Name: Het meten van replicatieve levensduur in de gist (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Leer de replicatieve levensduur meten in Saccharomyces cerevisiae moedercellen. Dit protocol helpt onderzoekers genetische factoren te identificeren die de celveroudering beïnvloeden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​aan MK en BKK van de Ellison Medical Foundation. MK is een Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging. We willen graag Soumya Kotireddy bedanken voor hulp tijdens het filmen.

Deel 1: Bereid stammen en platen voor replicatieve levensduur analyse Deze paragraaf beschrijft de bereiding van het vaste YEPD platen voor gebruik in de replicatieve levensduur experiment en de voorbereiding van de gistcellen voor de levensduur analyse. <ol><li> Met behulp van geschikte steriele techniek, voor te bereiden YEPD agar platen (1% gistextract, 2% Bacto-pepton, 2% agar, 2% glucose) die zullen worden gebruikt voor het kweken van gistcellen en voor replicatieve levensduur analyse. U moet zich voorbereiden op zijn minst twee platen voor om de 4-5 stammen worden geanalyseerd in de levensduur experiment. De platen moeten bereid minimaal 2 dagen voor de levensduur experiment en laten drogen voor het begin van de levensduur test. Als het experiment niet te worden gestart binnen 4-5 dagen van het gieten van de platen, moeten ze worden geplaatst in een gekoelde incubator en verpakt in parafilm of plastic om uitdroging te voorkomen. </li><li> Verwijder de giststammen van bevroren voorraden en strook voor enkele kolonies op YEPD agar platen. Tot 6 stammen kunnen gemakkelijk worden strepen op dezelfde YEPD plaat door afscherming van de plaat in gelijke grootte pie-vormige wiggen. </li><li> Incubeer de cellen bij 30 ° C gedurende 2 dagen. </li><li> Verwijder cellen van de incubator en patch cellen van een kolonie op een frisse YEPD plaat. Twee patches van twee verschillende kolonies moet worden gegenereerd voor elke stam. Op dit moment moeten de stammen te analyseren worden gecodeerd om ervoor te zorgen de replicatieve levensduur experiment wordt uitgevoerd &quot;blind&quot;, waarbij de dissectors niet weet wat de identiteit van de afzonderlijke stammen. </li><li> Incubeer de gepatchte, gecodeerd cellen bij 30 ° C tot de volgende avond. </li><li> Verwijder de cellen en licht patch cellen van elkaar gecodeerd stam in de frisse YEPD platen, die zal dienen als de experimentele platen gebruikt voor de replicatieve levensduur analyse. De cellen moeten worden opgelapt langs een verticale lijn aan de linkerkant van het YEPD plaat (figuur 1). Ongeveer 3-5 plekken per plaat is optimaal, in de veronderstelling replicatieve levensduur analyse van 20 cellen van elke patch. Het is niet nodig (noch wenselijk) om een ​​groot aantal cellen over te dragen aan de frisse YEPD plaat, want dit zal ertoe leiden dat de cellen om dik groeien tijdens de incubatie gedurende de nacht, die hun latere replicatieve levensduur kan beperken. </li><li> Incubeer de vers gepatchte plaatjes gedurende een nacht op de bank top. </li></ol> Deel 2: Positie-cellen voor replicatieve levensduur analyse. In deze paragraaf beschrijven we hoe de gistcellen op de plaat en hoe maagdelijke dochter van cellen voor replicatieve levensduur analyse kan worden bereikt positie. Vanaf dit punt, moeten alle borden worden parafilmed, behalve wanneer ondergaan dissectie, om uitdroging te voorkomen. <ol><li> Met behulp van een microscoop is uitgerust met een microdissectie apparaat geschikt is voor gist, transfer ongeveer 50 cellen van de eerste gepatcht stam naar een positie op de plaat distaal van de gepatchte cellen. Als uw microscoop fase wordt gesorteerd, kunnen deze gradaties worden gebruikt om ervoor te zorgen de cellen zullen worden makkelijk te vinden bij volgende iteraties. Op de Zeiss Axioscope 40, kunnen cellen van de eerste gepatcht stam worden geplaatst op de coördinaten 90 x 10 en verticaal opgestelde vanaf daar. </li><li> Reinig de naald van de cellen door herhaaldelijk aanraken van het agar oppervlak, maak dan een gat in de agar door het forceren van de naald door de agar oppervlak. Dit gat zal dienen als een marker te oriënteren je op het bord bij volgende iteraties van dissectie en dochter cel verwijderen. Zorg dat er geen gistcellen krijgen in het gat, of ze zal groeien en vormen een kolonie. </li><li> Direct boven het gat, verticaal uit te lijnen individuele gistcellen in 20 gelijkmatig verdeeld posities, met 1-3 naald diameters (~ 100 uM) tussen elke cel positie (figuur 1). Om de paar cellen, plaats twee cellen naast elkaar in dezelfde positie in de regel in plaats van een. Dit zorgt voor redundantie tijdens de maagdelijke dochter celselectie, als een van de overgedragen cellen niet verdelen. </li><li> Tussen de 10 e en 11 e positie in de lijn, ontstaan ​​van een horizontale reeks van 7-8 gaten in de agar. Dit zal dienen als een marker te oriënteren je op het bord bij volgende iteraties van dissectie en dochter cel verwijderen. Zorg dat er geen gistcellen krijgen in de gaten, of ze zal groeien en vormen een kolonie. </li><li> Herhaal stap 2,1-2,4 voor elke patch op de plaat, blijven reeks cellen verticaal langs dezelfde as. Voor stap 2.2, moet het aantal gecreëerde gaten komen overeen met de patch nummer (een gat voor de eerste patch, twee gaten voor de tweede, etc.). </li><li> Zodra cellen zijn bekleed voor elke patch, parafilm de plaat en incubeer bij 30 ° C gedurende ongeveer 2 uur. </li><li> Herhaal stap 2.1-2.6 voor elke plaat in het experiment. </li></ol> Deel 3: Zorg voor maagdelijke dochter cellen voor de levensduur analyse In deze paragraaf initiëren we de levensduur analyse door ervoor te zorgen dat elke cel begint als een maagdelijke dochtercel. <ol><li> Verwijder de platen uit de couveuse en controleer dat de meeste gekleed cellen hebben een celdeling ondergaan. Als er extra tijd nodig is om de celdeling in te vullen, gaat u terug de plaat naar de incubator. </li><li> Beginnen met de eerste gekleed cel, gebruik de naald dochter cellen van de moeder cel losmaken door voorzichtig het plaatsen van de naald op de top van de bijgevoegde cellen. Het is soms handig aan de zijkant van de microscoop basis kraan, terwijl de naald rust op de cellen. </li><li> Plaats de vrijstaande dochter cel in de verticale lijn, ter vervanging van de moeder cel en eventuele bijkomende dochter cellen en ze te verplaatsen tijdelijk opzij. </li><li> Herhaal stap 3.2 en 3.3 voor elk van de array cellen. Als een cel niet verdelen, neem een ​​dochter cel van een van de redundante cellen gepositioneerd in stap 2.3. Wanneer u klaar bent, moet je 20 dochter van cellen voor elke patch verticaal uitgelijnd op de levensduur plaat. </li><li> Verzamel alle van de moeder cellen en extra dochter cellen in een stapel en weer terug over te brengen naar een gebied in de buurt van de patches (&quot;het kerkhof&quot;). Het is belangrijk om ongewenste cellen te houden ver van de cellen die levensduur analyse tot de vorming van microkolonies en de uitputting van de lokale voedingsstoffen te voorkomen. </li><li> Parafilm de plaat en incubeer bij 30 ° C gedurende ongeveer 2 uur. </li><li> Herhaal stap 3.2-3.6 voor elke plaat in het experiment. </li></ol> Deel 4: Het meten van de replicatieve capaciteit van de individuele cellen <ol><li> Bereid de levensduur data sheets. Een levensduur data sheet kan een eenvoudige raster waarbij elke rij correspondeert met een individuele moeder cel en elke kolom komt overeen met een leeftijd-punt (figuur 2). Label elke data sheet op basis van het aantal stammen te analyseren. </li><li> Verwijder de platen uit de couveuse en controleer dat de meeste gekleed cellen hebben ten minste een celdeling ondergaan. Als er extra tijd nodig is om de celdeling in te vullen, gaat u terug de plaat naar de incubator. </li><li> Beginnen met de eerste geschaard cel op de eerste plaat, visueel waarnemen van de moeder en dochter cel (len) en bepalen van het aantal celdelingen die zich hebben voorgedaan. Het is over het algemeen makkelijk om te bepalen hoeveel dochter-cellen een moeder heeft, op basis van karakteristieke patronen van cel regelingen. Noteer het nummer van de dochter van cellen die door de moeder cel in het juiste vakje op de levensduur scoreblad. </li><li> Gebruik de naald dochter cellen los te maken van de moeder cel zoals beschreven in stap 3.2. </li><li> Behoud van de moeder cel in haar positie in de verticale lijn en zet de dochter cel (len) om tijdelijk opzij. </li><li> Herhaal stap 4.3-4.5 voor elk van de array cellen. </li><li> Verzamel alle van de afgedankte dochter cellen en verplaats ze naar het &#39;kerkhof&#39;, gelegen in de buurt van de oorspronkelijke patches. </li><li> Parafilm de plaat en incubeer bij 30 ° C gedurende 2-3 uur. </li><li> Herhaal stap 4,3-4,8 voor elke plaat in het experiment. </li><li> Herhaal de stappen totdat alle 4,2-4,9 moeder cellen zijn gestopt te delen. Als de moeder cellen leeftijd, de voortgang van de celcyclus wordt langzamer en zal het wenselijk zijn om de plaat voor langere tijd tussen leeftijd-punten broeden. Platen kunnen worden geplaatst bij 4 ° C gedurende de nacht. </li></ol> Deel 5: Vertegenwoordiger resultaten. De ruwe gegevens die door een replicatie levensduur experiment is een lijst met nummers die overeenkomen met dochter cellen die door elke moeder cel op elke leeftijd-punt (figuur 2). Door optelling van elke rij van het scoreformulier, is de replicatieve levensduur voor elke moeder cel verkregen. Gegevens voor moeder cellen van dezelfde experimentele groep kan worden samengevoegd tot een survival curve (figuur 3A) te genereren en om statistische berekeningen, zoals de gemiddelde levensduur, de mediaan levensduur, en de standaarddeviatie uit te voeren. Een niet-parametrische test, zoals de Wilcoxon Rank-Sum test kan worden uitgevoerd om te bepalen of er significante verschillen in levensduur werden ontdekt tussen de experimentele groepen. Wanneer het experiment correct werkt, moet het voortbestaan ​​curve worden ruwweg in overeenstemming met Gompertz-Makeham kinetiek met een sigmoïdale shap met een lage vroege sterfte volgde op een relatief snelle daling van de overleving en een afvlakking van de curve een latere eeuwen. De meeste wild-type stammen hebben replicatieve levensduur waarden in de 20-30 range generatie, hoewel variatie buiten dit bereik is gemeld. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig1.jpg" alt="figuur 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1209/fig1.2.jpg" alt="Figuur 1.5" /> Figuur 1. Diagram van een typische replicatieve levensduur plaat. De avond voor het begin microdissectie van gistcellen, dat 3-5 stammen licht gepatcht op het oppervlak van een YEPD plaat (rode vakjes) in een verticale lijn langs de ene kant van de plaat. Na de groei van &#39;s nachts, zijn ongeveer 30 individuele cellen uit elke stam verticaal gekleed in een regel met 20 posities. Levensduur analysis zullen worden uitgevoerd op v maagdelijke dochter cellen verkregen uit deze eerste cellen. Extra cellen verkregen uit microdissectie tijdens het experiment (bijv. ongewenste dochter cellen) zijn geplaatst in &quot;het kerkhof&quot; (grijze ovaal), dat is ver weg van de experimentele cellen zich in om lokale uitputting van voedingsstoffen als kolonies gevormd worden voorkomen. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig3.jpg" alt="figuur 2" /> Figuur 2. Een replicatieve levensduur tally vel. Ruwe data van een replicatie levensduur experiment wordt getoond. Elke rij komt overeen met een enkele gist moeder cel en elke kolom komt overeen met een leeftijd-punt. Het getal dat in elk vak is het aantal van de dochter van cellen die door die moeder cel op die leeftijd-punt. Elke stam is voorzien van een gecodeerde nummer, dat het individu het ontleden van de gistcellen geen kennis van de identiteit van de stammen wordt geanalyseerd heeft. Twintig cellen zijn getest op elke stam. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig2.jpg" alt="figuur 3" /> Figuur 3. Vertegenwoordiger van de overleving en de groei curves van een replicatie levensduur experiment. (A) Survival curves worden verkregen door het plotten van de fractie van de moeder van cellen nog in leven als een functie van de replicatie leeftijd (aantal celdelingen. (B) groeicurves worden verkregen door het uitzetten van de gemiddelde aantal van de dochter van cellen die door een bepaalde stam als een functie van de leeftijd-punt. In dit voorbeeld, de stam # 2 is een langer leven, maar is langzamer groeit, zoals blijkt uit de verminderde begin van de helling van de groei plot.

<ol><li>Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+yeast+aging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Recent developments in yeast aging.</a> PLoS Genet. 3, (2007).</li>
<li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaeberlein%2C+M+%22Handbook+of+models+for+human+aging%22">Handbook of models for human aging</a>. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109-120 (2006).</li>
<li>Smith, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evidence+for+conserved+longevity+pathways+between+divergent+eukaryotic+species%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative evidence for conserved longevity pathways between divergent eukaryotic species.</a> Genome Res. 18, 564-570 (2008).</li>
<li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+aging+in+yeast%3A+the+means+to+the+end%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29-54 (2008).</li>
<li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63, 113-121 (2008).</li>
<li>Jiang, J. C., Jaruga, E., Repnevskaya, M. V., Jazwinski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intervention+resembling+caloric+restriction+prolongs+life+span+and+retards+aging+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">An intervention resembling caloric restriction prolongs life span and retards aging in yeast.</a> Faseb J. 14, 2135-2137 (2000).</li>
<li>Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sir2-independent+life+span+extension+by+calorie+restriction+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Sir2-independent life span extension by calorie restriction in yeast.</a> PLoS Biol. 2, E296-E296 (2004).</li>
<li>Lin, S. J., Defossez, P. A., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+NAD+and+SIR2+for+life-span+extension+by+calorie+restriction+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of NAD and SIR2 for life-span extension by calorie restriction in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 289, 2126-2128 (2000).</li>
<li>Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+in+yeast+of+conserved+ageing+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes.</a> Mech Ageing Dev. 126, 17-21 (2005).</li>
<li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+yeast+replicative+life+span+by+TOR+and+Sch9+in+response+to+nutrients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of yeast replicative life span by TOR and Sch9 in response to nutrients.</a> Science. 310, 1193-1196 (2005).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0 (214530)</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Peptone</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0 (211677)</td><td></td></tr><tr><td>Gistextract</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0886-17-0 (288620)</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

het meten van replicatieve levensduur in de gist

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Veroudering is een degeneratieve proces wordt gekenmerkt door een progressieve verslechtering van de cellulaire componenten en organellen resulterend in sterfte. De gist<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Is uitgebreid gebruikt om de biologie van het ouder worden bestuderen, en een aantal determinanten van gist levensduur is aangetoond dat ze worden bewaard in meercellige eukaryoten, zoals wormen, vliegen en muizen<sup&gt; 1</sup&gt;. Vanwege het gebrek aan gemakkelijk gekwantificeerd leeftijd-geassocieerde fenotypes, de vergrijzing in gist is bijna uitsluitend getest door het meten van de levensduur van cellen in verschillende contexten, met twee verschillende levensduur paradigma&#39;s in het gemeenschappelijk gebruik<sup&gt; 2</sup&gt;. Chronologische levensduur verwijst naar de lengte van de tijd dat een moeder cel kan overleven in een niet-delende, rust-achtige toestand, en is voorgesteld om te dienen als een model voor de veroudering van post-mitotische cellen in meercellige eukaryoten. Replicatieve levensduur, daarentegen, verwijst het aantal van de dochter van cellen die door een moeder cel voorafgaand aan senescentie, en wordt beschouwd als een model van het ouder worden in mitotisch actieve cellen. Hier presenteren wij een algemeen protocol voor het meten van de replicatieve levensduur van gist moeder cellen. Het doel van de replicatieve levensduur test is om te bepalen hoe vaak elke moeder cel knoppen. De moeder en dochter cellen kunnen gemakkelijk worden onderscheiden door een ervaren onderzoeker met behulp van een standaard lichtmicroscoop (totale vergroting 160X), zoals de Zeiss Axioscope 40 of een ander vergelijkbaar model. Fysieke scheiding van de dochter van cellen van de moeder van cellen is bereikt met behulp van een handleiding micromanipulator is uitgerust met een glasvezel-naald. Typische laboratorium gist stammen produceren 20-30 dochter cellen per moeder en een levensduur experiment vergt 2-3 weken.

In dit artikel geven we een algemeen protocol voor het meten van de replicatieve levensduur van gist moeder cellen.

Het meten van replicatieve levensduur in de gist

Veroudering is een degeneratief proces dat wordt gekenmerkt door een progressieve verslechtering van cellulaire componenten en organellen, wat uiteindelijk leidt tot mortaliteit. De knop...

De buddinggist Croce Visi is uitgebreid gebruikt om de biologie van veroudering te bestuderen. In dit artikel presenteren we een algemeen protocol voor het meten van de replicatieve levensduur van gistmoedercellen. Hallo, ik ben Kristen Steffen van het laboratorium van Brian Kennedy van de afdeling Biochemie aan de University of Washington.Vandaag laten we u een procedure zien voor het meten van de replicatieve levensduur van gistmoedercellen. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om genen te bestuderen die de levensduur van gistcellen beïnvloeden. Laten we beginnen.Voor het experiment naar de replicatieve levensduur en de voorbereiding van gistcellen voor de levensduuranalyse moeten vaste YEPD-platen worden klaargemaakt. Gebruik de juiste steriele techniek om deze YEPD-agarplaten te bereiden. Bereid ten minste twee platen voor elke vier tot vijf stammen die in het levensduurexperiment worden geanalyseerd.Deze platen moeten ten minste twee dagen voor het levensduurexperiment worden bereid en voor het begin van de levensduurassay volledig zijn opgedroogd. Als het experiment niet binnen vier tot vijf dagen na het gieten van de platen plaatsvindt, moeten ze worden omwikkeld met parafilm of plastic en in een gekoelde incubator worden geplaatst om uitdroging te voorkomen. Haal de giststammen uit de bevroren voorraden en ent ze uit voor enkelvoudige kolonies.Op de YEPD-agarplaten. Tot zes stammen kunnen eenvoudig op dezelfde YEPD-plaat worden uitgestreken door de plaat te verdelen in gelijkmatig grote taartpunten. Incubeer de cellen gedurende twee dagen bij 30 °C.Haal na incubatie de cellen uit de incubator en zaai cellen van een enkele kolonie over op een verse YEPD-plaat. Op dit moment moeten de te analyseren stammen worden gecodeerd om te garanderen dat het experiment naar de replicatieve levensduur blind wordt uitgevoerd, waarbij de personen die de dissecties uitvoeren de identiteit van de individuele stammen niet kennen.Incubeer vervolgens de gepatchte gecoate cellen bij 30 °C tot de volgende avond. Neem de cellen weg en patch vanuit elke gecoate stam lichtjes cellen naar nieuwe YEPD-platen. Deze zullen dienen als de experimentele platen die worden gebruikt voor de replicatieve levensduur.Analysecellen moeten langs een verticale lijn aan de linkerkant van de YEPD-plaat worden aangebracht. Breng niet te veel cellen over naar één enkele verse YEPD-plaat. Aangezien dit zal leiden tot een dikke groei van de cellen tijdens de incubatie gedurende de nacht en hun replicatieve levensduur zal beïnvloeden, is ongeveer drie tot vijf patches per plaat optimaal.Uitgaande van het feit dat de replicatieve levensduuranalyse zal worden uitgevoerd op 20 cellen per patch, is het levensduurexperiment nu volledig opgezet en is het enige wat nog moet gebeuren het overnacht incuberen op het aanrecht. Morgen kunnen we vervolgens beginnen met de microdissectie om de gistcellen op de plaat te positioneren en maagdochtercellen te verkrijgen voor de replicatieve levensduuranalyse.Gebruik een microscoop die is uitgerust met een microdissectie-apparaat dat geschikt is voor gist. Draag ongeveer 50 cellen van de eerste patch-stam over naar een positie op de plaat die ver verwijderd is van de gepatchte cellen. Als uw microscooptafel is gegradeerd, kunnen deze gradaties worden gebruikt om ervoor te zorgen dat de cellen tijdens volgende iteraties gemakkelijk te vinden zijn.Soms kunnen cellen in de naald vast komen te zitten, wat problematisch kan zijn als ze op het verkeerde moment vrijkomen. Om er zeker van te zijn dat de naald schoon en vrij van cellen is, tikt u deze herhaaldelijk tegen het agar-oppervlak. Maak vervolgens een gaatje in de agar door de naald met kracht door het agar-oppervlak te duwen.Dit gat dient als markering om u te oriënteren op de plaat tijdens opeenvolgende iteraties van dissectie en het verwijderen van dottercellen. Zorg ervoor dat er geen gistcellen in het gat terechtkomen, anders zullen deze groeien en een kolonie vormen direct boven het gat. Plaats individuele gistcellen verticaal uitgelijnd in 20 gelijkmatig verdeelde posities, met één tot drie naaldiameters tussen elke celpositie.Plaats voor elke paar cellen twee cellen naast elkaar op dezelfde positie in de lijn in plaats van één. Dit maakt redundantie mogelijk tijdens de selectie van maagdelijke dochtercellen. Als een van de overgeplaatste cellen niet divideert tussen de 10e en 11e positie in de lijn, maak dan een horizontale reeks van zeven tot acht gaatjes in de agar.Dit dient als markering om u te oriënteren op de plaat tijdens opeenvolgende dissecties en het verwijderen van dochtercellen. Wees opnieuw voorzichtig dat er geen gistcellen in de gaatjes terechtkomen, anders zullen deze groeien en een kolonie vormen. Herhaal deze procedure voor elk vlak op de plaat en blijf de cellen verticaal langs dezelfde as ordenen.Het is belangrijk om bij het maken van het gat in het AER erop te letten dat het aantal gaten overeenkomt met het patchnummer, zodat er één gat is voor de eerste patch en twee gaten voor de tweede. Zodra de cellen voor elke patch zijn opgesteld, dient de plaat geparaformeerd te worden en ongeveer twee uur te worden geïncubeerd bij 30 °C. Onthoud dat vanaf dit punt alle platen met Parafilm moeten worden afgedekt, behalve tijdens de dissectie.Om uitdroging te voorkomen, wordt deze procedure voor elke plaat herhaald. In het experiment. Voor de analyse van de levensduur is het belangrijk om er zeker van te zijn dat elke cel start als een maagdelijke dochtercel.Haal hiervoor eerst de platen uit de incubator en controleer of de meeste cellen in de array een celdeling hebben ondergaan. Wat we hier hebben, zijn cellen die eerder zijn uitgelijnd, en u kunt zien dat ze na twee uur in de incubator zijn begonnen met delen. We hebben nu een moedercel, de grotere cel die verbonden is met het lichaam, en de nieuwe dochtercel; deze dochtercel is de cel die zal worden gebruikt om de levensduurmeting te starten.Als er extra tijd nodig is om de celdelingen te laten voltooien, plaats de plaat dan terug in de incubator. Begin bij de eerste cel van de array. Gebruik de naald om dochtercellen van de moedercel te scheiden door de naald voorzichtig op de aanhechtende cellen te plaatsen.Het kan soms nuttig zijn om tegen de zijkant van de microscoopvoet te tikken terwijl de naald op de cellen rust. Plaats vervolgens de losgekoppelde dochtercel in de verticale lijn van cellen ter vervanging van de moedercel en eventuele extra dochtercellen, en schuif deze tijdelijk opzij. Herhaal deze stappen voor elke cel in het array.Als een cel zich niet splitst, neem dan een dochtercel van een van de redundante cellen die naast de testcel zijn geplaatst. Na voltooiing moet u 20 dochtercellen hebben voor elke verticaal uitgelijnde patch op de levensduurplaat. Verzamel alle moedercellen en extra dochtercellen in een groep en breng ze terug naar een gebied nabij de patches, het zogenaamde kerkhof.Het is belangrijk om ongewenste cellen ver weg te houden van de cellen die ondergaan van levensduuranalyse om de vorming van microkolonies en de uitputting van lokale voedingsstoffen te voorkomen. Zodra de cellen zijn gescheiden, worden ze van de plaat verwijderd en ongeveer twee uur geïncubeerd bij 30 °C. Herhaal deze stappen voor elke plaat in het experiment.Om de replicatieve capaciteit van individuele cellen te meten, moet u levensduur-gegevensbladen voorbereiden. Een levensduur-gegevensblad kan een eenvoudig raster zijn waarbij elke rij overeenkomt met een individuele moedercel en elke kolom met een tijdstip in de levensduur. Zorg ervoor dat elk gegevensblad wordt gelabeld op basis van het aantal stammen dat wordt geanalyseerd.Begin hiermee door de platen uit de incubator te halen en te controleren of de meeste cellen in de array ten minste één celdeling hebben ondergaan. Als er extra tijd nodig is om de celdeling te voltooien, plaats de plaat dan terug in de incubator. Begin bij de eerste arraycel op de eerste plaat en observeer visueel de moedercel en de dochtercel(len) om het aantal celdelingen te bepalen dat heeft plaatsgevonden.Het is over het algemeen eenvoudig vast te stellen hoeveel dochtercellen een moedercel heeft geproduceerd op basis van karakteristieke patronen in de celarrangementen. Bij deze is het zeer eenvoudig te zien hoeveel cellen er zijn geproduceerd, omdat er twee aanwezig zijn die dezelfde grootte hebben en beide kleiner zijn dan de moedercel. Noteer het aantal door de moedercel geproduceerde dochtercellen in het juiste vak op het scoreblad voor de levensduur.Gebruik vervolgens de naald om de dochtercellen los te maken van de moedercel, zoals eerder beschreven, door de naald voorzichtig op de aanhechtende cellen te plaatsen en tegen de zijkant van de microscoopvoet te tikken terwijl de naald op de cellen rust. Houd de moedercel op zijn positie in de verticale lijn en verplaats de dochtercel of dochtercellen tijdelijk opzij. Herhaal deze stappen voor elke cel in de array.Verzamel tot slot alle weggegooide dochtercellen en verplaats deze naar de 'graveyard' vlakbij de oorspronkelijke patches. Verslind de plaat met Parafilm en incubeer deze bij 30 °C gedurende twee tot drie uur. Herhaal het weggooien van dochtercellen en de incubatie.Stap voor elke plaat in het experiment. Herhaal deze volledige procedure totdat alle moedercellen zijn gestopt met delen. Houd er rekening mee dat naarmate de moedercellen ouder worden, de voortgang van de celcyclus vertraagt en het wenselijk zal zijn om de plaat tussen de leeftijdspunten door gedurende langere perioden te incuberen; daarna kunnen de platen gedurende de nacht bij vier graden Celsius worden bewaard.De ruwe gegevens die voortvloeien uit een experiment naar de replicatieve levensduur bestaan uit een lijst met getallen die overeenkomen met de dochtercellen die door elke moedercel op elk tijdstip van de leeftijd zijn geproduceerd, zoals hier te zien is. Door elke rij van het scoreblad op te tellen, wordt de replicatieve levensduur voor elke moedercel verkregen.Gegevens van andere cellen uit dezelfde experimentele groep kunnen worden samengevoegd om een overlevingscurve te genereren en statistische berekeningen uit te voeren. De curve moet globaal consistent zijn met de Gompertz-kinetiek, waarbij een sigmoïdale vorm zichtbaar is met een lage vroege mortaliteit, gevolgd door een relatief snelle daling in de overleving en een afvlakking van de curve op latere leeftijden. We hebben zojuist laten zien hoe u een experiment naar de replicatieve levensduur van gist uitvoert.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de cellen zich blijven delen zodra ze niet in de kou staan. Vergeet daarom niet de plaatjes een nacht bij vier graden te bewaren, zodat u 's ochtends niet geconfronteerd wordt met te veel dochtercellen om te tellen. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

measuring-replicative-life-span-in-the-budding-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In dit artikel geven we een algemeen protocol voor het meten van de levensduur van nematoden gehouden op vaste media met UV-gedode bacteriën voedsel.

Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur over Solid Media

Chronologische veroudering in gist verwijst naar het verlies van cel levensvatbaarheid geassocieerd met de tijd in de stationaire fase. Hier beschrijven we een high-throughput methode voor het kwantitatief bepalen van gist chronologische levensduur.

Kwantificeren van Gist Chronologisch Life Span door uitgroei van Aged cellen

In dit protocol presenteren we een methode om te...

Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur in 96 Well microtiterplaten

Hier beschrijven we een set van DNA-mutatie assays die kunnen worden gecombineerd met de gist chronologische levensduur model om de genen / paden die reguleren of bijdragen aan de genomische DNA instabiliteit tijdens Aging Study.

Studeren Age-afhankelijke genomische instabiliteit met behulp van de S. cerevisiae Chronologische levensduur Model

Deze video beschrijft een traditionele, op platen gebaseerde methode om de levensduur van C. elegans te meten. Het voorbeeldprotocol meet de levensduur van wormen die met RNAi worden behandeld.

Levensduuranalyse: Het meten van de levensduur van C. elegans

We beschrijven hier de werking van een microfluïdische apparaat dat continue en hoge-resolutie microscopische beeldvorming van enkele ontluikende gistcellen kunnen gedurende hun volledige replicatie en / of chronologische levensduur.

Continue hoge-resolutie Microscopische waarneming van Replicatieve Aging in Budding gist

Dit artikel een protocol geoptimaliseerd voor het vervaardigen van microfluïdische chips en de opstelling van microfluïdische experimenten om de levensduur en cellulaire fenotypen van afzonderlijke gistcellen te meten.

Met behulp van microfluïdische apparaten te meten Levensduur en Cellulaire Phenotypes in Single Budding gistcellen

Hier beschrijven we de replicaset methode, een benadering tot kwantitatief maatregel C. elegans levensduur/overleving en de healthspan in een high-throughput en robuuste manier, waardoor screening van vele voorwaarden zonder in te boeten op kwaliteit van de gegevens. Dit protocol details van de strategie en biedt een software-instrument voor de analyse van gegevens van de replicaset.

De Replica Set, methode: Een High-throughput benadering van kwantitatief maatregel Caenorhabditis elegans levensduur

Hier is een protocol om genetische interacties te identificeren door middel van een verhoogde kopie nummer suppressor scherm in Saccharomyces cerevisiae. Deze methode stelt onderzoekers in staat om te identificeren, klonen, en testen suppressors in kortstondige gist mutanten. We testen het effect van de toename van het kopieeraantal van SIR2 op de levensduur in een autofagie null mutant.

Een suppressor scherm voor de karakterisering van genetische links reguleren chronologische levensduur in Saccharomyces cerevisiae

We beschrijven twee complementaire protocollen om de S-faseduur in S. cerevisiae nauwkeurig te bepalen met behulp van EdU, een thymidine-analoog, dat in vivo is opgenomen en gedetecteerd met behulp van Click-chemie door microscopie en flowcytometrie. Het zorgt voor de eenvoudige karakterisering van de duur van DNA-replicatie en over het hoofd geziene replicatiedefecten in mutanten.

Bepaling van de S-faseduur met behulp van 5-ethynyl-2'-deoxyuridine-opname in Saccharomyces cerevisiae

Leer de replicatieve levensduur meten in Saccharomyces cerevisiae moedercellen. Dit protocol helpt onderzoekers genetische factoren te identificeren die de celveroudering beïnvloeden.

Het meten van replicatieve levensduur in de gist

Meer video's verkennen