Selectieve Etikettering van Cell-oppervlakte-eiwitten met behulp van CyDye DIGE Fluor Minimal Kleurstoffen

Summary

Een eenvoudige en specifieke methode werd aangetoond voor tl-etikettering en de verbeterde detectie van cel-oppervlakte-eiwitten zonder fractionering stap. Differentiële overvloed in cel oppervlakte-eiwitten werd geanalyseerd met behulp van twee-dimensionale (2-D) elektroforese en Ettan ™ DIGE technologie.

Abstract

Oppervlakte-eiwitten staan ​​centraal in het vermogen van de cel om te reageren op zijn omgeving en de interactie met naburige cellen. Ze staan ​​bekend als inductoren van bijna alle intracellulaire signalering. Bovendien spelen ze een belangrijke rol in het milieu aanpassing en behandeling met geneesmiddelen, en zijn vaak betrokken zijn bij de ziekte pathogenese en pathologie (1). Eiwit-eiwit interacties zijn intrinsiek aan signaalwegen, en om meer inzicht te krijgen in deze complexe biologische processen, zijn gevoelige en betrouwbare methoden nodig voor het bestuderen van cel-oppervlakte-eiwitten. Twee-dimensionale (2-D) electroforese wordt op grote schaal gebruikt voor de detectie van biomarkers en andere doelen in complexe eiwit monsters differentiële veranderingen te bestuderen. Cel oppervlakte-eiwitten, mede door hun lage abundantie (1 2% van cellulaire eiwitten), zijn moeilijk te detecteren in een 2-D gel zonder fractionering of een andere vorm van verrijking. Ze zijn ook vaak slecht vertegenwoordigd in 2-D gels vanwege hun hydrofobe karakter en een hoog moleculair gewicht (2). In deze studie presenteren we een nieuw protocol voor het intacte cellen met behulp van CyDye DIGE Fluor minimale kleurstoffen voor specifieke etikettering en de opsporing van deze belangrijke groep van eiwitten. De resultaten toonden aan specifieke etikettering van een groot aantal cel-oppervlakte-eiwitten met een minimale etikettering van intracellulaire eiwitten. Dit protocol is een snelle, eenvoudig te gebruiken, en alle drie CyDye DIGE Fluor minimale kleurstoffen (Cy 2, 3 en Cy Cy 5) kan worden gebruikt om cel-oppervlakte-eiwitten label. Deze functies zorgen voor multiplexing het gebruik van de 2-D fluorescentie Verschil gelelektroforese (2-D DIGE) met Ettan DIGE techniek en de analyse van eiwit-expressie veranderingen met behulp van DeCyder 2-D Differentiële analyse software. Het niveau van de cel-oppervlakte-eiwitten werd gevolgd tijdens het serum uithongering van de CHO-cellen voor verschillende lengtes van de tijd (zie tabel 1). Kleine veranderingen in overvloed werden gedetecteerd met hoge nauwkeurigheid, en de resultaten worden ondersteund door omschreven statistische methoden.

Protocol

Celcultuur

1. Groei Chinese hamster ovarium cellen (CHO-K1) met behulp van standaard celkweek procedures in F-12 Ham medium met Glutamax ik ​​dat 10% foetaal kalf serum, 50 U / ml penicilline, en 50 ug / ml streptomycine sulfaat (Invitrogen).
2. Exchange het kweekmedium aan serum-vrije media. Label de cel oppervlakte-eiwitten werden op verschillende tijdstippen met CyDye DIGE Fluor Cy3 of Cy5 minimale kleurstoffen (zie rubriek celoppervlak Labeling, hieronder).
3. Pool gelijke aantallen van cellen van elk tijdstip en label met CyDye DIGE Fluor Cy2. Gebruik deze als een interne standaard voor elke 2-D gel.
4. Het merendeel van de experimenten kan worden uitgevoerd met CHO-K1 cellen, maar de muis embryo fibroblasten (3T3 L1) en de muis ascites lymfoom lymfoblasten (EL4) kan ook gebruikt worden (gegevens niet getoond).
5. Groeien de twee laatste soorten cellen in DMEM medium met Glutamax II, maar gebruik anders identieke omstandigheden gebruikt worden voor de CHO-K1 cellen.

Celoppervlak etikettering

1. Haal voorzichtig hechtende cellen niet-enzymatisch, tellen en te delen in porties van 5-10 x106 cellen. Voor cellen in suspensie te groeien, laat het los stap.
2. Centrifugeer de celsuspensies op ongeveer 800 xg gedurende 5 minuten. Verwijder de supernatanten die het medium.
3. Was de pellets door resuspendion in Balanced Salt Solution 1 ml ijskoud Hank's (HBSS) pH 8,5. Gecentrifugeerd bij 800 xg bij 4 ° C gedurende 2 minuten.
4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 200 ui ijskoude etikettering buffer (HBSS pH 8,5, 1 M ureum).
5. Label de intacte cellen met 600 pmol CyDye DIGE kleurstoffen Fluor minimaal gedurende 20 minuten op ijs in het donker.
6. Quench de reactie door het toevoegen van 20 pi 10 mM lysine. Incubeer gedurende 10 minuten.
7. Was twee keer de oppervlakte-gemerkte cellen door resuspensie in 500 pi HBSS pH 7,4, gevolgd door centrifugatie bij 800 xg bij 4 ° C gedurende 2 minuten.

Cellysis en fractionering

1. Lyse de oppervlakte-gemerkte cellen in 150 ul koude lysis buffer (7 M ureum, 2 M thio, 4% CHAPS, 30 mM Tris, 5 mM magnesiumacetaat pH 8,5). Laat het ijs gedurende ten minste 1 uur met af en toe vortexen.
2. Centrifugeer de lysaten bij 10 000 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Breng het supernatans naar een nieuwe buis. Dit monster is de niet-gefractioneerde monster dat alle cellulaire eiwitten.
3. Parallel, wassen celpellets, zoals hierboven, dan fractioneren (met behulp van een membraan fractionering kit, Pierce) in membraan en de cytosolische fracties voorafgaand aan de 2-D gel elektroforese. Het membraan fractie bevat interne en celoppervlak membraaneiwitten.
4. Ter vergelijking, volg dan de standaard Ettan DIGE procedure ^3, en lyse, label, en, ten slotte, fractioneren van de cellen. Bepaal de proteïne concentratie in de monsters met behulp van de 2 - D Quant Kit (GE Healthcare).

2-D elektroforese

1. Hydrateren Immobiline DryStrip gels, pH 3-11NL (24 cm) met behulp van Immobiline DryStrip Reswelling tray, 24 cm in 450 ul DeStreak rehydration solution (0,5% IPG Buffer) 's nachts.
2. Breng de CyDye-gelabelde monsters (wat overeenkomt met 50 ug totaal eiwit) om DryStrip gels Immobiline door anodische cup laden in het spruitstuk en de iso-elektrische focussering (IEF) met behulp van Ettan IPGphor II IEF-systeem volgens de instructies uit te voeren.
3. Na het IEF, evenwicht van de strips in twee stappen en plaats op de top van grote (26 x 20 cm) 12,5% polyacrylamide gels (SDS-PAGE). Overlay met 0,5% agarose (in rijklare buffer met broomfenolblauw). Run 2-D elektroforese met behulp van Ettan DALTtwelve grote verticale System bij 5 W / gel gedurende 30 minuten, en dan bij 15 W / gel totdat de kleurstof front bereikt de onderkant van de gel.

Imaging en data-analyse

1. Na het voltooien van 2-D elektroforese, scan de gels voor Cy2, Cy3 of Cy5 met behulp van een Typhoon 9410 Variable Mode Imager.
2. Vergelijk spot kaarten van membraanfracties, cytosolische fracties, en niet-gefractioneerd monsters met behulp van DeCyder 2-D-Verschil Analyse Software ^4.

Post-vlekken

1. Na de beeldvorming, zilver vlekken op de gels volgens de standaard procedure ^5.

Eiwit identificatie

1. Telen, oogsten, wassen en lyseren preparatieve bedragen (ongeveer 1 mg totaal eiwit van 10 x106 CHO-cellen) van cellen, zoals hierboven beschreven voor een niet-gefractioneerde monster. Gebruik een Cy5 celoppervlak gelabelde monster (zie boven) als een piek, en toe te passen in combinatie met de niet-geëtiketteerde preparatieve hoeveelheden eiwitten.
2. Het uitvoeren van 2-D elektroforese als hierboven beschreven, maar deze keer, aplly 600 ug ongelabelde cel lysaat samen met 50 ug celoppervlak gelabeld spike door anodische cup toepassing. Gebruik referentie markers om de juiste plek plukken toe te staan, en plaats wordentussen de glazen platen voor de gel gieten volgens de aanbevelingen ^3.
3. Scan de gel in Cy5 kanaal naar de Cy5 celoppervlak spot kaart, gevolgd door een totaal eiwit kleuring met behulp van Deep purple totaal eiwit vlek ³ te verkrijgen.
4. Match samen de twee plek kaarten met behulp van de DeCyder 2-D software en maak een keuze lijst voor alle plaatsen die overeenkomt met de Cy 5 gelabelde cel oppervlakte-eiwitten. Pick cel-oppervlakte-eiwitten met behulp van de Ettan plek handling station, uittreksel uit de gel stekkers, en trypsinate het gebruik van de Ettan vergister. Identificeren met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie.

Tabel 1. Een Ettan DIGE experiment werd uitgevoerd met behulp van monsters van serum uitgeputte cellen geëtiketteerd volgens de cel-oppervlakte-eiwit labeling protocol in figuur 1.

Monster	De tijd van het serum uitputting	Gelabeld met CyDye	Gel nummer
1	-	Cy 3, Cy 2	1
2	30 minuten	Cy 5, Cy 2	1
3	2 uur	Cy 3, Cy 2	2
4	4 uur	Cy 5, Cy 2	2
5	16 uur	Cy 5, Cy 2	3

Discussion

Eiwitconcentratie

Een overzicht van de twee etikettering workflows is weergegeven in figuur 1. Omdat de cellen zijn nog steeds intact wanneer geëtiketteerd volgens de cel-oppervlakte-eiwit labeling-protocol, worden alleen de cel oppervlakte-eiwitten worden blootgesteld aan de kleurstof. In de standaard Ettan DIGE protocol, worden de cellen gelyseerd voor de etikettering en de eiwitten zowel binnen als buiten de cel zijn gelabeld (Fig 1). De relatieve hoeveelheid kleurstof aan eiwit in de cel-o...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE Kit, 2 nmol	Reagens	GE Healthcare	28-9345-30
2-D Quant Kit	Reagens	GE Healthcare	80-6484-51
IPG Buffer pH 3-11NL	Reagens	GE Healthcare	17-6004-40
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm	Reagens	GE Healthcare	17-6003-77
IPGbox	Gereedschap	GE Healthcare	28-9334-65
IPGbox kit	Gereedschap	GE Healthcare	28-9334-92
DeStreak Rehydration solution	Reagens	GE Healthcare	17-6003-19
Immobiline DryStrip Cover Fluid	Reagens	GE Healthcare	17-1335-01
Ettan IPGphor 3 IEF Unit	Instrument	GE Healthcare	11-0033-64
Ettan IPGphor Manifold	Instrumentonderdeel	GE Healthcare	80-6498-38
Ettan DALTtwelve Gel Caster	Gereedschap	GE Healthcare	80-6467-22
Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit	Instrument	GE Healthcare	80-6466-46	230 V unit: 80-6466-27
Typhoon 9410 Variable Mode Imager	Instrument	GE Healthcare	63-0055-81
Ettan Spot Picker	Instrument	GE Healthcare	18-1145-28
Ettan Digester	Instrument	GE Healthcare	18-1142-68
Ettan Spotter	Instrument	GE Healthcare	18-1142-67
Ettan MALDI-TOF	Instrument	GE Healthcare	18-1142-33
DeCyder 2-D Differential Analysis Software	Overige	GE Healthcare	28-4012-01
ImageQuant Analysis Software	Overige	GE Healthcare	28-9236-62
Urea	Reagens	GE Healthcare	17-1319-01
CHAPS	Reagens	GE Healthcare	17-1314-01
PlusOne Dithiothreitol (DTT)	Reagens	GE Healthcare	17-1318-01
Bromofenol Blauw	Reagens	GE Healthcare	17-1329-01
Tris	Reagens	GE Healthcare	17-1321-01
Sodiumdodecylsulfaat (SDS)	Reagens	GE Healthcare	17-1313-01
PlusOne Glycerol 87%	Reagens	GE Healthcare	17-1325-01
PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C	Reagens	GE Healthcare	17-1310-01
PlusOne TEMED	Reagens	GE Healthcare	17-1312-01
PlusOne Ammonium Persulfate	Reagens	GE Healthcare	17-1311-01
PlusOne Glycine	Reagens	GE Healthcare	17-1323-01
2-D Sample Prep for membrane proteins	Reagens	Pierce, Thermo Scientific	89864
Streptomycin sulfaat	Reagens	Invitrogen	15140-122