Het meten van replicatieve levensduur in de gist

De ontluikende gist Croce Visi is uitgebreid gebruikt om de biologie van veroudering te bestuderen. In dit artikel presenteren we een algemeen protocol voor het meten van de replicatieve levensduur van moedergistcellen. Hallo, ik ben Kristen Steffen van het laboratorium van Brian Kennedy in het Departement Biochemie aan de Universiteit van Washington.

Vandaag laten we u een procedure zien voor het meten van de replicatieve levensduur van moedergistcellen. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om genen te bestuderen die de levensduur van gistcellen beïnvloeden. Dus laten we beginnen.

Voor het experiment met de replicatieve levensduur en de voorbereiding van gistcellen voor de levensduuranalyse, moeten vaste YEPD-platen worden bereid om dit te doen. Gebruik een geschikte steriele techniek om deze YEPD-agarplaten te bereiden. Bereid ten minste twee platen voor voor elke vier tot vijf stammen die in het levensduurexperiment moeten worden geanalyseerd.

Deze platen moeten ten minste twee dagen voor het levensduurexperiment worden bereid en mogen drogen voordat het levensduurtest begint. Als het experiment niet binnen vier tot vijf dagen na het gieten van de platen plaatsvindt, moeten ze worden ingepakt in parafilm of plastic en in een gekoelde incubator worden geplaatst om uitdroging te voorkomen. Verwijder de giststammen uit de bevroren voorraden en streek ze uit voor enkele kolonies.

Op de YEPD-agarplaten. Tot zes stammen kunnen gemakkelijk op dezelfde YEPD-plaat worden gestreken door de plaat in gelijke stukken in taartvorm te verdelen. Incubeer de cellen gedurende twee dagen op 30 graden Celsius.

Na incubatie verwijdert u de cellen uit de incubator en zet u cellen van een enkele kolonie op een verse YEPD-plaat. Op dit moment moeten de te analyseren stammen worden gecoat om ervoor te zorgen dat het experiment met de replicatieve levensduur blind wordt uitgevoerd. Waar de dissectors de identiteit van individuele stammen niet kennen. Ketens.

Vervolgens incubeer de bewerkte gecoate cellen op 30 graden Celsius tot de volgende avond. Verwijder de cellen en zet lichtjes cellen van elke gecoate stam op verse YEPD-platen. Deze zullen dienen als de experimentele platen die worden gebruikt voor de replicatieve levensduur.

Analysecellen moeten langs een verticale lijn aan de linkerkant van de YEPD-plaat worden geplaatst. Breng niet te veel cellen over op een enkele verse YEPD-plaat. Aangezien dit zal zorgen voor een dikke groei van de cellen tijdens de overnachtelijke incubatie en hun replicatieve levensduur zal beïnvloeden, is ongeveer drie tot vijf patches per plaat optimaal.

Ervan uitgaande dat de analyse van de replicatieve levensduur zal worden uitgevoerd op 20 cellen van elke patch, Nu is het levensduurexperiment allemaal opgezet en alles wat ze hoeven te doen is overnacht op het werkblad incuberen. En dan kunnen we morgen beginnen met de microdissectie Om de gistcellen op de plaat te positioneren en maagddochtercellen te verkrijgen. Voor replicatieve levensduuranalyse.

Gebruik een microscoop uitgerust met een microdissectie-apparaat dat geschikt is voor gist. Breng ongeveer 50 cellen over van de eerste patchstam naar een positie op de plaat die distaal is van de gepatchte cellen. Als uw microscooptafel is gegradeerd, kunnen deze gradationen worden gebruikt om ervoor te zorgen dat de cellen gemakkelijk te vinden zijn tijdens de volgende iteraties.

Soms kunnen cellen vast komen te zitten in de naald, wat een probleem kan zijn als ze op het verkeerde moment uitkomen. Om er zeker van te zijn dat de naald schoon is en vrij van cellen, raakt u deze herhaaldelijk aan het agaroppervlak. Maak vervolgens een gat in de agar door de naald door het agaroppervlak te forceren.

Dit gat zal dienen als een marker om u op de plaat te oriënteren tijdens de volgende iteraties van dissectie en dottercelverwijdering. Wees voorzichtig om geen gistcellen in het gat te krijgen, anders zullen ze groeien en een kolonie vormen direct boven het gat. Verticaal uitgelijnde individuele gistcellen in 20 gelijkmatig verdeelde posities met één tot drie naaldameters tussen elke celpositie.

Plaats voor elke paar cellen twee cellen naast elkaar op dezelfde positie in de lijn in plaats van een. Dit zorgt voor redundantie tijdens de selectie van maagddochtercellen. Als een van de overgedragen cellen niet deelt tussen de 10e en 11e posities in de lijn, maak dan een horizontale reeks van zeven tot acht gaten in de agar.

Dit zal dienen als een marker om u op de plaat te oriënteren tijdens de volgende dissecties en dottercelverwijderingen. Wees opnieuw voorzichtig om geen gistcellen in de gaten te krijgen, anders zullen ze groeien en een kolonie vormen. Herhaal deze procedure voor elke patch op de plaat, blijf de cellen verticaal langs dezelfde as plaatsen.

Het is belangrijk om te onthouden dat bij het maken van het gat in de AER, het aantal gemaakte gaten moet overeenkomen met het patchnummer, zodat er één gat is voor de eerste patch en twee gaten voor de tweede. Zodra de cellen voor elke patch zijn gerangschikt, paraform de plaat en incubeer op 30 graden Celsius gedurende ongeveer twee uur. Onthoud, vanaf dit punt moeten alle platen worden geparafilmd, behalve wanneer ze worden gedissected.

Om uitdroging te voorkomen, herhaal deze procedure voor elke plaat. In het experiment. Voor de levensduuranalyse is het belangrijk om ervoor te zorgen dat elke cel begint als een maagddochtercel.

Om dit te doen, verwijdert u eerst de platen uit de incubator en controleert u of de meeste van de arraycellen een celdeling hebben ondergaan. Dus wat we hier hebben, zijn cellen die eerder zijn uitgelijnd, en je kunt zien dat ze na twee uur in de incubator zijn begonnen te delen. En nu hebben we een moedercel, de grotere die aan zijn lichaam is gehecht, de maagddochtercel, en die maagddochtercel is een cel die zal worden gebruikt om de levensduur te beginnen.

Als er extra tijd nodig is om celdelingen te laten voltooien, plaatst u de plaat terug in de incubator. Begin met de eerste arraycel. Gebruik de na