Deze video toont het protocol voor gemethyleerd DNA immunoprecipitatie (MeDIP). MeDIP is een twee dagen procedure die selectief gemethyleerd DNA-fragmenten extracten van een genomische DNA-monster met behulp van antilichamen met specificiteit voor 5-methylcytosine (anti-5 mC).
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gemethyleerd DNA Immunoprecipitatie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De identificatie van DNA-methylatie patronen is een gemeenschappelijke procedure in de studie van de epigenetica, zoals methylatie is bekend dat significante effecten op de genexpressie hebben, en is betrokken bij een normale ontwikkeling en ziekte
Protocol
DNA-extractie en monstervoorbereiding
DNA uit een verscheidenheid van verschillende monsters (gekweekte cellen, vers ingevroren en in formaline gefixeerde paraffine ingebedde weefsels) kan worden gebruikt voor MeDIP. Het is belangrijk om in hoge mate gezuiverd DNA te gebruiken zonder bijbehorende eiwitten zoals histonen. Het is ook belangrijk om zo veel RNA te verwijderen als mogelijk uit de steekproef, als het kan interfereren met zowel DNA kwantificatie en antilichaam bindend. De hoeveelheid DNA gebruikt voor MeDIP kan variëren van 200 ng tot 1 ug, afhankelijk van de hoeveelheid DNA beschikbaar. Om aan te tonen dit protocol, zal 1 ug DNA ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er is een groeiend besef van de belangrijke rol van DNA-methylatie speelt bij de ziekte, zijn daarom de ontwikkeling van assays om deze wijziging te meten steeds belangrijker 3, 12, 13. De MeDIP techniek is een hulpmiddel vatbaar voor het screenen van zowel het hele genoom en locus-specifieke niveau 6, 7. Deze techniek zorgt voor een snelle weergave van DNA-methylatie niveaus met behulp van beperkte hoeveelheden van het starten van DNA en maakt een eenvoudige vergelijkingen tussen verschillende bro.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Wij willen de leden van de Brown en Lam laboratoria bedanken voor hun deelname aan bekritiseren deze video en artikel. Dit werk werd ondersteund met middelen uit het Canadese Institutes for Health Research en de Michael Smith Foundation for Health Research.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen | |
|---|---|---|---|---|
| Biorupter sonicator | Instrument | Diagenode | UCD-200 TM | |
| 1.7ml SafeSeal microcentrifugebuisjes | Overig | Sorenson BioScience | 11510 | |
| ND 3300 spectrophotometer | Instrument | NanoDrop | ||
| Primair antilichaam: Anti-5’-methylcytosine muis mAb | Reagens | Calbiochem | 162 33 D3 | |
| Secundair antilichaam: Dynabeads M-280 schaap anti-muis IgG | Reagens | Invitrogen | 112-01D | |
| Magnetisch buisjesrek | Instrument | Invitrogen | CS15000 | |
| Mini LabRoller | Instrument | Labnet International | H5500 | |
| IP-buffer | 10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Bewaard bij kamertemperatuur | |||
| Digestiebuffer | 10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl |
Referenties
- Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends Genet. 24, 231-237 (2008).
- Lu, Q., et al. Epigenetics, disease, and therapeutic interventions. Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).
- Zilbe....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
