Methodenartikel

Bereiding van economische en universele compensatiekralen compatibel met multi-species antilichamen

118 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70114

⸱

17 april 2026

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, The Second Hospital of Tianjin Medical University, 2Center for gene and immunotherapy, The Second Qilu Hospital of Shandong University, 3Department of Radiology, The First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University & Shandong Provincial Qianfoshan Hospital, 4Department of Urology, The second hospital of Tianjin Medical University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een kosteneffectieve methode voor het bereiden van multispecies-compatibele compensatiekralen voor fluorescentiecompensatie in flowcytometrie met behulp van recombinante eiwit A/G/L-GEKOPPELDE POLYSTYREENMICROSFEREN.

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een kosteneffectieve en reproduceerbare methode voor het bereiden van compensatiekralen met meerdere soorten, voor fluorescentiecompensatie in meerkleurige flowcytometrie. Hier werd het immunoglobulinebindende eiwit A/G/L (Eiwit A/G/L) met meerdere immunoglobulinebindende domeinen recombinant tot expressie gebracht in Escherichia coli (E. coli), gezuiverd met nikkelaffiniteitschromatografie, en covalent gekoppeld aan gecarboxyleerde polystyreenmicrosferen via EDC/NHS-chemie. De resulterende kralen binden antilichamen van diverse soorten en subklassen, waardoor sterke en onderscheidende fluorescentiesignalen worden gegenereerd die geschikt zijn voor compensatie. Deze resultaten bieden praktische richtlijnen voor het kiezen van de korreldiameter en eiwitbelasting om fluorescentieintensiteiten te bereiken die geschikt zijn voor verschillende compensatievereisten. Succesvolle uitvoering van het protocol wordt aangetoond door efficiënte eiwitzuivering en een duidelijke, hoogintensieve fluorescentiepiek van geconjugeerde korrels vergeleken met controlekralen tijdens flowcytometrieanalyse. Deze eenvoudige en schaalbare aanpak maakt routinematige voorbereiding van stabiele, veelzijdige compensatiekralen mogelijk in standaardlaboratoria, wat kosten verlaagt en de flexibiliteit voor flowcytometrietoepassingen verbetert.

Inleiding

Flowcytometrie is een onmisbaar hulpmiddel geworden in de immunologie, celbiologie en klinisch onderzoek voor multiparametrische analyse van celpopulaties 1,2,3. Een cruciale uitdaging in traditionele meerkleurige flowcytometrie is fluorescentie-overloop, waarbij het emissiespectrum van een fluorochroom overlapt in meerdere detectorkanalen, wat leidt tot signaalcontaminatie en foutieve interpretatie 4,5. Daarom is een juiste vergoeding essentieel voor een nauwkeurige data-interpretatie.

Traditioneel worden compensatiecontroles voorbereid met eenkleurige gekleurde cellen. Echter, beperkte celaantallen, variabele antigeenexpressie en differentiële binding van antilichamen aan cellen vormen uitdagingen6. Als gevolg hiervan zijn synthetische kralen aangepast om fluorochroom-geconjugeerde antilichamen te binden als een praktisch alternatief opgedoken. Kralen bieden de voordelen van een consistente bindingscapaciteit, hoge fluorescentieintensiteit en onafhankelijkheid van cellulaire antigeenexpressieniveaus9. In vergelijking met single-species of Fc-restricted capture reagentia, vergroot de opname van meerdere immunoglobulinebindende domeinen (Eiwit A, G en L) de bedekking van de soorten en de compatibiliteit van antilichaamformaat, waardoor een enkele kraalpreparaat diverse fluorchroom-geconjugeerde antilichamen kan accommoderen.

Onder de kralen die voor compensatie worden gebruikt, biedt koppeling van immunoglobulinebindende eiwitten zoals Eiwit A, Proteïne G en Eiwit L brede compatibiliteit met antilichaamisotypen van verschillende soorten. Eiwit A en G binden aan de Fc-regio van veel IgG-subklassen, terwijl eiwit L bindt aan κ-lichte ketens van immunoglobulines en zo de bindingscapaciteit aan Fab-fragmenten en enkelketen-antilichamenuitbreidt 10,11.

Hoewel commerciële compensatiekralen beschikbaar zijn, kunnen hun relatief hoge kosten te hoog zijn voor laboratoria met beperkte budgetten, waardoor hun brede toepassing beperktwordt 3. Gezien deze uitdagingen is er behoefte aan flexibele, aanpasbare kraalplatforms waarmee onderzoekers de kraalgrootte, het antistofbindingsdomein en de antistoftypen die voor compensatiecontroles worden gebruikt, kunnen definiëren. Het doel van dit protocol is het bieden van een eenvoudige, economische en reproduceerbare methode voor het voorbereiden van compensatiekralen met meerdere soorten, geschikt voor meerkleurige flowcytometrie. Dit protocol beschrijft het ontwerp, de expressie en zuivering van een recombinant fusie-eiwit dat meerdere immunoglobulinebindende domeinen bevat uit de eiwitten A, G en L, gevolgd door de covalente conjugatie naar carboxylgemodificeerde polystyreenkorrels met gedefinieerde diameters.

Het protocol beschrijft het moleculaire ontwerp van het fusie-eiwit, de expressie en zuivering ervan in E. coli, en de bereiding van parel-gebaseerde compensatiereagentia die compatibel zijn met meerdere fluorochroom-geconjugeerde antilichamen. Dit protocol is bedoeld voor laboratoria die multicolor flowcytometrie uitvoeren in diverse onderzoeksomgevingen, waaronder immunologie, oncologie en translationele studies, vooral waar kostenbesparing, cross-species compatibiliteit en flexibele compensatiecontroles vereist zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Bereid alle buffers en reagentia vers voor zoals vermeld in Tabel 1. Bereid EDC- en NHS-oplossingen direct voor gebruik voor; Bewaar ze niet. Voor alle andere buffers (Lysis, Binding, Washing, Elution, MES, PBS, Tris) bereid je voorraadoplossingen vooraf voor en bewaar deze bij 4 °C. Evenwichtig zijn opgeslagen buffers tot de juiste reactietemperatuur (kamertemperatuur of 4 °C) vóór gebruik. Zorg ervoor dat FACS-buffer en opslagbuffer vers worden voorbereid of opgeslagen bij 4 °C.

1. Expressie en zuivering van recombinant eiwit A/G/L

  1. Expressie van recombinant eiwit A/G/L
    1. Transformeer het pET28-eiwit A/G/L-PLASMIDE in E. coli BL21(DE3)-competente cellen met behulp van een standaard hitteschokprotocol.
    2. Plat de getransformeerde cellen op LB-agar met 50 μg·mL-1 kanamycine en incubeer ze een nacht bij 37 °C.
    3. Inoculeer een enkele kolonie in 5–10 mL LB-bouillon met kanamycine (50 μg·mL-1) en kweek een nacht bij 37 °C met schudden bij 200 × g.
    4. Breng de nachtkweek over in 200 mL LB met kanamycine (eindconcentratie 50 μg·mL-1) bij een verdunning van 1:100.
    5. Laat de cultuur groeien bij 37 °C totdat de optische dichtheid bij 600 nM (OD600) 0,6–0,8 bereikt.
    6. Induceer eiwitexpressie door isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toe te voegen aan een eindconcentratie van 0,5 mM en incubeer bij 28 °C gedurende 12–16 uur.
    7. Oogst de cellen door centrifugatie bij 4 °C, 4000 × g gedurende 10 minuten.
    8. Gooi het supernatant weg en suspendeer de celpellet opnieuw in de lysisbuffer. Ga direct verder of bewaar de pellets bij -80 °C.
      Pauzepunt: Celpellets kunnen enkele weken worden opgeslagen bij -80 °C vóór de lysise.
  2. Cellysis
    1. Sussief de bacteriële pellet opnieuw in 10 mL lysisbuffer per gram natte celmassa.
    2. Lys de cellen met een hogedrukhomogenisator ingesteld op 1000 bar, waarbij de suspensie 2–3 cycli doorloopt totdat de oplossing minder viskeus en doorschijnend wordt.
      Opmerking: Alternatief kan celverstoring worden uitgevoerd door sonicatie op ijs met pulsmodus (5 s AAN / 10 s UIT) gedurende 8–12 cycli, waardoor oververhitting wordt voorkomen. Zorg voor volledige lysis door een kleine aliquot onder een microscoop te onderzoeken.
    3. Centrifugeer het lysaat op 12.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
    4. Verzamel het supernatant als oplosbare eiwitfractie voor zuivering.
  3. Ni-NTA affiniteitszuivering
    1. Kolomevenwicht en monsterbelasting
      1. Equilibreer de Ni-NTA-kolom met 10 kolomvolumes (CV) bindingsbuffer die 10 mM imidazol bevatten.
      2. Filter het geklarde lysaat door een 0,45 μM-filter, voeg imidazol toe aan een eindconcentratie van 10 mM en laad het op de kolom bij 0,5 CV·min-1.
      3. Verzamel de doorstroomfractie om de bindingsefficiëntie te monitoren.
    2. Wassen
      1. Was de kolom met 10 CV bindingsbuffer en wasbuffer met 20 mM imidazol bij een debiet van 1 CV·min-1.
    3. Elutie
      1. Eluteer het doeleiwit met eluatiebuffer bij een debiet van 1 CV·min-1.
      2. Verzamel fracties en monitor A280 om eiwithoudende fracties te identificeren.
    4. Bufferuitwisseling en eiwitopslag
      1. Breng de gezuiverde eiwitoplossing over naar een 50 kDa moleculaire gewichtsafsnijder (MWCO) centrifugale ultrafiltratiebuis.
      2. Centrifugeer op 3.500 × g gedurende 15–20 minuten bij 4 °C totdat de gewenste concentratie is bereikt.
      3. Verwijder de doorstroom-ingang en voeg een gelijk volume PBS-buffer (pH 7,4) toe aan de retentaat voor bufferuitwisseling.
      4. Herhaal de centrifugatie en PBS-vervanging 2–3 keer om de oorspronkelijke buffer volledig te vervangen door PBS.
      5. Na de laatste concentratiestap verzamel je het retentaat en meet je de eiwitconcentratie.
      6. Controleer de geëlueerde fracties met SDS-PAGE; het verwachte molecuulgewicht van eiwit A/G/L is ongeveer 90 kDa.
      7. Aliquot het gezuiverde eiwit en bewaar bij -80 °C tot verder gebruik.
        OPMERKING: Het protocol kan bij deze stap worden gepauzeerd. Gezuiverd eiwit A/G/L kan worden opgeslagen bij -80 °C voor latere parelconjugatie. Na concentratie werd ongeveer 10 mg gezuiverd eiwit A/G/L verkregen uit 200 mL bacteriële kweek, met een uiteindelijke concentratie van 2–5 mg·mL⁻1.

2. Conjugateer de kralen tot eiwit A/G/L

  1. Voorwassen van de kraal
    1. Vortexkralen op maximale snelheid gedurende 20–30 seconden bij kamertemperatuur (20–25 °C) om gelijkmatig te hersuspenderen. Breng 0,2 mL 8 μM kraal (5 mg) over in een 1,5 mL microcentrifugebuis.
    2. Pelletkralen door centrifugatie, 5000 × g gedurende 3 minuten op kamertemperatuur.
    3. Aspireer en gooi het supernatant voorzichtig af zonder het pelletje te verstoren.
    4. Voeg 1 mL 0,1 M MES-buffer toe, hersuspendeer voorzichtig door pipetten of zachte vortex, centrifugeer opnieuw 5000 × g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur, en verwijder supernatant. Herhaal deze wash één keer (in totaal twee MES-wasbeurten).
  2. Activatie bij EDC/NHS
    VOORZICHTIG: EDC en NHS zijn irriterende stoffen en moeten worden behandeld met passende persoonlijke beschermingsmiddelen in een dampkap.
    1. Rep de kralen opnieuw in een 0,5 mL MES-buffer, voeg vervolgens achtereenvolgens 50 μL 50 mg·mL-1 NHS en 100 μL 50 mg·mL-1 EDC toe.
      Opmerking: EDC- en NHS-oplossingen moeten direct voor gebruik vers worden bereid.
    2. Vortex parelt en broedet 30 minuten op een roterende shaker bij kamertemperatuur om te activeren.
  3. Verwijder activeringsreagentia en was
    1. Pelletkralen: 5000 × g, 3 min, op kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig het supernatant.
    2. Voeg 1 mL PBS-buffer toe, herdoe voorzichtig een sussie, centrifugeer (5000 × g, 3 min, op kamertemperatuur) en verwijder supernatant. Voer één PBS-wash uit om activeringsreagentia te verwijderen.
  4. Eiwitkoppeling
    1. Susselt de geactiveerde kraalpellet opnieuw in 0,4–0,5 mL PBS (eindreactievolume doel 0,5–0,6 mL). Houd het volume laag om de effectieve eiwitconcentratie te verhogen.
    2. Voeg 100 μg Eiwit A/G/L toe. Meng voorzichtig.
    3. Incubeer de reactie op een rollende shaker bij kamertemperatuur gedurende 2 uur voor snelle koppeling, of 4 °C 's nachts. Houd het rollen zacht aan om te voorkomen dat de kralen blijven zakken.
  5. Afkoel/beëindigingsreactie
    1. Pelletkralen (5000 × g, 3 min) en verwijder supernatantant.
    2. Voeg 1 mL 0,1 M Tris toe (pH = 7,4) om de resterende NHS-esters te dempen. Opnieuw ophangen en incuberen op een rollende shaker 30 minuten op kamertemperatuur.
    3. Pelletkralen en was met 1 mL PBS in dezelfde 1,5 mL microcentrifugebuis. Centrifugeer opnieuw (5000 × g, 3 min) en gooi het supernatant weg. Daarna de kralen opnieuw ophangen met een opslagbuffer van 0,5 mL.
      Pauzepunt: Het protocol kan bij deze stap worden gepauzeerd. Resuspenderende kralen kunnen worden bewaard bij 4 °C.
  6. Mengen en opslaan
    1. Geteld met geconjugeerde en niet-geconjugeerde kralen. Meng de geconjugeerde en niet-geconjugeerde kralen in een verhouding van 25%–75% in de nieuwe 1,5 mL microcentrifugebuis.
    2. Suspendeer het kralenmengsel in 1 mL opslagbuffer (PBS bevat 1% BSA en 0,05% antimicrobiële conserveermiddel).
    3. Breng de suspensie over in een gelabelde buis en bewaar bij 4 °C. Lichtbescherming is niet vereist. Sussie voorzichtig opnieuw voor gebruik om een gelijkmatige verdeling van de kralen te garanderen. Onder deze omstandigheden blijven de kralen minstens 6 maanden stabiel.

3. Vertegenwoordiger QC

  1. Incubeer 10 μL geconjugeerde kralen met 1 μL fluorescerende antilichaam in een 100 μL FACS-buffer gedurende 15–30 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Elke buis mag slechts één fluorescerende antistof bevatten.
  2. Was de kralen met 1 mL PBS, sussen opnieuw in 300–500 μL PBS en gebruik het op de flowcytometer.
  3. Stel het detectiekanaal in volgens de fluorofoor die aan het antilichaam is geconjugeerd (bijvoorbeeld 488 nM-laser met FITC-detector voor FITC-geconjugeerde antilichamen). Een representatief fotomultiplier buis (PMT) spanningsbereik van 0–200 V kan als uitgangspunt worden gebruikt en aangepast op basis van de prestaties van het instrument. Verzamel minstens 10.000 gebeurtenissen per monster.
  4. Gate op kralen door FSC/SSC. Positieve kralen zouden een duidelijke enkele piek moeten laten zien met een hoge MFI in het kanaal van de fluorofoor; Negatieve controle zou alleen achtergrond moeten tonen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het recombinante fusie-eiwit A/G/L bestaat uit 816 aminozuren met een berekend molecuulgewicht van 90,5 kDa (Aanvullend Dossier 1). Dit fusie-eiwit behoudt vijf IgG-bindende B-domeinen van Eiwit A, twee IgG-bindende domeinen van Eiwit G, en vijf κ lichteketen-bindende B-domeinen van Eiwit L, terwijl het albuminebindende domein werd verwijderd (Figuur 1A, Supplementtabel 1). Een cysteïneresidu werd toegevoegd aan het C-termin...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft een praktische en efficiënte workflow voor de bereiding van fluorescerende compensatiekralen gebaseerd op recombinante eiwit A/G/L. De procedure omvat bacteriële expressie, Ni-NTA-affiniteitszuivering en covalente koppeling van het gezuiverde eiwit aan carboxylgemodificeerde polystyreenmicrosferen met behulp van EDC/NHS-chemie. De resulterende kralen kunnen antilichamen binden van meerdere soorten en subklassen, wat een veelzijdig en kosteneffectief hulpmiddel bie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs geven aan dat ze geen belangenconflicten hebben en dat ze niets te melden hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Wetenschappelijk Onderzoeksprogramma van de Tianjin Education Commission (2021KJ224).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AF647 Rat Ig2aBioLegend141711
APC Mouse IgG1BioLegend353311
BL21(DE3) Competent CellsSangonB528414
BSASolarbioA8010
EDCThermo Fisher22980CAS: 1892-57-5
FITC Armenian Hamster IgGBioLegend400905
ImidazoleSigma-AldrichI202CAS: 288-32-4
IPTGGoldBioI2481CCAS: 367-93-1
Kanamycin SangonA600286CAS: 8063-07-8
KClAladdinP112134CAS: 7447-40-7
KH2PO4AladdinP434010CAS: 7778-77-0
MESSigma-AldrichM3671CAS: 145224-94-8
Na2HPO4AladdinS274390CAS: 7558-79-4 
NaClAladdinC111549CAS: 7647-14-5
NHSThermo Fisher24500CAS: 6066-82-6
Ni NTA Beads 6FFSmart-LifesciencesSA005005
PE mouse IgG2aBioLegend362603
ProClean 300BeyotimeST853
Tris Sigma-Aldrich252859CAS: 77-86-1 
TryptoneOxoidLP0042
Ultra Centrifugal Filter, 50 kDa MWCOMilliporeUFC9050
Uniform Carboxyl Polystyrene MicrospheresTomicro Biotech10ml, 25mg/mlShanghai, China
Yeast ExtractOxoidLP0021

Referenties

  1. Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2005).
  2. Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat Protoc. 1 (3), 1522-1530 (2006).
  3. Bhowmick, D., Lowe, S. K., Ratliff, M. L. Side-by-side comparison of compensation beads used in polychromatic flow cytometry. Immunohorizons. 7 (12), 819-833 (2023).
  4. Szaloki, G., Goda, K. Compensation in multicolor flow cytometry. Cytometry A. 87 (11), 982-985 (2015).
  5. Tang, H., et al. Economical and efficient protocol for isolating and culturing bone marrow-derived dendritic cells from mice. J Vis Exp. (185), e63125(2022).
  6. Sun, J., Kroeger, J. L., Markowitz, J. Introduction to multiparametric flow cytometry and analysis of high-dimensional data. Methods Mol Biol. 2194, 239-253 (2021).
  7. Blazer, L. L., Roman, D. L., Muxlow, M. R., Neubig, R. R. Use of flow cytometric methods to quantify protein-protein interactions. Curr Protoc Cytom. 53, 13.11-13.15 (2010).
  8. Zheng, Z., Chinnasamy, N., Morgan, R. A. Protein l: A novel reagent for the detection of chimeric antigen receptor (car) expression by flow cytometry. J Transl Med. 10, 29(2012).
  9. Chevrier, S., et al. Compensation of signal spillover in suspension and imaging mass cytometry. Cell Syst. 6 (5), 612-620.e5 (2018).
  10. Patella, V., Casolaro, V., Bjorck, L., Marone, G. Protein l. A bacterial ig-binding protein that activates human basophils and mast cells. J Immunol. 145 (9), 3054-3061 (1990).
  11. Eliasson, M., et al. Chimeric igg-binding receptors engineered from staphylococcal protein a and streptococcal protein g. J Biol Chem. 263 (9), 4323-4327 (1988).
  12. Hattori, T., et al. Multiplex bead binding assays using off-the-shelf components and common flow cytometers. J Immunol Methods. 490, 112952(2021).
  13. Hermanson, G. T. Bioconjugate techniques. , Academic press. (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

FlowcytometrieProte ne A G LAntilichaambindingFluorescentiecompensatieNikkelaffiniteitschromatografieEDC NHS chemiePolystyreenmicrosferenProte nezuivering

Gerelateerde artikelen