Name: Niet-radioactieve In situ Hybridisatie Protocol Toepasbaar voor Noorwegen Spruce en een bereik van plantensoorten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Leer een niet-radioactieve in situ hybridisatiemethode voor genexpressie-analyse in Noorse spar en diverse plantensoorten. Dit protocol optimaliseert RNase-behandeling en proteinase K-concentratie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We zijn erg dankbaar Anders Bovin, die op voorwaarde dat de muziek voor onze film en Michael Elliot Stocks voor vrijwilligerswerk aan de spreker stem. Ondersteuning werd geleverd door Carl Trygger Foundation, het strategisch onderzoeksprogramma Agricultural Functional Genomics (AgriFunGen) aan de Zweedse University of Agricultural Sciences, de Zweedse Research Council (VR), en de Zweedse Onderzoeksraad voor Milieu, Agricultural Sciences, en Ruimtelijke Ordening (Formas ).

<ol><li>Carr, S. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floral+homeotic+gene+expression+defines+developmental+arrest+stages+in+Brassica+oleracea+L.+vars.+botrytis+and+italica%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Floral homeotic gene expression defines developmental arrest stages in Brassica oleracea L. vars. botrytis and italica.</a> Planta. 201 (2), 179-188 (1997).</li>
<li>Coen, E. S., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+war+of+the+whorls%3A+genetic+interactions+controlling+flower+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The war of the whorls: genetic interactions controlling flower development.</a> Nature. 353 (6339), 31-37 (1991).</li>
<li>Jackson, D. In situ hybridization in plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJackson%2C+D+%22Molecular+Plant+Patology%3A+a+practical+approach%22">Molecular Plant Patology: a practical approach</a>. Gurr, S. J., McPherson, M. J., Bowles, D. J. , University Press. Oxford. (1991).</li>
<li>Leitch, A. R., Schwarzacher, T., Jackson, D., Leitch, I. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLeitch%2C+AR+%22In+situ+hybridization%3A+a+practical+guide%22">In situ hybridization: a practical guide</a>. , BIOS Scientific Publishers Limited. Oxford. (1994).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+flower+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).</li>
<li>Azevedo, H., Lino-Neto, T., Tavares, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+high-quality+RNA+isolation+from+needles+of+adult+maritime+pine+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">An improved method for high-quality RNA isolation from needles of adult maritime pine trees.</a> Plant Molecular Biology Reporter. , 333-338 (2003).</li>
<li>Sundstrom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MADS-box+genes+active+in+developing+pollen+cones+of+Norway+spruce+%28Picea+abies%29+are+homologous+to+the+B-class+floral+homeotic+genes+in+angiosperms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genet%22%5BJournal%5D)">MADS-box genes active in developing pollen cones of Norway spruce (Picea abies) are homologous to the B-class floral homeotic genes in angiosperms.</a> Dev Genet. 25 (3), 253-266 (1999).</li>
<li>Tandre, K., Svenson, M., Svensson, M. E., Engstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+gene+structure+and+activity+in+the+regulation+of+reproductive+organ+development+of+conifers+and+angiosperms%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Conservation of gene structure and activity in the regulation of reproductive organ development of conifers and angiosperms.</a> Plant J. 15 (5), 615-623 (1998).</li>
<li>Winter, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MADS-box+genes+reveal+that+gnetophytes+are+more+closely+related+to+conifers+than+to+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MADS-box genes reveal that gnetophytes are more closely related to conifers than to flowering plants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (13), 7342-7347 (1999).</li>
<li>Savard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+and+nuclear+gene+sequences+indicate+late+Pennsylvanian+time+for+the+last+common+ancestor+of+extant+seed+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chloroplast and nuclear gene sequences indicate late Pennsylvanian time for the last common ancestor of extant seed plants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (11), 5163-5167 (1994).</li>
<li>Jack, T., Brockman, L. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeotic+gene+APETALA3+of+Arabidopsis+thaliana+encodes+a+MADS+box+and+is+expressed+in+petals+and+stamens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The homeotic gene APETALA3 of Arabidopsis thaliana encodes a MADS box and is expressed in petals and stamens.</a> Cell. 68 (4), 683-697 (1992).</li>
<li>Bowman, J. L., Smyth, D. R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+directing+flower+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Genes directing flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 1 (1), 37-52 (1989).</li>
<li>Kramer, E. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+genetic+mechanisms+controlling+petal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolution of genetic mechanisms controlling petal development.</a> Nature. 399 (6732), 144-148 (1999).</li>
<li>Sundstrom, J., Engstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conifer+reproductive+development+involves+B-type+MADS-box+genes+with+distinct+and+different+activities+in+male+organ+primordia%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Conifer reproductive development involves B-type MADS-box genes with distinct and different activities in male organ primordia.</a> Plant J. 31 (2), 161-169 (2002).</li>
<li>Carlsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+altered+expression+of+a+large+number+of+nuclear+genes+in+developing+cytoplasmic+male+sterile+Brassica+napus+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals altered expression of a large number of nuclear genes in developing cytoplasmic male sterile Brassica napus flowers.</a> Plant J. 49 (3), 452-462 (2007).</li>
<li>Teixeira, R. T., Farbos, I., Glimelius, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+levels+of+meristem+identity+and+homeotic+genes+are+modified+by+nuclear-mitochondrial+interactions+in+alloplasmic+male-sterile+lines+of+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Expression levels of meristem identity and homeotic genes are modified by nuclear-mitochondrial interactions in alloplasmic male-sterile lines of Brassica napus.</a> Plant J. 42 (5), 731-742 (2005).</li>
<li>Ying, S., Kay, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+technique+of+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The technique of in situ hybridization.</a> Methods in Molecular Medicine. 56, 263-283 (2001).</li>
</ol>

Twee aspecten van de P. abies protocol werden geoptimaliseerd ten opzichte van de A. thaliana / B. napus protocol, RNase behandeling en proteinase K concentratie. De RNase verwijdert achtergrond signalen en verhoogt zo het signaal specificiteit 17. De proteinase K behandeling is nodig om de weefsels permeabilize, zodat de sonde kunt invoeren en hybridiseren met het RNA pool van belang. De DAL13 antisense probe gaf een hogere signaal zonder RNase-behandeling (Fig. 3C, E, G) in vergelijking met secties behandeld met RNase gedurende 30 minuten (figuur 2D, F en H). Sinds de RNase-behandeling niet verbeteren het signaal dat werd verwijderd uit het protocol. De proteinase K behandeling werden getest op drie verschillende concentraties, 1, 3 en 5 ug / ml. In het geval van P. abies een lage of geen signaal werd waargenomen met behulp van 1 ug / ml proteinase K (fig. 3C-D). Een sterk signaal werd verkregen met zowel 3 ug / ml (Afb. 3E-F) en 5 ng / ml (afb. 3G-H) proteïnase K. Aangezien er geen duidelijk verschil in signaalsterkte werd gevonden bij het gebruik van 5 ug / ml proteinase K in vergelijking met 3 ug / ml, hebben we ervoor gekozen om 3 ug / ml te gebruiken in ons protocol. Het is waarschijnlijk dat de noodzaak van een hogere proteinase K concentratie in de P. abies mannelijke kegels ten opzichte van de A. thaliana en B. napus bloemen knoppen is te wijten aan compacter weefsel met hogere niveaus van fenolen en polysachariden. Tijdens de fixatie en inbedding enkele verschillen tussen de A. thaliana / B. napus protocol en de P. abies protocol zijn evident. Het weefsel van belang is vast te RNA retentie te bieden en dit is een belangrijke stap, omdat slecht vaste materialen zou kunnen geven een lage of niet detecteerbare signaal ook al is het mRNA is zeer overvloedig. Het weefsel is uitgedroogd, gewist en ingebed in was in de geleidelijke veranderingen van weefsel schade te voorkomen, en in sommige protocollen 0,85% NaCl wordt toegevoegd aan de ethanol in de uitdroging te vermijden om verdere krimp en zwelling van de cellen 3. De uitdroging stap tijdens inbedden kan worden uitgevoerd op het ijs om RNase activiteit houden minimum te beperken. In de P. abies protocol van de 4% paraformaldehyde fix-oplossing bevat 0,25% glutaaraldehyde, die geacht wordt om een betere RNA retentie geven 17 ook al is dat sommige mensen beweren dat het waarschijnlijk geen verschil 3 te maken. Na het snijden van het materiaal is bevestigd op dia&#39;s en voorbehandeld (dat wil zeggen was ontdaan, gerehydrateerd, gepermeabiliseerde, getrakteerd op niet-specifieke binding van de probe en tenslotte gedroogd te verminderen) voor de hybridisatie. In het protocol hier gepresenteerde de hele detectie-procedure kan worden uitgevoerd in gewone laboratoria, het signaal ontwikkelt zich meestal binnen 1-3 dagen en de verhouding tussen signaal over achtergrond kan doorlopend worden gecontroleerd. Het DIG-gelabelde probes meestal geven een duidelijker signaal in vergelijking met radioactief gelabelde probes, zijn stabieler en kan worden hergebruikt in opeenvolgende experimenten. Aan de andere kant, is de gevoeligheid verminderd in vergelijking met radioactieve probes 17. In situ hybridisatie detecteert uitdrukking met een gemerkte probe die specifiek is voor een bepaalde mRNA. Radioactieve labeling is een robuuste en gevoelige etikettering methode, maar het vereist de behandeling van radioactiviteit en het duurt enkele weken voordat de resultaten kunnen worden gedetecteerd. Antigeen-gelabelde probes aan de andere kant, zijn stabieler, minder gevaarlijk en vereisen de blootstelling aan de detectie medium voor een paar dagen maar 17. Zo zijn antigeen-labelling methoden die momenteel domineert. De meest kritische fase, ongeacht het protocol is de sonde ontwerp. Zorg moeten worden genomen om ervoor te zorgen dat de sonde heeft een hoge specificiteit en is voorzien van een hoge kwaliteit UTPs. Soms zijn de hybridisatie temperatuur en / of de reactie lengte moeten worden aangepast voor specifieke probes. Onze gewijzigd protocol op basis van DIG-gelabelde probes zal vergemakkelijken lokalisatie van mRNA-expressie tegelijk in soorten, variërend van A. thaliana aan P. abies, en moet met kleine aanpassingen bruikbaar in andere plantensoorten. Het protocol heeft, naast de mannelijke kegels, is ook getest op verschillende stadia van vegetatieve scheuten en in zowel zygotische en somatische embryo&#39;s van P. abies met goede resultaten (niet gepubliceerde resultaten;. Karlgren et al.).

<table><tbody><tr><td>Azijnzuuranhydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6404-200ml</td><td>minimum 98%</td></tr><tr><td>Acrylamide, lineair</td><td>Ambion</td><td>9520</td><td></td></tr><tr><td>Anti-DIG-antilichamen</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blokkeringsreagens</td><td>Roche Group</td><td>11 175 041 910 of 11 096 176 001</td><td></td></tr><tr><td>Runderseirumalbumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-50g</td><td>minimum 98%</td></tr><tr><td>Gedeïoniseerd formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Denhardts oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2532-5ml</td><td></td></tr><tr><td>DEPC, diethylpyrocarbonaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextraansulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)</td><td>Roche Group</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>Glutaaraldehyde (25%)</td><td>Histolab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycogeen</td><td>Ambion</td><td>9510G</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear II</td><td>Histolab</td><td></td><td>U kunt Tissue-clear, Histoclear II, xyleen of iets soortgelijks gebruiken bij het inbedden van uw weefsel.</td></tr><tr><td>Histowax</td><td>Histolab</td><td></td><td>Histowax of Paraplast kan worden gebruikt voor inbedding.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500g</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3683-1kg</td><td>Histowax of Paraplast kan worden gebruikt voor inbedding.</td></tr><tr><td>Phusion&amp;#8482; High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Finnzymes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probe-on Plus objectglazen</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-230-900</td><td></td></tr><tr><td>Proteïnase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308-5mg</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5503-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-clear</td><td>Sakura Finetek</td><td></td><td>U kunt Tissue-clear, Histoclear II, xyleen of iets soortgelijks gebruiken bij het inbedden van uw weefsel.</td></tr><tr><td>Triethanolamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1377-100ml</td><td>minimum 98%</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>gebruik het standaardproduct in uw laboratorium</td><td></td><td>Gebruik Triton X-100, Tween-20, of beide.</td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83853-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>gebruik het standaardproduct in uw laboratorium</td><td></td><td>Gebruik Triton X-100, Tween-20, of beide.</td></tr><tr><td>Western Blue</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

niet-radioactieve in situ hybridisatie protocol toepasbaar voor noorwegen spruce en een bereik van plantensoorten

Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

De high-throughput expressie analyse technieken die vandaag beschikbaar zijn geven wetenschappers een overloop van expressie profielen, maar hun resolutie op het gebied van weefsel-specifieke expressie is beperkt als gevolg van problemen in ontleden individuele weefsels. Uitdrukking gegevens moeten worden bevestigd en aangevuld met expressie patronen met behulp van bijvoorbeeld in situ hybridisatie, gebruikt een techniek om lokaliseren cel-specifieke mRNA-expressie. De in situ hybridisatie methode is omslachtig, tijdrovend en vaak vereist uitgebreide optimalisatie, afhankelijk van diersoort en weefsels. In situ experimenten zijn relatief moeilijker uit te voeren in een bosrijke soorten, zoals de conifeer Noorwegen spar (Picea abies). Hier hebben we een gewijzigd DIG in situ hybridisatie protocol, dat is snel en van toepassing op een breed scala aan plantensoorten, waaronder P. abies. Met slechts een paar aanpassingen, zoals gewijzigd RNase behandeling en proteinase K concentratie, kunnen we gebruiken het protocol bij weefselspecifieke expressie van homologe genen in mannelijke voortplantingsorganen van een naaktzadige en twee bloemplant soorten te bestuderen; P. abies, Arabidopsis thaliana en Brassica napus. Het protocol werkt even goed voor de soorten en genen bestudeerd. AtAP3 en BnAP3 werden waargenomen in de tweede en derde krans bloemen organen in A. thaliana en B. napus en DAL13 in microsporophylls van de mannelijke kegels van P. abies. Voor P. abies de proteinase K concentratie, gebruikt om de weefsels permeablize, moest worden verhoogd tot 3 g / ml in plaats van 1 g / ml, mogelijk als gevolg van meer compacte weefsels en hogere niveaus van fenolen en polysachariden. Voor alle soorten van de RNase behandeling werd als gevolg van verminderde signaalsterkte verwijderd zonder een corresponderende toename van de specificiteit. Door het vergelijken van weefsel-specifieke expressie patronen van homologe genen van beide bloeiende planten en een naaldboom we laten zien dat de DIG in situ-protocol hier voorgesteld, met slechts minuten aanpassingen, kan worden toegepast op een breed scala aan plantensoorten. Vandaar dat het protocol voorkomt zowel uitgebreide species specifieke optimalisatie en de moeizame gebruik van radioactief gelabelde probes in het voordeel van DIG gemerkte probes. We hebben ervoor gekozen om de technisch veeleisende stappen van het protocol in onze film te illustreren. Anna Karlgren en Jenny Carlsson droegen ook voor deze studie. Overeenkomstige auteurs: Anna Karlgren op Anna.Karlgren @ ebc.uu.se en Jens F. Sundström op Jens.Sundstrom @ vbsg.slu.se

Beschrijven we een aangepaste DIG<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie protocol, dat is snel en van toepassing op een breed scala aan plantensoorten waaronder Noorwegen spar. Met slechts een paar aanpassingen, zoals gewijzigd RNase behandeling en proteinase K concentratie, kan het protocol worden gebruikt in studies van andere weefsels en diersoorten.

Niet-radioactieve In situ Hybridisatie Protocol Toepasbaar voor Noorwegen Spruce en een bereik van plantensoorten

De tegenwoordig beschikbare high-throughput-technologieën voor expressieanalyse voorzien wetenschappers van een overvloed aan expressieprofielen, maar hun resolutie in termen van ...

Protocol voor niet-radioactieve in situ hybridisatie toepasbaar op de Noorse spar en diverse plantensoorten. Carre Etal. Hallo, mijn naam is AM GaN, en wij werken aan de OBS University en de Swedish University of Agriculture Sciences in obs Zweden.We hebben een protocol voor inbedding en coupeschnitting ontwikkeld dat werkt voor verschillende plantensoorten. Vandaag gaan we u enkele uitdagende stappen laten zien. In dit protocol laten we u de inbedding, het maken van coupes en verschillende stappen in het eigenlijke inbeddingsexperiment zien.Laten we naar lab Eén gaan, fixatie en inbedding stap negen tot 11 in het protocol. Stap negen, verwarm petrischalen en vormen voorhandig tot 60 °C. Stap 10, verhit een pincet en verdeel de weefsels gelijkmatig over een schaal.Voeg meer histowas toe zodat de weefsels bedekt zijn. Stap 11, laat de was uitharden bij kamertemperatuur. Volg vervolgens stappen 12 tot en met 19 in het protocol.Zet de warmteplaten aan en zorg dat er gesmolten histowas beschikbaar is. Haal de monsters uit de koelruimte. Stap 13: gebruik een scalpel om voorzichtig een waxblokje weefsel uit te snijden.Vorm het stuk om het snijden te vergemakkelijken. Stap 14, verhit het blok koud en smelt de hiel samen. Laat het preparaat uitharden bij 4 °C.Stap 15, snijd het waxblok in secties met een dikte van zes tot acht micrometer. Met behulp van een microtoom worden de secties verbonden tot één lang lint. Snijd een lint af en plaats dit op papier.Op dit punt is het mogelijk om de individuele secties onder een stereomicroscoop te inspecteren om secties van interesse te kiezen. Een inspectie is eenvoudig uit te voeren bij weefsels die met eosine zijn gekleurd. Stap 17: voeg RNA-vrij Milli Q-water toe aan de objectglazen.Snijd het lint in kleinere stukjes en plaats deze op de objectglazen. Verplaats de objectglazen naar de warmteplaat. Stap 17, laat de linten één tot twee minuten vlakliggen op een plaat van 42 °C.Giet het water af met Kim-wipes. Stap 19, incubeer de coupes gedurende de nacht bij 42 °C zodat de weefsels aan de coupes hechten voor in situ hybridisatie 4.1 in situ sectie. Pre-treatment stappen 36 tot 48 in het protocol.Stap 36: deparaffiniseer de coupes in de histolaag. De objectglazen worden gelijkmatig verdeeld en in een rek geplaatst om de verplaatsing tussen verschillende containers te vergemakkelijken; dehydrateer de coupes. Voeg in een ethanolserie azijnzuuranhydride toe onder krachtig roeren.Stap 45, voorbereiding voor behandeling met azijnzuumhydride 4.2 in situ hybridisatie. Stappen 49 tot 52 in een protocol. Stap 51, rijpen van Pro One Plus slides.De oplossing is viskeus. Probeer luchtbellen te vermijden. Incubeer de coupes in een vochtige kamer.4.3 init. Na hybridisatie, stappen 53 tot 72 in het protocol. Stap 62, incubeer de objectglazen met het bufferblok in een plastic container.Stap 63, voeg voldoende blokkeringsoplossing toe om de objectglazen net te bedekken. De antilichamen worden aan de objectglazen toegevoegd via aging. Aging werkt alleen met prob bon plus objectglazen. Voor objectglazen met een vergelijkbaar ontwerp, Stap 65, laat de capillaire krachten de anti-dig antilichamenoplossing omhoog trekken.Deze stap wordt herhaald. Stap 70, zoals eerder beschreven: plaats de sandwich en zuig de Western Blue-oplossing op. Let op dat de Western Blue-oplossing twee keer wordt opgezogen, precies zoals we deden bij de anti-dig antilichaamoplossing.En bij stap 65, stap 71: incubeer de objectglazen gedurende één tot vijf dagen in het donker. Bij kamertemperatuur kan de monitoring van de hybridisatiesignalen worden uitgevoerd met een stereomicroscoop. Terwijl de objectglazen nog in de sandwichstructuur zitten, zouden paars tot bruinachtige vlekken waarneembaar moeten zijn.Dit is hoe de resultaten van het daadwerkelijke experiment in het CW-station eruitzien. U kunt het signaal hier zien als een paarsbruine kleuring.

non-radioactive-situ-hybridization-protocol-applicable-for-norway

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dubbele Fluorescentie In situ Hybridisatie in Fresh Brain secties

Hele Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van E8.5 aan E11.5 muis embryo&#39;s

In situ hybridisatie voor de precieze lokalisatie van de transcripten in planten

Dit protocol wordt met succes gebruikt om kwantitatief te detecteren niveaus en ruimtelijke patronen van mRNA-expressie in verschillende weefsels vormen over gewervelde soorten. De methode kan detecteren lage abundantie transcripties en maakt het verwerken van honderden dia's tegelijk. We presenteren dit protocol met behulp van expressie profilering van aviaire embryonale hersenen formatie als voorbeeld.

Radioactieve In situ Hybridisatie voor het detecteren van Divers genexpressiepatronen in Tissue

Door het combineren van methoden voor RNA whole...

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie in Hele Mount Embryo&#39;s en histologie Aangepast voor Marine kraakbeenvissen

We beschrijven hier een eenvoudige fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) werkwijze voor de lokalisatie van virussen en bacteriën in insecten en plantenweefsels. Dit protocol kan worden verlengd voor de visualisatie van mRNA in ganse berg en preparaten.

Fluorescentie<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisaties (FISH) voor de lokalisatie van Virussen en Endosymbiotic Bacteriën in Plant en Insect Tissues

Dit protocol beschrijft een eenvoudige Hybrid-Cut methode voor weefselsecties die nuttig is voor moeilijk verwerkbare plantweefsels. Goede kwaliteit weefselsecties maken anatomische studies en andere biologische studies mogelijk, inclusief in situ hybridisatie (ISH).

Hybride-Cut: een verbeterde Sectioning Methode voor Recalcitrante plantenweefsel Samples

Problemen bij de verwerking van biologische monsters voor waarneming door middel van rasterelektronenmicroscopie omvatten celimplosie, behandeling van monsters uit natte micro-omgevingen en celvernietiging. Goedkope en relatief snelle protocollen die geschikt zijn voor het voorbereiden van uitdagende monsters zoals bloemtoppen, oömyceten cysten en schimmels (Agaricales) zijn hier samengesteld en gedetailleerd.

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocollen voor Problematisch Plant, oömyceet en Fungal Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) wordt toegepast op beeld en analyseren van dendritische stekels in de muriene hippocampus.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) voor de studie van dendritische stekels

Dit protocol biedt een efficiënte workflow voor single-molecule localisatie microscopiebeeldvorming van geïsoleerde Arabidopsis-kernen, waarbij geoptimaliseerde isolatie, fixatie en labeling wordt gebruikt om betrouwbare nanoschaalvisualisatie van chromatine en RNA Polymerase II te bereiken. Deze benadering kan gemakkelijk worden aangepast aan andere chromatine-geassocieerde eiwitten of histonmodificaties voor beeldvorming met hoge resolutie.

Een gestroomlijnd protocol voor single-molecule localisatiemicroscopie in Arabidopsis-kernen

Leer een niet-radioactieve in situ hybridisatiemethode voor genexpressie-analyse in Noorse spar en diverse plantensoorten. Dit protocol optimaliseert RNase-behandeling en proteinase K-concentratie.

Niet-radioactieve In situ Hybridisatie Protocol Toepasbaar voor Noorwegen Spruce en een bereik van plantensoorten

Meer video's verkennen