Name: TL-etikettering van Drosophila Hart Structuren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-13T23:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Leer fluorescente labeltechnieken voor hartstructuren in larven en volwassen Drosophila melanogaster. Deze methode maakt gedetailleerde morfologische analyse mogelijk via confocale microscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken SI Bernstein (San Diego State University) voor het kritisch lezen en nuttige suggesties met betrekking tot de voorbereiding van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door NIH beurzen aan SI Bernstein, SDSU, en R. Bodmer, BIMR en door een post-doctorale beurs uit de Westerse staten Partner van de American Heart Association aan G. Vogler en A. Cammarato.

Voordat u begint <ol><li> Bereid de volgende oplossingen: <ol class="lalpha"><li> ontspannende buffer (kunstmatige Drosophila hemolymfe (ADH) (zie &quot;Het visualiseren van het kloppende hart in Drosophila&quot;), die 10 mM EGTA bevat) </li><li> fixatief (4% formaldehyde in 1x PBS) </li><li> PBSTx (PBS met 0,1% Triton-X-100) </li><li> Juiste wijze verdund primaire en soortspecifieke fluorescent gelabelde secundaire antilichamen in PBSTx </li></ol></li><li> Ontleden Drosophila om de cardiale buizen (van volwassen vliegen en / of larven) bloot volgende <ol class="lalpha"><li> de semi-intacte Drosophila hart voorbereiding protocol in &quot;Het visualiseren van het kloppende hart in Drosophila&quot;, of </li><li> Drosophila larven NMJ Dissection protocol 1 met de volgende wijzigingen: Gebruik zuurstofrijk ADH tijdens het larvale dissectie en iets verdringen de achterste pin uit de ventrale middellijn. Larven zijn afgesneden langs de ventrale middellijn. Verwijder geen weefsel voorafgaand aan de fixatie. </li></ol></li></ol> Fluorescerende kleuring <ol><li> Controleer of alle harten zijn ritmisch kloppende in zuurstof ADH. Snel vervangen door ADH met ontspannende buffer. Onderzoek elke cardiale buis om ervoor te zorgen weeën worden geremd. </li><li> Bevestig de harten door het vervangen van de ontspannende buffer met een fixatief. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten onder zacht schudden. (Voor de bereiding larvale schudden is niet nodig bij elke stap, en kan worden gezien als schadelijk voor hartweefsel integriteit). </li><li> Was exemplaren drie keer tien minuten met PBSTx bij kamertemperatuur met voortdurende schudden. </li><li> Voor volwassenen, voorzichtig terugsnoeien van de ventrale randen van de buik cuticula zodanig dat wat er overblijft is meer elliptisch en minder afgerond. Bovendien, ervoor te zorgen dat een enkele cut tussen de buik en thorax, zorgvuldig en netjes gescheiden zowel lichaam segmenten en minimale schade aan het voorste deel van het hart. De larven harten, verwijder het vet lichaam met behulp van fijne pincet. Het vet verwijderen moet worden uitgevoerd met uiterste voorzichtigheid, omdat de larven hart is bijzonder kwetsbaar en heeft zeer weinig steun van andere spieren of bindweefsel. Verwijder niet de tracheale takken, dit kan de schade aan het hart. </li><li> Breng de bijgesneden dorsale gebied van de abdominale cuticula bij de randen, het vermijden van contact met het centraal gelegen hart-buis, in een 96 wells-plaat met putten die 50 tot 100 ul van de primaire antilichaam verdund in PBSTx bevatten. Plaats niet meer dan 12 exemplaren per well. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur met voortdurende agitatie. Incubatie kan ook &#39;s nachts worden gedaan op 4 ° C. </li><li> Verwijder de primaire antistof oplossing. Was de harten drie keer tien minuten met 100 ul PBSTx bij kamertemperatuur met voortdurende schudden. </li><li> Na verwijdering van de uiteindelijke wasbuffer, voeg 100 ul van secundaire antilichaam in PBSTx, aangevuld met Alexa594-phalloidin (1:1000). Incubeer gedurende een uur met een voortdurend schudden bij kamertemperatuur. Houden monsters afgedekt om te voorkomen fluorofoor bleken. </li><li> Volgende secundaire incubatie, was de harten drie keer tien minuten met 100 ul van PBSTx bij kamertemperatuur met voortdurende schudden. Houd de monsters bedekt de hele wasstappen. </li><li> Voor het verwijderen van Triton-X-100, spoel de harten een laatste keer in 100 ui PBS gedurende 10 minuten. De monsters kunnen worden opgeslagen in het donker bij 4 ° C gedurende enkele dagen voor de montage. </li></ol> Montage voor volwassenen Hearts <ol><li> Houden twee 18 x 18 mm dekglaasjes op een objectglaasje met 10 ul van Vectashield montage medium. De dekglaasjes moeten ~ 10-15 mm van elkaar worden uit elkaar geplaatst. Plaats een kleine derde druppel van montage medium in-tussen de twee dekglaasjes. </li><li> Plaats 20 ul van Vectashield in het centrum van een derde dekglaasje aan. </li><li> Verwijder voorzichtig elk van de harten van de PBS-wasoplossing door de uiterste randen van de nagelriem, en zachtjes leg ze hart-kant naar beneden op de daling van montage medium op de derde dekglaasje aan. Plaats niet meer dan vijf harten per druppel op het dekglaasje. </li><li> Controleer onder een microscoop om te zorgen dat alle harten naar beneden. </li><li> Voorzichtig omkeren dekglaasje met de harten en snel te plaatsen op de dia met de twee dekglaasjes zodanig dat de druppel met een hart-buizen zekeringen met de Vectashield druppel tussen het dekglaasje paar. Een &quot;brug&quot; dient te worden gevormd door de dekglaasjes. De harten zal worden geschorst tussen een dekglaasje en de microscoop dia. </li><li> Controleer onder een microscoop om ervoor te zorgen dat de harten zijn nu naar boven gericht. </li><li> Fix coverslips op hun randen met nagellak. </li><li> De harten zijn nu klaar om te worden afgebeeld via fluorescentie of confocale microscopie. </li></ol><ol><li> Plaats een druppel (~ 20 ul) Vectashield op een microscoopglaasje. </li><li> Zorgvuldig tot transfer naar twee larvale specimens in de Vectashield en oriënteren ze dorsale zijde naar beneden met behulp van wolfraam naalden. </li><li> Individueel Sleep de modellen van de montage medium en lijn elk in parallel. </li><li> Plaats een dekglaasje op de tegenover elkaar liggende zijden van het monster. Met behulp van een tang, een derde plaats dekglaasje op de top, eerst door het leggen van de ene kant op de achterste dekglaasje en het verlagen van het naar beneden aan de voorste dekglaasje en vormen zo een brug. Capillaire krachten zal leiden tot een stroom van Vectashield van posterior naar anterior, die een goede uitlijning van de larvale hart helpt. </li><li> Fix alle dekglaasjes op zijn plaats, op hun randen, met nagellak en zorgvuldig vullen de ruimte tussen de dekglaasjes met 20-30 ul Vectashield. </li><li> Afdichting met nagellak en bewaren bij 4 ° C, of ​​voor langdurige opslag bij -20 ° C. </li></ol> Representatieve resultaten Wanneer correct uitgevoerd, moeten alle onderdelen en de bijbehorende weefsels van het dorsale vat blijven intact en worden direct gevisualiseerd. De achtergrond fluorescentie moet minimaal zijn. Voor volwassenen is de ventrale longitudinale spierlaag vlekken zeer goed en levert een substantiële signaal (Figuur 1 en Figuur 2). De onderliggende ronde cardiomyocyten echter de neiging niet te produceren zo intens een signaal als dat van de bovenliggende ventrale laag. De myocyten van de voorste &quot;kegelvormige kamer &#39;van het volwassen hart bevatten een aanzienlijke hoeveelheid contractiele materiaal en, bijgevolg, deze regio verschijnt als de meest robuuste ten opzichte van de rest van de cardiale buis. De larvale hart toont een spiraalvormige myofibrillar regeling vergelijkbaar met die van de volwassen contractiele cardiomyocyten (figuur 3). <img src="/files/ftp_upload/1423/1423fig1atmb.jpg" alt="Figuur 1a" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1423/1423fig1btmb.jpg" border="0" alt="Figuur 1b" /> Figuur 1: Top. Een TL-microfoto met de hele cardiale buis van een volwassen Drosophila melanogaster dat myosine-GFP uitdrukt. Het beeld werd gemaakt met een Zeiss Imager Z1 fluorescentiemicroscoop uitgerust met een verschuifbare apotome module. Myosine-GFP is in het groen, actine wordt gekleurd met AlexaFluor ® 594 phalloidin (rood) en α-actinine is voorzien van anti-α-actinine antilichaam (blauw). Let op de voorbereidende procedure het mogelijk maakt om het hart monsters met goed bewaarde structuren. CC = kegelvormige kamer; AM = Alary spieren; V = interne ventiel; VLL = ventrale longitudinale spierlaag. Bottom. Een gebied van de volwassen hart los van de CC door de 3e buik segment van het hart net onder de ventrale longitudinale laag van de spiraalvormige myofibril rangschikking van de contractiele cardiomyocyten. Gelieve <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig1a.jpg">Klik hier</a> voor een grotere versie van figuur 1a, en <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig1b.jpg">hier</a> voor een grotere versie van figuur 1b <img border="0" src="/files/ftp_upload/1423/1423fig2tmb.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2: Vertegenwoordiger confocale stapels van een voorste deel van het volwassen hart gekleurd met AlexaFluor ® 594 phalloidin (rood) en een anti-Pericardin (collageen type IV) (groen) antilichaam. Pericardin wordt geassocieerd met het hart langs het ventrale oppervlak, waarschijnlijk afkomstig van de lengterichting georiënteerde myofibrillen van de ventrale spierlaag. Gelieve <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig2.jpg">Klik hier</a> voor een grotere versie van figuur 2. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1423/1423fig3tmb.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3: Een TL-microfoto van het segment A7 van het hart goed van een derde fase Drosophila larven. Het beeld werd gemaakt met een Zeiss Imager Z1 fluorescentiemicroscoop uitgerust met een verschuifbare apotome module. Actine is voorzien van AlexaFluor ® 594 phalloidin (groen) en α-actinine is gekleurd met anti-α-actinine antilichaam (rood). Gelieve <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig3.jpg">Klik hier</a> voor een grotere versie van figuur 3.

<ol><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Molina, M. R., Cripps, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ostia%2C+the+inflow+tracts+of+the+Drosophila+heart%2C+develop+from+a+genetically+distinct+subset+of+cardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells.</a> Mech Dev. 1, 51-59 (2001).</li>
<li>Dulcis, D., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+innervation+of+the+heart+initiates+retrograde+contractions+in+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic innervation of the heart initiates retrograde contractions in adult Drosophila melanogaster.</a> J Neurosci. 2, 271-280 (2005).</li>
<li>Zeitouni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+pathways+involved+in+adult+heart+formation+revealed+by+gene+expression+profiling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Signalling pathways involved in adult heart formation revealed by gene expression profiling in Drosophila.</a> PLoS Genet. 10, 1907-1921 (2007).</li>
<li>Robertson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%2C+including+an+accurately+timed+account+of+the+principal+morphological+change%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological change.</a> J. Morphol. 2, 351-399 (1936).</li>
<li>Miller, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+A+%22The+internal+anatomy+and+histology+of+the+imago+of+Drosophila+melanogaster%22">The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster</a>. , Wiley. New York. (1950).</li>
<li>Rizki, T. M. The circulatory system and associated cells and tissues. , Academic Press. New York. (1978).</li>
<li>Cammarato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+transducer+mutations+differentially+affect+motor+function%2C+myofibril+structure%2C+and+the+performance+of+skeletal+and+cardiac+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Myosin transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles.</a> Mol Biol Cell. 2, 553-562 (2008).</li>
<li>Taghli-Lamallem, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+deficiency+in+Drosophila+reduces+lifespan+and+causes+a+dilated+cardiomyopathy+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Dystrophin deficiency in Drosophila reduces lifespan and causes a dilated cardiomyopathy phenotype.</a> Aging Cell. 2, 237-249 (2008).</li>
<li>Kelso, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+database+documenting+a+GFP+protein-trap+insertion+screen+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster.</a> Nucleic Acids Res. 32, D418-D420 (2004).</li>
<li>Dietzl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 7150, 151-156 (2007).</li>
<li>Mery, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+muscle+LIM+protein%2C+Mlp84B%2C+is+essential+for+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila muscle LIM protein, Mlp84B, is essential for cardiac function.</a> J Exp Biol. 211, 15-23 (2008).</li>
</ol>

Hier presenteren wij een protocol nuttig voor het opstellen en kleuren van de Drosophila melanogaster dorsale vat en de omliggende weefsels voor imaging via fluorescentie of confocale microscopie. Wij bieden een beknopt verslag van de stappen verfijnd door en algemeen gebruikt in ons lab voor effectieve kleuren die goed opgelost vergunningen in situ beeldvorming van larven en volwassen Drosophila hart buizen. Anderen hebben soortgelijke methoden beschreven in verkorte vorm 2, 3, 4. ...

<table><tbody><tr><td>Ethyleenglycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-tetra-azijnzuur (EGTA)</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde, 10%, methanolvrij, Ultra Pure</td><td>Reagens</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;#174; 594 phalloïdine</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield&amp;#174; Montage-medium voor fluorescentie met DAPI</td><td>Reagens</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Wolfraampinnen</td><td>Reagens</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinhouder</td><td>Reagens</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td></td></tr></tbody></table>

tl-etikettering van drosophila hart structuren

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

De<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Dorsale vat, of hart, is een buisvormige structuur bestaat uit een enkele laag van contractiele cardiomyocyten, pericardiale cellen die lijn langs elke kant van de hartwand, ondersteunende Alary spieren en, bij volwassenen, een laag van ventrale longitudinale spiercellen. De contractiele vezels huis bewaarde onderdelen van de spier cytoarchitecture ook dicht op elkaar gepakte bundels van myofibrillen en het cytoskelet / submembranous eiwitcomplexen, die interageren met homologe componenten van de extracellulaire matrix. Hier beschrijven we een protocol voor de fixatie en de fluorescerende etikettering van bepaalde myocard elementen uit de harten van ontleed larven en semi-intacte volwassen<em&gt; Drosophila</em&gt;. In het bijzonder tonen we de etikettering van sarcomeer F-actine en van α-actinine in larvale harten. Daarnaast voeren we de etikettering van F-actine en α-actinine in myosine-GFP expressie volwassen vliegen en van α-actinine en pericardin, een type IV extracellulaire matrix van collageen, in het wild type volwassen harten. Bijzondere aandacht wordt gegeven aan een montage van de strategie voor de semi-intacte volwassen harten dat de behandeling minimaliseert en optimaliseert de mogelijkheden voor het behoud van de integriteit van de hart-buizen en de omliggende weefsels. Deze preparaten zijn geschikt voor de beeldvorming via fluorescentie en confocale microscopie. Het geheel genomen, deze procedure zorgt voor een zorgvuldige en gedetailleerde analyse van de structurele kenmerken van het hart van een krachtige genetisch soepel model systeem.

Hier beschrijven we een basisprotocol voor TL-etikettering van de verschillende elementen van het hart buizen van larven en volwassen<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;. Deze exemplaren zijn zeer geschikt voor imaging via fluorescentie of confocale microscopie. Deze techniek maakt gedetailleerde structurele analyse van de kenmerken van de harten van een krachtig model organisme.

TL-etikettering van Drosophila Hart Structuren

Het dorsale vat, of hart, van Drosophila melanogaster is een tubulaire structuur die bestaat uit een enkele laag samentrekkende cardiomyocyten, pericardiale cellen ...

Hoi, ik ben Nikita Ari van het laboratorium van Ralph Boer in het programma Development and Aging aan het Burnham Institute for Medical Research. Ik ben Gil, ook van hetzelfde laboratorium. Vandaag laten we u de procedures zien voor de fluorescente labeling van prenatale en volwassen Presolar hartstructuren.We gebruiken deze procedure in het laboratorium om de hartbuisjes voor te bereiden voor morfologische en structurele analyse via confocale of fluorescentiemicroscopie, om hartstructuren in volwassen drosophila fluorescentie te labelen. Maak eerst een enkele snede tussen de thorax en het abdomen in een semi-intact volwassen exemplaar om de lichaamssegmenten te scheiden. Trim daarna de overhangende ventrale randen van de volwassen cuticula.Transfer vervolgens volwassen of gedissekeerde larvale exemplaren en label deze met primaire en secundaire antilichamen. Monteer na het labelen de gewassen volwassen exemplaren door de randen van de cuticula vast te houden en ze met de hartzijde naar beneden op een druppel vector shield op een dekglas te plaatsen; keer het dekglas om op een druppel medium, geflankeerd door twee dekglazen op een objectglas, om een brug te vormen. De harten zijn nu rechtop opgehangen; voor het monteren van larvale harten.Breng de specimen over naar een objectglas met de ventrale zijden naar beneden en monteer twee dekglasjes aan weerszijden van het objectglas. Vorm tot slot een brug met een derde dekglasje door dit eerst op het dekglasje bij de posterieure uiteinden van de larven te plaatsen. De harten zijn nu gereed voor beeldvorming.Bereid vóór het starten van deze procedure de volgende A DH-relaxeerbuffer voor, die A DH bevat zoals beschreven in een ander videoprotocol in deze serie, met 10 millimolar EGTA-fixeermiddel bestaande uit 4% formaldehyde in één X-P-B-S-P-B-S, TX, en op passende wijze verdunde primaire antilichamen en fluorescentiegelabelde secundaire antilichamen. Dissekeer volwassen en larvale drosophila in PBS TX om de hartbuizen bloot te leggen, volgens de semi-intacte drosophila-hartpreparatie zoals getoond in de videoprotocollen voor het visualiseren van het kloppende hart in drosophila en het dissectieprotocol voor de drosophila-larvale NMJ. Gebruik echter met aanpassingen geoxygeneerde a DH tijdens de larvale dissectie en verschuif de posterieure pinnen iets van de ventrale middenlijn van de larve.Snijd langs de ventrale middenlijn. Verwijder geen weefsel vóór de fixatie in de volgende stappen. Begin de labelingsprocedure door onder een microscoop te controleren of alle harten ritmisch samentrekken en ontspannen in geoxygeneerde A DH. Vervang A DH vervolgens snel door relaxatiebuffer en onderzoek elke hartbuis opnieuw om te bevestigen dat de contracties zijn geremd.Ga verder met het fixeren van de harten door de relaxatiebuffer te vervangen door fixeerder. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur onder zacht schudden. Let op dat schudden bij larvale preparaties in geen enkele stap noodzakelijk is en zelfs nadelig kan zijn voor de integriteit van het hartweefsel.Verwijder na 20 minuten het fixeermiddel en was de specimens drie keer gedurende 10 minuten met P-B-S-T-X. Maak bij volwassen exemplaren bij kamertemperatuur en onder voortdurend schudden voorzichtig en nauwkeurig één snede tussen het abdomen en het thorax. Scheid beide lichaamssegmenten om minimale beschadiging aan het anterieure deel van het hart te garanderen.Zorg ervoor dat u niet in het anterieure abdominale gedeelte snijdt waar de conische kamer van het hart zich bevindt. Onderzoek het preparaat onder de microscoop om te controleren of er een schone snede is gemaakt. Trim vervolgens voorzichtig de overhangende ventrale randen van de abdominale cuticula weg, zodat het resterende deel meer elliptisch en minder rond is.Verwijder bij larvale harten met een fijne pincet voorzichtig het vetlichaam. Voer deze handeling met uiterste voorzichtigheid uit. Aangezien het larvale hart bijzonder fragiel is en zeer weinig steun krijgt van andere spieren of bindweefsel, mogen de tracheale takken niet worden verwijderd, omdat dit het hart kan beschadigen.Incubeer vervolgens met het primaire antilichaam, dat is verdund in PVS TX en in een volume van 50 µL per putje van een 96-wellsplaat wordt gedoseerd. Houd bij volwassen vliegen de getrimde dorsale cuticula bij de randen vast zonder de centraal gelegen hartbuis aan te raken en breng deze over naar de plaat. Plaats maximaal 12 exemplaren per putje en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur onder voortdurende agitatie.Houd de larvale specimens bij de rand vast met een pincet en breng ze over naar een putje gevuld met P-B-S-T-X. Schud de larvale specimens aan het einde van de incubatie niet. Verwijder de oplossing van het primaire antilichaam.Was de harten drie keer gedurende telkens 10 minuten met 100 µL P-B-S-T-X bij kamertemperatuur. Na de laatste wasbeurt worden de harten behandeld met 100 µL van het secundaire antilichaam in PBS tx aangevuld met Alexa 5 9 4 Phin. Houd de monsters vanaf dit moment afgedekt om bleken van de fluorofoor te voorkomen en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Verwijder de secundaire antilichaamoplossing en was de harten drie keer gedurende telkens 10 minuten met 100 µL P-B-S-T-X bij kamertemperatuur.Verwijder ten slotte het TRITTON X 100 door de harten 10 minuten lang te spoelen in 100 µL PBS. De preparaten kunnen enkele dagen in het donker bij vier graden Celsius worden bewaard voordat ze worden gemonteerd. Bereid eerst de objectglas voor voor de montage.Breng drie gelijkmatig verdeelde druppels van 10 µL Vector Shield monteermiddel aan op een microscoopglaasje. Plaats twee dekglasjes van 18 bij 18 mm op de buitenste druppels, waarbij de dekglasjes ongeveer 10 tot 15 mm uit elkaar worden gehouden.Plaats daarnaast 20 µL vector shield in het midden van een derde dekglasje. Houd vervolgens de gediseceerde volwassen vlieg vast bij de uiterste randen van de cuticula. Om deze voorzichtig uit de PVS-wasoplossing te verwijderen, wordt de vlieg met de hartzijde naar beneden voorzichtig op de druppel montage medium op het derde dekglasje geplaatst, waarbij maximaal vijf harten per druppel op het dekglasje worden geplaatst.Nadat de harten op de druppel op het dekglas zijn geplaatst, wordt onder een microscoop gecontroleerd of alle harten naar beneden zijn gericht. Keer nu voorzichtig het dekglas met de harten om en plaats het snel op het preparaat, waarbij de twee dekglazen zo worden vastgehouden dat de druppel van het omgekeerde dekglas met de hartbuisjes versmelt met de druppel vector-shield die in de ruimte tussen de dekglazen rust. Op deze manier vormen de drie dekglazen samen een brug.De harten worden opgehangen tussen het middelste dekglas en de microscoop. Schuif deze onder de brug en controleer onder een microscoop of de harten van de volwassen vliegen nu naar boven zijn gericht met behulp van nagellak. Fixeer de dekglazen aan de randen.De harten zijn nu klaar om te worden afgebeeld via fluorescentie- of confocale microscopie. Om larvale harten te monteren, plaatst u met een fijne pincet een druppel van ongeveer 20 µL BTA-shield op een microscopiepreparaat. Pak de larven vast bij de randen van de cuticula en breng deze voorzichtig over in de druppel.Oriënteer de larven met de dorsale zijde naar beneden met behulp van wolfraamnaalden. Plaats maximaal twee larven op één objectglas. Versleep vervolgens elk exemplaar uit het montage medium en lijn de larven parallel aan elkaar uit.Plaats met een pincet aan beide zijden van de uitgelijnde harten een dekglas. Plaats vervolgens een derde dekglas bovenop door eerst één zijde op het voorste dekglas te leggen en dit vervolgens naar het achterste dekglas te laten zakken, zodat er een brug wordt gevormd.Capillaire krachten zullen een stroom van vector shield van achteren naar voren veroorzaken, wat helpt bij de juiste uitlijning van het larvale hart. Fixeer tenslotte alle dekglasjes aan de randen met nagellak en vul de ruimte tussen de dekglasjes voorzichtig met 20 tot 30 µL vector shield; verzegel dit met nagellak en bewaar het bij 4 °C voor kortstondige bewaring of bij -20 °C voor een langere periode. Wanneer dit correct is uitgevoerd, zouden alle componenten en bijbehorende weefsels van het dorsale vat intact moeten blijven en gemakkelijk gevisualiseerd kunnen worden.De achtergrondfluorescentie moet minimaal zijn voor volwassenen. De ventrale longitudinale spierlaag kleurt zeer goed en produceert een aanzienlijk signaal. De onderliggende circulaire cardiomyocyten neigen er echter toe om een minder intens signaal te produceren dan dat van de bovenliggende ventrale laag.De myocyten van de anterieure conische kamer van het volwassen hart bevatten een aanzienlijke hoeveelheid contractiel materiaal, waardoor dit gebied als het meest robuust verschijnt in vergelijking met de rest van de hartbuis. De afbeelding van het larvale hart laat een spiraalvormige myofibrillaire rangschikking zien. Vergelijkbaar met die van de contractiele cardiomyocyten van volwassenen, hebben we zojuist uw protocol getoond voor het prepareren en kleuren van ovulaire harten voor fluorescentie- en confocale microscopie.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om onnodige hantering te beperken. Dit zorgt voor een betere intacte en behouden hartstructuur. Dit protocol dient enkel als uitgangspunt.Net als bij elke andere immunohistochemie vereisen verschillende antilichamen verschillende condities en moeten deze individueel worden geoptimaliseerd. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw kleuring.

fluorescent-labeling-of-drosophila-heart-structures

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Techniek die nodig is voor het visualiseren van het kloppend hart in de larven en...

Het visualiseren van de Beating Heart in Drosophila</em

We beschrijven een proces voor fixatie, inbedden, snijden, en de beeldvorming van laat...

De voorbereiding van embryo&#39;s voor Elektronenmicroscopie van de Drosophila Embryonale hart buis

We een techniek voor etikettering enkele neuronen in het centrale zenuwstelsel (CNS)...

Labeling van afzonderlijke cellen in het centrale zenuwstelsel van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We beschrijven een aantal methoden om kleurstoffen injecteren van DNA vectoren, virussen en cellen om zowel cellot en fenotype van endogene en geënte cellen uit embryonale of pluripotente cellen in muizenembryo's op embryonale dag (E) 9,5 en latere stadia bewaken ontwikkeling.

Cell Labeling en Injectie in ontwikkelingslanden Embryonale Mouse Hearts

Hier beschreven is een protocol voor de semi-geautomatiseerde beeldvorming van weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's.

Semi-geautomatiseerde beeldvorming van Tissue-specifieke fluorescentie in zebravis embryo&#39;s

Dit protocol presenteert een efficiënte methode voor het beeldvormen van het levende Drosophila pupale oogneuro-epitheel. Deze methode compenseert voor weefselbeweging en ongelijke topologie, verbetert de visualisatie van celgrenzen door het gebruik van meerdere GFP-gelabelde junctie-eiwitten en maakt gebruik van een eenvoudig te monteren beeldvormingsopstelling.

Live-beeldvorming van de Drosophila Pupal Eye

Het beschreven RNA in situ hybridisatie protocol staat toe de opsporing van RNA in hele Drosophila embryo's of ontleed weefsels. Met behulp van 96-wells microtiterplaat platen en tyramide signaal versterking, kunnen afschriften worden gedetecteerd op hoge resolutie, gevoeligheid en doorvoer, en tegen een relatief lage prijs.

Hoge resolutie fluorescentie In Situ hybridisatie in Drosophila embryo's en weefsels met behulp van Tyramide signaal versterking

In het vroege Drosophila-embryo zijn veel organellen beweeglijk. In principe kunnen ze live worden afgebeeld via specifieke fluorescerende sondes, maar de eierschaal voorkomt directe toepassing op het embryo. Dit protocol beschrijft hoe dergelijke sondes via micro-injectie kunnen worden geïntroduceerd en vervolgens bulk organelbeweging kan worden geanalyseerd via deeltjesbeeld velocimetrie.

Visualisatie van cytoskeletafhankelijke handel in lipidenbevattende organellen in drosophila-embryo's

Het huidige protocol beschrijft de generatie van Drosophila melanogaster die eNpHR2.0 of ReaChR-opsinen in het hart tot expressie brengt voor OCT-beeldvorming en optogenetische hartpacing. Gedetailleerde instructies voor Drosophila OCT beeldvorming en hartslagmodulatie, inclusief de simulatie van herstelbare hartstilstand, bradycardie en tachycardie bij levende dieren in verschillende ontwikkelingsstadia, worden gerapporteerd.

Ontwikkeling van Drosophila melanogaster modellen voor beeldvorming en optogenetische controle van de hartfunctie

Dit protocol beschrijft de op maat gemaakte op antilichamen gebaseerde fluorescentie-etikettering en injectie in vroege Drosophila-embryo's om live beeldvorming van eiwitten met een lage abundantie of posttranslationele modificaties mogelijk te maken die moeilijk te detecteren zijn met behulp van traditionele GFP/mCherry-tag-benaderingen.

Visualisatie van eiwitten met een lage abundantie en posttranslationele modificaties in levende Drosophila-embryo's via fluorescerende antilichaaminjectie

Het Drosophila-protocol voor hartdoorsnede en fluorescentiebeeldvorming vereenvoudigt het bestuderen van de hartstructuur en pathologieën. Deze aanpak omvat eenvoudige secties, kleuringen en beeldvorming, waarbij de technische expertise die nodig is voor traditionele dissectie wordt omzeild. Het verbetert de toegankelijkheid, waardoor Drosophila een breder bruikbaar model wordt voor hartgerelateerd onderzoek binnen de bredere wetenschappelijke gemeenschap.

Nieuwe en efficiënte methode voor Drosophila-hartfluorescentiekleuring met cryosectie

Leer fluorescente labeltechnieken voor hartstructuren in larven en volwassen Drosophila melanogaster. Deze methode maakt gedetailleerde morfologische analyse mogelijk via confocale microscopie.

TL-etikettering van Drosophila Hart Structuren

Meer video's verkennen