-200Wbreedbuikige pipettenpunt
cel schrapersSUMITOMO BAKELITECO., LTD.MS-93100
Confocal microscoopZeissLSM710
CryostatLeicaCM3050
Culture Mouse Laminin 1R&D3400-010-02gebruikt voor het coaten van platen voor 2D-culturen van gedissocieerde neuronen
DMEM/F12FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.042-30795
Fluorescentie Montage MediumDAKOS302380-2montage medium
FOXG1 antilichaamabcamab196868
GlutamaxThermofischer scientific35050061
Geit anti-Muis IgG (H+L) Hoogwaardig Geadsorbeerd Secundair Antilichaam, Alexa Fluor Plus 488Thermofischer scientificA32723
Geit anti-Konijn IgG (H+L) Hoogwaardig Geadsorbeerd Secundair Antilichaam, Alexa Fluor Plus 555Thermofischer scientificA32732
Heparan Sulfaat (HS)sigmaH7640
High Capacity RNA-to-cDNA KitThermofischer scientific4387406gebruikt om cDNA uit RNA te synthetiseren
Hoechst 33258Thermofischer scientificH3569
ImageJversie 1.52agebruikt om de grootte en circulariteit van organoïdes te meten
iMatrix-511 zijdeTakara Bio Inc.892021coating voor platen voor iPSC-kweek
insulineFUJIFILM Wako Pure Chermical Co. 090-06481
IWP2Tocris Bioscience3533
Keyence BZ-X810KeyenceBZ-X810gebruikt om afbeeldingen voor figuur 3A vast te leggen
LSM710Carl Zeiss AGconfocale microscoop
LSM980Carl Zeiss AGconfocale microscoop
LUNA Universal qPCR Master MixNew England BiolabsM3003
MatrigelCorning354277
N2 supplementThermofischer scientific17502001
Neurobasal mediumThermofischer scientific21103049
Neuron Dissociatie Oplossing FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.291-78001
niet-essentiële aminozuren (NEAA)nacalai tesque06344-56
Normaal GeitenserumJackson ImmunoResearch Inc. 005000121
Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Behandeld, U-Gevormde Bodem MicroplateThermofischer scientific174929
paraformaldehyde (PFA)nacalai tesque09154-85Weggooien volgens de regels van de instelling.
PBSnacalai tesque14249-24
PBSnacalai tesque27575-31
penicilline/streptomycine (PS)nacalai tesque26253-84
Poly-L-ornithine (PO)sigmaP3655
Polyoxyethyleen(10) Octylfenyl Ether (Triton)FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.168-11805
PRISM GraphPadversie 9.5.0
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN51304gebruikt om totaal DNA te extraheren
RNeasy Mini KitQIAGEN74104gebruikt om totaal RNA te extraheren
SB-431542Cayman Chemical13031
glazen schuifjesMATSUNAMICRE-05
StemFit AK02NTakara Bio Inc.AK02Nmedium gebruikt voor de kweek van ongedifferentieerde iPSC's en van differentiatiedag 0 tot dag 6
SucroseFUJIFILM Wako Pure Chermical Co.196-00015
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek Japan Co.,Ltd.4583Cryopreserveringsmedium
TUBB3 antilichaamPromegaG712A
Y27632FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.030-24021ROCK remmer
ZENCarl Zeiss AG2.3SP1(zwarte editie)software om de genomen afbeeldingen te analyseren  met confocale microscoop (LSM710)
ZENCarl Zeiss AG2.6 (blauwe editie)software om de genomen afbeeldingen te analyseren  met confocale microscoop (LSM980)

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sproule, D. M., Kaufmann, P. Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes: basic concepts, clinical phenotype, and therapeutic management of MELAS syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1142, 133-158 (2008).
  2. Kirino, Y., Suzuki, T. Human mitochondrial diseases associated with tRNA wobble modification deficiency. RNA Biol. 2 (2), 41-44 (2005).
  3. Shaffer, S. W., et al. Role of taurine in the pathologies of MELAS and MERRF. Amino Acids. 46, 47-56 (2014).
  4. Shaffer, S. W., Kim, H. W. Effects and mechanisms of taurine as a therapeutic agent. Biomol Ther. 26, 225-241 (2018).
  5. Rikimaru, M., et al. Taurine ameliorates impaired mitochondrial function and prevents stroke-like episodes in patients with MELAS. Intern Med. 51 (24), 3351-3357 (2012).
  6. Ohsawa, Y., et al. Taurine supplementation for prevention of stroke-like episodes in MELAS: a multicentre, open-label, 52-week phase III trial. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 90 (5), 529-536 (2019).
  7. Tolle, I., Tiranti, V., Prigione, A. Modeling mitochondrial DNA diseases: from base editing to pluripotent stem-cell-derived organoids. EMBO Rep. 24 (4), e55678(2023).
  8. Fujikura, J., et al. Induced pluripotent stem cells generated from diabetic patients with mitochondrial DNA A3243G mutation. Diabetologia. 55 (6), 1689-1698 (2012).
  9. Nakamura, M., et al. Pathological progression induced by the frontotemporal dementia-associated R406W tau mutation in patient-derived iPSCs. Stem Cell Rep. 13 (4), 684-699 (2019).
  10. Pagliaro, A., Artegiani, B., Hendriks, D. Emerging approaches to enhance human brain organoid physiology. Trends Cell Biol. 35 (6), 483-499 (2025).
  11. Kodaira, M., et al. Impaired respiratory function in MELAS-induced pluripotent stem cells with high heteroplasmy levels. FEBS Open Bio. 5, 219-225 (2015).
  12. Homma, K., et al. Taurine rescues mitochondria-related metabolic impairments in the patient-derived induced pluripotent stem cells and epithelial-mesenchymal transition in the retinal pigment epithelium. Redox Biol. 41, 101921(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

MELAS syndroomge nduceerde pluripotente stamcellengeneratie van organo denvorming van neurale netwerkenheteroplasmy niveaushigh throughput screeningimmunofluorescentiekleuringRT qPCR analyse

Gerelateerde artikelen