Methodenartikel

Een Chromatine Assay voor menselijk hersenweefsel

DOI:

10.3791/717

⸱

21 maart 2008

 , 
1Psychiatry, Brudnick Neuropsychiatric Research Institute, University of Massachusetts Medical School

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tot voor kort werden expressie studies over menselijke hersenen beperkt tot de kwantificering van RNA of eiwit. Met de chromatine immunoprecipitatie technieken beschreven in dit document, zal het mogelijk zijn om histon-methylatie en andere epigenetische regulatoren van genexpressie in postmortem hersenen kaart.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chronische neuropsychiatrische aandoeningen zoals schizofrenie, bipolaire aandoeningen en autisme men denkt dat het gevolg zijn van een combinatie van genetische en omgevingsfactoren die zouden kunnen resulteren in epigenetische veranderingen in genexpressie en andere moleculaire pathologie. Traditioneel waren echter expressie studies in postmortem hersenen beperkt tot de kwantificering van mRNA of eiwit. De beperkingen aangetroffen in postmortem hersenonderzoek zoals variabiliteit in de tijd autolyse en weefsel integriteiten zijn waarschijnlijk ook alle studies die van hogere orde chromatine structuren impact. Echter, de nucleosomale organisatie van genomisch DNA met inbegrip van DNA: kern histon-binding - lijkt grotendeels bewaard in representatieve monsters als bedoeld door verschillende hersenen banken. Daarom is het mogelijk de studie van de methylatie patroon en andere covalente modificaties van de kern histon-eiwitten op bepaalde genomische loci in postmortem hersenen. Hier presenteren we een vereenvoudigde inheemse chromatine immunoprecipitatie (NChIP) protocol voor bevroren (nooit-vast) menselijke hersenen exemplaren. Te beginnen met micrococcal nuclease vertering van hersenhomogenaten, NChIP gevolgd door qPCR kan worden afgerond binnen de drie dagen. De methodologie hier gepresenteerde moet nuttig zijn om epigenetische mechanismen van genexpressie te helderen in normale en zieke menselijke brein.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedure:

1 ste dag

1. Homogeniseren 50-500 mg van bevroren post-mortem grijze massa weefsel met Douncing Buffer.

! LET OP - Human weefsel moet met zorg worden behandeld onder strikte veiligheidsvoorwaarden. Het moet mogelijk worden behandeld BSL-2 of hoger veiligheidsnormen.

  1. Neem eerder ontleed, post-mortem brain van -80 ° C, ze dounce in 5X hersenvolume van Douncing Buffer, en plaats in 2,0 mL microcentrifugebuis. Matched monster en controle paren zijn gelijktijdig verwerkt.

2. Micrococcal Nuclease (MN) Spijsverte....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol hier beschreven is vooral handig voor onderzoekers geïnteresseerd zijn in histon-en / of DNA-methylatie handtekeningen van menselijke hersenen, omdat deze chromatine markeringen mogen, indien minder gevoelig is voor postmortale artefacten in vergelijking met andere types van wijzigingen, inclusief (histonen) acetylering en fosforylatie 1, 2. Het postmortem hersenen vatbaar is voor de studie van de mono-nucleosomale preparaten; het DNA blijft grotendeels aan de kern van histonen, althans in exemplaren met een represen.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van het National Institute of Mental Health (5R01MH071476).

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Oplossingen:

  • nChIP Douncing Buffer: 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl 2 de pH instellen op 7,5
  • 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl pH instellen op 7,5
  • Lage zout wasbuffer: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
  • Hoog zoutgehalte wassen Buffer: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 500 mM NaCl
  • Lithiumchloride Buffer: 1% Igepal-CA 630, 1% deoxycholinezuur, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0,25 M LiCl
  • TE-buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
  • Elutiebuffer: 0,1 M NaHCO 3, 1% SDS
  • Proteinase K digestie buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl breng de pH op 8,0
  • 3 M natriumacetaat: 24,61 g watervrij natriumacetaat (MW = 82,03) in 100 ml gedestilleerd water geautoclaveerd. Breng de pH op 5,2 met behulp van geconcentreerd azijnzuur.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain. J Neurosci Methods. 156, 284-292 Forthcoming.
  2. Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. Prefrontal dysfunction in sc....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Chromatine immunoprecipitatiemicrococcaal nuclease digestienat ChIP protocolhistonmethyleringsanalysepostmortaal hersenonderzoekepigenetische mechanismenproteinase K digestiefenol chloroformextractieqPCR analyse

Gerelateerde artikelen