Niet-radioactieve In situ Hybridisatie Protocol Toepasbaar voor Noorwegen Spruce en een bereik van plantensoorten
17 april 2009
Beschrijven we een aangepaste DIG In situ Hybridisatie protocol, dat is snel en van toepassing op een breed scala aan plantensoorten waaronder Noorwegen spar. Met slechts een paar aanpassingen, zoals gewijzigd RNase behandeling en proteinase K concentratie, kan het protocol worden gebruikt in studies van andere weefsels en diersoorten.
Protocol voor niet-radioactieve in situ hybridisatie toepasbaar op de Noorse spar en diverse plantensoorten. Carre Etal. Hallo, mijn naam is AM GaN, en wij werken aan de OBS University en de Swedish University of Agriculture Sciences in obs Zweden.
We hebben een protocol voor inbedding en coupeschnitting ontwikkeld dat werkt voor verschillende plantensoorten. Vandaag gaan we u enkele uitdagende stappen laten zien. In dit protocol laten we u de inbedding, het maken van coupes en verschillende stappen in het eigenlijke inbeddingsexperiment zien.
Laten we naar lab Eén gaan, fixatie en inbedding stap negen tot 11 in het protocol. Stap negen, verwarm petrischalen en vormen voorhandig tot 60 °C. Stap 10, verhit een pincet en verdeel de weefsels gelijkmatig over een schaal.
Voeg meer histowas toe zodat de weefsels bedekt zijn. Stap 11, laat de was uitharden bij kamertemperatuur. Volg vervolgens stappen 12 tot en met 19 in het protocol.
Zet de warmteplaten aan en zorg dat er gesmolten histowas beschikbaar is. Haal de monsters uit de koelruimte. Stap 13: gebruik een scalpel om voorzichtig een waxblokje weefsel uit te snijden.
Vorm het stuk om het snijden te vergemakkelijken. Stap 14, verhit het blok koud en smelt de hiel samen. Laat het preparaat uitharden bij 4 °C.
Stap 15, snijd het waxblok in secties met een dikte van zes tot acht micrometer. Met behulp van een microtoom worden de secties verbonden tot één lang lint. Snijd een lint af en plaats dit op papier.
Op dit punt is het mogelijk om de individuele secties onder een stereomicroscoop te inspecteren om secties van interesse te kiezen. Een inspectie is eenvoudig uit te voeren bij weefsels die met eosine zijn gekleurd. Stap 17: voeg RNA-vrij Milli Q-water toe aan de objectglazen.
Snijd het lint in kleinere stukjes en plaats deze op de objectglazen. Verplaats de objectglazen naar de warmteplaat. Stap 17, laat de linten één tot twee minuten vlakliggen op een plaat van 42 °C.
Giet het water af met Kim-wipes. Stap 19, incubeer de coupes gedurende de nacht bij 42 °C zodat de weefsels aan de coupes hechten voor in situ hybridisatie 4.1 in situ sectie. Pre-treatment stappen 36 tot 48 in het protocol.
Stap 36: deparaffiniseer de coupes in de histolaag. De objectglazen worden gelijkmatig verdeeld en in een rek geplaatst om de verplaatsing tussen verschillende containers te vergemakkelijken; dehydrateer de coupes. Voeg in een ethanolserie azijnzuuranhydride toe onder krachtig roeren.
Stap 45, voorbereiding voor behandeling met azijnzuumhydride 4.2 in situ hybridisatie. Stappen 49 tot 52 in een protocol. Stap 51, rijpen van Pro One Plus slides.
De oplossing is viskeus. Probeer luchtbellen te vermijden. Incubeer de coupes in een vochtige kamer.
4.3 init. Na hybridisatie, stappen 53 tot 72 in het protocol. Stap 62, incubeer de objectglazen met het bufferblok in een plastic container.
Stap 63, voeg voldoende blokkeringsoplossing toe om de objectglazen net te bedekken. De antilichamen worden aan de objectglazen toegevoegd via aging. Aging werkt alleen met prob bon plus objectglazen. Voor objectglazen met een vergelijkbaar ontwerp, Stap 65, laat de capillaire krachten de anti-dig antilichamenoplossing omhoog trekken.
Deze stap wordt herhaald. Stap 70, zoals eerder beschreven: plaats de sandwich en zuig de Western Blue-oplossing op. Let op dat de Western Blue-oplossing twee keer wordt opgezogen, precies zoals we deden bij de anti-dig antilichaamoplossing.
En bij stap 65, stap 71: incubeer de objectglazen gedurende één tot vijf dagen in het donker. Bij kamertemperatuur kan de monitoring van de hybridisatiesignalen worden uitgevoerd met een stereomicroscoop. Terwijl de objectglazen nog in de sandwichstructuur zitten, zouden paars tot bruinachtige vlekken waarneembaar moeten zijn.
Dit is hoe de resultaten van het daadwerkelijke experiment in het CW-station eruitzien. U kunt het signaal hier zien als een paarsbruine kleuring.
Overzicht
Dit artikel presenteert een aangepast DIG in situ hybridisatieprotocol dat efficiënt en aanpasbaar is voor diverse plantensoorten, waaronder de Noorse spar. Het protocol bevat specifieke aanpassingen, zoals wijzigingen in de RNase-behandeling en de concentratie proteinase K, om de toepasbaarheid in verschillende weefsels en soorten te verbeteren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Plantenbiologie
- Moleculaire biologie
- In situ hybridisatie-technieken
Achtergrond
- In situ hybridisatie is een waardevolle techniek voor het bestuderen van genexpressie in weefsels.
- Traditionele methoden kunnen tijdrovend en soortspecifiek zijn.
- Modificaties van bestaande protocollen kunnen de efficiëntie en veelzijdigheid verbeteren.
- Deze studie richt zich op een protocol dat geschikt is voor een reeks plantensoorten.
Doel van de studie
- Om een sneller en aanpasbaarder in situ hybridisatieprotocol te ontwikkelen.
- Om de toepasbaarheid van het protocol op de Noorse spar en andere plantensoorten aan te tonen.
- Om gedetailleerde procedurele stappen voor onderzoekers te bieden.
Gebruikte methoden
- Inbedding en doorsnijden van plantenweefsels.
- Voorbehandeling en hybridisatiestappen voor in situ-analyse.
- Gebruik van specifieke reagentia en condities om de resultaten te optimaliseren.
- Monitoring van hybridisatiesignalen onder een microscoop.
Belangrijkste resultaten
- Het aangepaste protocol faciliteert succesvol in situ hybridisatie bij meerdere plantensoorten.
- Aanpassingen in de RNase-behandeling en de concentratie proteinase K verbeteren de compatibiliteit van het weefsel.
- Een duidelijke visualisatie van de hybridisatiesignalen werd bereikt.
- Het protocol is efficiënt en reproduceerbaar voor diverse toepassingen.
Conclusies
- Het gemodificeerde DIG in situ hybridisatieprotocol is een waardevol instrument voor plantonderzoek.
- Het maakt een snelle en effectieve analyse van genexpressie in diverse planteweefsels mogelijk.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op dit protocol voor bredere toepassingen in de plantbiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit protocol maakt ruimtelijke genexpressieanalyse met hoge resolutie in plantensystemen mogelijk, wat doelwitvalidatie in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt door weefselspecifieke expressiepatronen te bevestigen. Het vermindert de afhankelijkheid van radioisotopen en uitgebreide soortspecifieke optimalisatie, waardoor de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid voor vergelijkende studies tussen verschillende soorten wordt verbeterd. De methode biedt mechanische risicovermindering voor fenotypische screening en de ontdekking van translationele biomarkers in plantgebaseerde biofarmaceutische pijplijnen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroegtijdige ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Bevestigt weefselspecifieke mRNA-lokalisatie om therapeutische hypothesen te onderzoeken en genfuncties in reproductieve ontwikkelingspaden te verduidelijken.
- Operationele waarde: Maakt functionele target-validatie mogelijk door directe visualisatie van genexpressie in mannelijke reproductieve organen in gymnospermen en angiospermen modellen.
- Predictieve waarde: Ondersteunt de predictieve betrouwbaarheid door geconserveerde expressiepatronen van homologe genen (bijv. AP3-homologen) aan te tonen in bloemstructuren van Arabidopsis, Brassica en Noorse spar.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gestandaardiseerde weefselcoupes voor voor downstream hybridisatie-assays met consistente signaaldetectie met behulp van DIG-gelabelde probes.
- Reproduceerbaarheid: Elimineert de RNase-behandeling en past de concentratie proteinase K aan om de signaalsterkte te verhogen en de variabiliteit tussen soorten te verminderen.
- Schaalbaarheid: Faciliteert high-throughput toepassingen bij diverse plantensoorten met minimale protocolaanpassingen, waardoor hergebruik van het platform in vergelijkende genomica mogelijk wordt.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Translationele continuïteit: Toont de toepasbaarheid aan van model-angiospermen naar gymnospermen, wat de extrapolatie van bevindingen naar houtige overblijvende systemen ondersteunt die relevant zijn voor de productie van biomassa en biopolymeren.
- Mechanistische risicoreductie: Vermindert ambiguïteit bij de toewijzing van genfuncties door sequentiehomologie te koppelen aan ruimtelijke expressie in geconserveerde ontwikkelingsstructuren.
- Afstemming van biomarkers: Maakt ruimtelijke correlatie van genexpressie met fenotypische kenmerken in reproductieve weefsels mogelijk, wat de ontdekking van biomarkers in plantaire moleculaire farming ondersteunt.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen de fase van discovery biology, waardoor hypothese-gestuurde targetidentificatie mogelijk is voorafgaand aan de screening van leadverbindingen in expressiesystemen op basis van planten.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door de ruimtelijke expressie van kandidaatgenen in specifieke weefsels en ontwikkelingsstadia te valideren.
- Screening: Genereert kwantitatieve ruimtelijke read-outs die het assay-ontwerp informeren voor het monitoren van het effect van verbindingen in transgene of behandelde weefsels.
- Analytica: Produceert detecteerbare chromogene signalen (paars tot bruinachtig) die geschikt zijn voor beeldvorming en vergelijkende analyse over verschillende experimentele condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt genexpressiepatronen met ontwikkelingsfenotypes in voortplantingsorganen, wat beslissingen over verdere stappen in trait-validatiepipelines ondersteunt.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Vestigt een gestandaardiseerde, aanpasbare workflow voor genexpressieanalyse over verschillende soorten heen, waardoor redundante optimalisatie-inspanningen worden verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in targetvalidatie door directe, ruimtelijk opgeloste mRNA-detectie zonder radioactieve risico's.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door het weglaten van RNase-behandeling en de standaardisatie van het gebruik van proteinase K, waardoor het aantal mislukte protocollen afneemt.
- Strategische waarde: Versnelt go/no-go-beslissingen bij targetselectie door vroeg in de ontdekkingsfase eenduidige expressiedata te leveren.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van targets mogelijk op basis van geconserveerde expressiepatronen tussen soorten, wat de succespercentages in downstream-applicaties verbetert.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in histologie, weefselinbedding en het maken van coupes van plantmateriaal.
- Afhankelijk van toegang tot microtomen, hybridisatieovens en chromogene detectiesystemen.
- Vereist standaardisatie van de proteinase K-concentratie op basis van weefseldichtheid en fenolengehalte.
- Omvat aanpassing van incubatietijden en temperaturen voor verschillende soorten en probelengtes.
- Beperkt door autofluorescentie van weefsel en penetratie van verbindingen in sterk gelignificeerde monsters of monsters rijk aan secundaire metabolieten.
