Name: ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Methode voor Mycotoxine Detection (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Leer de ELIME-methode voor gevoelige detectie van trichothecenen in voedselmonsters. Deze techniek combineert competitieve immunochemie met elektrochemische detectie voor verbeterde voedselveiligheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Auteurs willen graag Nancy Downer en alle leden bedanken uit het laboratorium van de Analytische Chemie, Universiteit van Rome &quot;Tor Vergata&quot; voor hun samenwerking en logistieke ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het EU-project &quot;BioCop&quot;.

1) Het blokkeren van gecoate magnetische Beads: Ga als volgt te gecoate magnetische kralen te blokkeren: <ol><li> Bereid een set van 2 ml Eppendorf buizen; </li><li> Homogeniseer (schudden, maar niet vortexen) gecoate magnetische kralen (zie de bijlage voor de bereiding van gecoate magnetische korrels) met behulp van het monster draaiende mixer; </li><li> Onmiddellijk na homogenisering, pipet 10 ul van gecoate magnetische korrels in elk afzonderlijk Eppendorf buizen; </li><li> Voeg 1 ml magere melk te blokkeren oplossing in elk eppendorfbuisje van de set; </li><li> Laat magnetische korrels incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op de draaiende mixer monster; </li><li> Verwijder de blokkering oplossing: om dit te doen plaats de buis in magnetische deeltjes concentrator met het magnetisch deel op voor de 2 min (zie magnetische korrels plakken op de laterale wand van de buis) zijn, dus wees pipet uit de bovendrijvende, waardoor kralen ongestoord; </li><li> Voeg 1 ml PBS buffer + NaN 3 + BSA als opslag-oplossing voor elke buis; </li><li> Store gecoat en geblokkeerd magnetische korrels bij 4 ° C (let op dat gecoate magnetische korrels stabiel zijn voor ten minste 2 maanden bij 4 ° C); </li></ol> 2) Immunologische ketting op magnetische korrels voor de bouw van de ijklijn en de monsteranalyse Ga als volgt te magnetische korrels klaar voor de meting zijn: <ol><li> Neem een ​​Eppendorf buis (2 ml) van gecoate en geblokkeerd oplossing voor elk monsterextract je gaat analyseren; </li><li> Neem een ​​extra eppendorfbuisje voor elk werkgebied kalibratieoplossing; </li><li> Homogeniseer magnetische korrels gedurende 2 minuten op de roterende steekproef mixer voor gebruik; </li><li> Verwijder de opslag van vloeibaar met behulp van magnetische deeltjes concentrator; </li><li> Was de magnetische korrels drie keer met PBS / BSA wasoplossing. Verwijder wasmiddel; </li><li> Concurrentie stap: Voeg voor elke buis met daarin de gewassen magnetische korrels, 200μl van het monsterextract voorbereid; gebruik maken van een magnetische kraal buis voor elk monster. Herhaal deze procedure voor elke standaard-oplossing. Voeg 200 ul van monoklonaal antilichaam oplossing voor elk magnetische kraal buis. Laat magnetische korrels Incubeer gedurende een half uur op de draaiende mixer monster bij kamertemperatuur; </li><li> Verwijderen uit Eppendorf buisjes de oplossing voor de concurrentie-stap; </li><li> Labeling stap: Voeg 400μl van gelabeld secundair antilichaam aan elke magnetische bead eppendorfbuisje. Laat magnetische korrels Incubeer gedurende een half uur op de draaiende mixer monster bij kamertemperatuur; </li><li> Verwijder de etikettering oplossing van Eppendorf buizen; </li><li> Was de magnetische korrels drie keer met PBS / Tween ® 20 wasoplossing. Verwijder de vloeistof; </li><li> Resuspendeer met 100μl van DEA buffer elk aliquot van magnetische kralen. Nu zijn de magnetische korrels zijn klaar voor elektrochemische metingen stap; </li></ol> 3) Montage van PalmSens met multiplexer (Mux) opties Let op: enzymatische hydrolyse product van substraat fouten het elektrode-oppervlak, om deze reden een nieuwe elektrode is nodig voor elke meting. <ol><li> Sluit een PC laptop PalmSens via de seriële kabel; </li><li> Sluit de 9-DIN-stekker van CH8 multiplexer met PalmSens. </li><li> Sluit de seriële kabel van Achtkanaals Mux elektrisch contact met CH8 multiplexer; </li><li> Plaats elektrode strip op de acht magneet blok. Besteed aandacht aan elk magneet plaats onder elke werkdag elektroden (van nota, de noodzaak van een magneet voor elke elektrode is noodzakelijk omdat anders de magnetische deeltjes zullen niet worden geconcentreerd op de werkende elektrode gebied); </li><li> Steek de stekker in elektrodes strip in acht kanaals Mux elektrisch contact; </li></ol> Voor DPV meting gebruik maken van de volgende parameters in de betreffende vakken: E beginnen: 0 (V); E end: 0,6 (V); E stap: 0.016 (V); E pulse: 0.0339 (V); E conditionering: 0 (V); E depositie: 0 (V); Scan tarief : 0,1 (V / s); T pulse: 0.06 (s); T conditionering: 0 (s), T depositie: 0 (s), T evenwicht: acht (s). 4) enzymatische reactie en elektrochemische meting <ol><li> Meng door zachtjes te schudden elk Eppendorf-buisje met magnetische korrels klaar voor elektrochemische metingen stap om tot een goed gedispergeerd opschorting van de magnetische beads te verkrijgen; </li><li> Pipetteer van elk Eppendorf, onmiddellijk na homogenisering, een hoeveelheid van 20 ul van het magnetische kraal dispersie op de overeenkomstige werkende elektrode oppervlak. Voor elke elektrode van een strook gebruik 20 ul van magnetische beads uit verschillende Eppendorf buizen (bijvoorbeeld voor acht elektrode acht verschillende Eppendorf); </li><li> Voeg 80 ul van enzymatische substraat oplossing op de eerste elektrode. Start 2 min. aftellen. Na 14 seconden, voeg 80 ul van enzymatische substraat oplossing op de tweede elektrode. Na nog eens 14 seconden, voeg 80 ul van enzymatische substraat-oplossing op de derde elektrode. Ga op hetzelfde moment interval (14 seconden) tot de laatste elektrode (dat betekent: druppel elk aliquot van substraat met intervallen van 14 sec). De interval tijd van 14 sec wordt berekend als de tijd die nodig is door de potentiostaat om de meting uit te voeren, van de nota, de 80 ui oplossing op elke sensor moet de werkende, referentie-en contra-elektrode te dekken. Bovendien moeten de oplossingen voor elke sensor niet in contact komen met oplossingen van naburige elektroden. </li><li> Na de 2 minuten af ​​te tellen vanaf de eerste toevoeging van enzymatische substraat oplossing, start de elektrochemische meting; </li><li> Gebruik de PalmSens Lite software om de huidige pieken (uA) te verkrijgen voor elke oplossing. </li></ol> 5) Berekening Stel een ijklijn met behulp van een logistische 4 parameters vergelijking en bereken de concentratie van het totale HT-2/T-2 toxine bedrag in nanogram per milliliter voor elke Eppendorf buis met onbekende monster. De experimentele gegevens, piekhoogte (uA) tegen de concentratie van de kalibranten (ng / ml), moeten worden uitgerust met een niet-lineaire vier-parameter logistiek (4-PL) vergelijking plot (1) (met behulp van Sigma Plot 8.0 of Kaleidagraph). De niet-lineaire 4-PL-model wordt meestal aangenomen om ligandbinding assays (LBA&#39;s) 6 beschrijven. <img src="/files/ftp_upload/1588/1588eq1.jpg" alt="Vergelijking 1" /> (1) a, b, x0, y0 zijn logistieke parameters zoals gegeven door de Sigma Plot curve fit programma. Gebruik de geëxpliciteerd formule om de inhoud van de HT-2/T-2 toxine totale bedrag te berekenen in de verdunde oplossing monsterextract <img src="/files/ftp_upload/1588/1588eq2.jpg" alt="Vergelijking 2" /> (2) x is de massaconcentratie van de totale hoeveelheid HT-2/T-2 toxines in de verdunde extract oplossing, berekend op basis van de logistieke 4 parameters vergelijking in nanogram per milliltre (ng / ml) y is de huidige waarde in uA verkregen voor het onbekende monster Appendix 6) gecoate magnetische Beads Ga als volgt te gecoate magnetische kralen hebben: Wasprocedure <ol><li> Homogeniseren tosylactivated Dynabeads ® M-280 (voorraadoplossing 2 x 109 kralen / ml) door te schudden en vortexen (max snelheid) gedurende 1 minuut (voorkoming van schuimvorming) (let op de concentratie van de magnetische beads moet altijd hetzelfde zijn om te zorgen voor reproduceerbaarheid in de meting); </li><li> Onmiddellijk pipet 1 ml van de bovenstaande gehomogeniseerd kralen in een 2 ml Eppendorf buis; </li><li> Plaats de buis in magnetische deeltjes concentrator met het magnetisch deel op voor de 2 min (zie magnetische korrels plakken op de laterale wand van de buis); </li><li> Voorzichtig pipet uit de bovendrijvende, waardoor kralen ongestoord; </li><li> Haal de eppendorfbuisje van de magnetische deeltjes concentrator en resuspendeer de kralen in 1 ml van 0,1 M boraatbuffer pH 9,5. Mix zachtjes gedurende 2 minuten in de roterende steekproef mixer gedurende 2 minuten; </li><li> Pipet uit de bovendrijvende; </li><li> Pipetteer 1 ml van boraatbuffer oplossing in het Eppendorf buis. Magnetische kralen zijn nu klaar voor het coaten stap; </li></ol> Coating procedure <ol start="8"><li> Voeg 600 ml van de HT-2-geconjugeerd met KLH (Keyhole Limpet Hemocyanine) stockoplossing aan 1 ml van de magnetische kralen) (laatste HT-2-KLH concentratie van 375 mg / ml); incubeer magnetische korrels en HT-2-KLH oplossing voor 20u bij 37 ° C * met langzame tilt rotatie op roterende steekproef mixer; </li><li> Na incubatie plaats de buis in de magnetische deeltjes concentrator en pipet uit de bovendrijvende; Was de gecoate parels twee keer met 1 ml PBS / BSA bufferoplossing. Tussen elke wassen te verwijderen PBS / BSA-oplossing. Alle wasstap werden uitgevoerd instelling magnetische korrels en PBS / BSA op de draaiende mixer gedurende 5 minuten; </li><li> Was magnetische korrels een keer met 1 ml van de TRIS / BSA bufferoplossing. Verwijder de TRIS / BSA-oplossing. Voer deze stap door magnetische korrels en TRIS / BSA buffer op de draaiende mixer gedurende 4 uur bij 37 ° C *; </li><li> Was magnetische korrels een keer met 1 ml vernieuwd (in de koelkast bewaren bij 4 ° C) PBS / BSA bufferoplossing. Verwijder PBS / BSA-oplossing. Het uitvoeren van deze stap instelling magnetische korrels en PBS / BSA buffer op de draaiende mixer voor 5 min bij kamertemperatuur; </li><li> Na het wassen stap verwijder alle wasmiddel en voeg 1 ml PBS buffer + NaN 3 + BSA als opslag vloeistof; </li><li> Store gecoate magnetische korrels bij 4 ° C (let op dat gecoate magnetische korrels stabiel zijn voor ten minste 2 maanden bij 4 ° C); </li></ol> * Voor dit doel de mixer wordt geplaatst in de oven is uitgerust met een gat dat het inbrengen van de kabel voor de voeding mogelijk maakt. Als alternatief kan de mixer kon worden geplaatst in een thermostatisch kamer bij 37 ° C. 7) Voorbereiding van het monster en extractie 25 g fijn gemalen monster (babyvoeding of ontbijtgranen) zijn wijighed in een blender pot en geëxtraheerd met 100 ml acetonitril / water-oplossing (86/14) voor 3 min in een high-speed blender. Na het centrifugeren bij 4000 rpm (3000 g) voor 5 min, 8 ml van de bovenstaande werden genomen en gezuiverd met Mycosep kolom, werden 4 ml van de gereinigde extract gedroogd onder stikstofstroom. Gedroogde monsters kan worden opgeslagen bij -30 ° C tot enkele maanden. 8) Voorbeeld reconstitutie Ontbijtgranen Los het droge ontbijtgranen extract (op basis van granen voeding bestemd voor volwassen consumptie) met 40 ml PBS pH 7,4. Op deze manier wordt een monster met een concentratie van toxine die gelijk is aan de veronderstelde wettelijke limiet (200 ng / g) geeft in de meting stap een signaal vallen in het midden van het werkgebied. Babyvoedsel Reconstitueer de gedroogde babyvoeding extract (op basis van granen voedsel bestemd voor babyvoeding) met 4 ml PBS. Op deze manier wordt een monster met een concentratie van giftige stoffen die gelijk is aan de veronderstelde wettelijke limiet (20-25 ng / g) geeft in de meting stap een signaal vallen in het midden van het werkgebied.

<ol><li>Koch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art+of+trichothecenes+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Letters%22%5BJournal%5D)">State of the art of trichothecenes analysis.</a> Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).</li>
<li>Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art+in+the+analysis+of+type-A+and-B+trichothecene+mycotoxins+in+cereals%5BTitle%5D)+AND+%22Fresenius+J.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals.</a> Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).</li>
<li>Morozova, T. Y., Morozov, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+differentiation+in+recognition+of+cross-reactive+antigens+by+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads.</a> Anal. Biochem. , 263-271 (2008).</li>
<li>FAO Food and Nutrition Paper 74. JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. 2001 Feb 6-15, Geneva, , Food & Agricultural Organization of the United Nations. 115 (2001).</li>
<li>Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Screening+Electrochemical+Methods+for+Aflatoxin+B1+and+Type-A+Trichothecenes%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study.</a> Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).</li>
<li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li>
<li>Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l, Palleschi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+novel+developments+and+applications+of+immunosensors+in+food+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis.</a> Anal. Chim. Acta. 605 (2), 111-129 (2007).</li>
</ol>

Het gebruik van antilichamen als biomoleculaire erkenning probe heeft gezien een wijdverbreide gebruik voor het waarnemen van technologieën; immunochemische detectie methoden, zoals ELISA&#39;s en MEIAs, zijn tegenwoordig een van de meest gebruikte platforms en toegepast in veel laboratoria 7. Hoewel deze benaderingen uitzonderlijke gevoeligheid en specificiteit, een primaire doelstelling van vele onderzoeksgroepen te bereiken in de afgelopen jaren is het verbeteren en optimaliser...

Reagentia <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Commentaar (optioneel) </td></tr><tr><td> Kaliumchloride </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumdiwaterstoffosfaat </td><td> Sigma </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Dinatriumwaterstoffosfaat </td><td> Sigma </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Sigma </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 watervrij </td><td> Sigma </td><td> M8266 </td><td></td></tr><tr><td> DEA (99,5%) </td><td> Sigma </td><td> 31589 </td><td></td></tr><tr><td> HCl 37% </td><td> Sigma </td><td> 320331 </td><td></td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> Sigma </td><td> B6768 </td><td></td></tr><tr><td> Tris [hydroxymethyl]-aminomethaan </td><td> Sigma </td><td> 252859 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (bovine serum albumine) </td><td> Sigma </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3 </td><td> Aldrich </td><td> 71290 </td><td></td></tr><tr><td> 1-naftyl fosfaat dinatriumzout </td><td> Fluka </td><td> N7255 </td><td></td></tr><tr><td> Magere melk blokkeren oplossing - niet-vette droge melk </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2-geconjugeerd met KLH (Keyhole Limpet Hemocyanine), voorraad-oplossing (1 mg / ml in PBS): </td><td> Biopure </td><td> 004050 </td><td> De HT-2-KLH conjugaat werd verkregen door de CDI-methode waarbij de vrije OH-groepen op positie 3 en 4 bij de HT-2-toxine werden geactiveerd door N, N&#39;-carbonyldiimidazool (CDI) en de geactiveerde HT-2-toxine werd laat om te reageren met aminogroups van het eiwit (KLH) om een ​​stabiele carbammate koppeling te genereren. </td></tr><tr><td> Secundaire gelabelde antilichaam: Anti-muis IgG (H + L), van paarden, geconjugeerd met alkalische fosfatase, concentratie 1 mg / ml. </td><td> Vector Laboratories </td><td> AP-2000 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2-toxine </td><td> Biopure </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Magnetische korrels: Dynabeads ® </td><td> Dynal </td><td> M-280 Tosylactivated </td><td> Concentratie 2 x 10 9 kralen / ml. </td></tr></table> Oplossingen <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Naam van het serum </td><td> Voorbereiding </td><td> Commentaar (optioneel) </td></tr><tr><td> Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4 </td><td> Los 0,20 g kaliumchloride, 0,20 g kaliumdiwaterstoffosfaat, 1,16 g dinatriumwaterstoffosfaat en 8,00 g natriumchloride in 900 ml water </td><td></td></tr><tr><td> Diethanolamine buffer, DEA, 0,97 M + 1 mM MgCl 2 + 0,15 M KCl, pH 9,8 </td><td> Los 0.0476g van MgCl 2 watervrije en 7.3.59 g KCl in ~ 300 ml water. Voeg na oplossing 51 ml van de DEA (99,5%). Pas de pH op 9,8 met HCl (6 M). Verdun tot 500 ml met water. </td><td></td></tr><tr><td> Boraat buffer, 0,1 M, pH 9,5 </td><td> Los 3,09 g van H 3 BO 3 in ~ 300 ml gedestilleerd water, de pH instellen op 9,5 met NaOH en / of HCl (6 M of lagere concentraties). Verdun tot 500 ml met gedestilleerd water. </td><td></td></tr><tr><td> TRIS buffer, 0,2 M, pH 8,5 </td><td> Los 3,85 g Tris [hydroxymethyl]-aminomethaan in 100 ml water. Aan te passen aan de pH 8.5 met NaOH en / of HCl (6 M of lagere concentraties). Verdun tot 200 ml met water. </td><td></td></tr><tr><td> Tris-buffer + BSA-oplossing (0,1%), pH 8,4 </td><td> Los 0,050 g van de BSA in 50 ml van de TRIS-buffer pH 8,4. </td><td> Deze oplossing moet vers worden bereid op de dag van gebruik. </td></tr><tr><td> PBS-buffer + Tween ® 0,05% </td><td> Los 0,250 g Tween 20 in 500 ml van de vooraf bereide PBS-buffer, pH 7,4 </td><td></td></tr><tr><td> PBS-buffer + BSA-oplossing 0,1% </td><td> Los 0,050 g van de BSA in 50 ml PBS-buffer, pH 7,3. </td><td> Deze oplossing moet vers worden bereid op de dag van gebruik. </td></tr><tr><td> PBS-buffer + BSA 0,1% + 0,02% NaN 3 </td><td> Los 0,050 g van de BSA en 0.010 van NaN 3 in 50 ml PBS-buffer, pH 7,3. </td><td> Opslag solution </td></tr><tr><td> Enzymatische substraat </td><td> Los 0,010 g 1-naftyl fosfaat natriumzout in 100 ml van de DEA buffer pH 9,8. Strak Wikkel de kolf in aluminiumfolie. </td><td> Deze oplossing moet vers worden bereid op de dag van gebruik. </td></tr><tr><td> Magere melk blockingbuffer </td><td> Voeg 0,20 g Blotting Grade Blocker niet-vette droge melk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) tot 200 ml PBS buffer pH 7,3. </td><td> Deze oplossing moet vers worden bereid op de dag van gebruik. </td></tr><tr><td> HT-2-stockoplossing </td><td> Los 10 mg trichothecenen HT-2-toxine flacon, in 10 ml acetonitril te geven een oplossing met een concentratie van 1 mg / ml. </td><td> Opgesplitst deze oplossing in voor eenmalig gebruik aliquots van 30 ml en sla ze op minder dan -30 ° C. </td></tr><tr><td> HT-2 standaard-werkoplossing </td><td> Pipetteer 20 ml van de HT-2-toxine voorraad oplossing in een 2 ml geijkte maatkolf en verdun met acetonitril om een ​​HT-2-werkende oplossing met 10 ug / ml van trichothecenen toxine te verkrijgen. </td><td> Deze oplossing moet vers worden bereid op de dag van gebruik. </td></tr><tr><td> HT-2 Werken kalibrant oplossingen </td><td> Verdun de HT-2 standaard-werkoplossing (10 ug / ml) aan het werken kalibratieoplossing 100 ng / ml te bereiden. Verdunnen HT-2 werkdagen kalibratieoplossing 100 ng / ml te bereiden op het werken kalibratieoplossing oplossingen van de volgende concentraties 0 (leeg), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng / ml. </td><td> Deze oplossingen moeten vers worden bereid op de dag van gebruik. </td></tr><tr><td> HT-2-geconjugeerd met KLH </td><td> Opgesplitst HT-2-geconjugeerd met KLH (Keyhole Limpet Hemocyanine) stockoplossing (1 mg / ml in PBS) in voor eenmalig gebruik porties van 350 ui. </td><td> Bewaar aliquots bij -30 ° C. </td></tr><tr><td> Specifiek monoklonaal antilichaam </td><td> 1:350 verdunnen (v: v) de voorraad concentratie (1,383 mg / ml) van het monoklonale antilichaam in PBS om te gebruiken in de concurrentie stap </td><td> Deze oplossing moet vers worden bereid op het moment van gebruik. 10 ml antilichaam voorraad oplossing in PBS voor een uiteindelijk volume van 3,5 ml, genoeg zijn om 17 normen en / of monsters te analyseren. </td></tr><tr><td> Secundaire gelabelde antilichaam </td><td> Anti-muis IgG (H + L) geconjugeerd met alkalische fosfatase is verdund 1:100 (v: v) in PBS om te gebruiken in de concurrentie stap. </td><td> 100 pi antilichaam voorraad oplossing in PBS voor een uiteindelijk volume van 10 ml, is voldoende om 25 normen en / of monsters te analyseren. Deze oplossing moet vers worden bereid op het moment van gebruik. </td></tr></table> Apparaat <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Commentaar (optioneel) </td></tr><tr><td> Magnetic Particle Concentrator: MPC ®-S </td><td> Dynal </td><td></td></tr><tr><td> PalmSens instrument </td><td> PalmSens </td><td> Voorzien van PalmSens Lite, Serial kabel tussen PC en laptop Mux opties software </td></tr><tr><td> CH8 PalmSens Multiplexer </td><td> PalmSens </td><td></td></tr><tr><td> Acht kanaals Mux elektrisch contact </td><td> met de hand gemaakt </td><td></td></tr><tr><td> Strip met acht gezeefdrukt elektroden (SPE&#39;s) </td><td> met de hand gemaakt </td><td></td></tr><tr><td> Speciaal ontworpen voor de ondersteuning van elektroden strip </td><td> met de hand gemaakt </td><td> Inclusief 8 neodymium magneten die elk bevindt zich onder elke werkdag elektrode-oppervlak van de SPE </td></tr><tr><td> Gekalibreerde microliter pipetten </td><td> Gilson </td><td></td></tr><tr><td> Magnetische roerder en roer bars. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glazen bekers (100, 50, 20 ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Maatkolven (2 ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2 en 2 ml Eppendorf buizen. </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> Falcon ™ tubes van 5 ml en 15 ml. </td><td> Valk </td><td></td></tr><tr><td> Laboratorium Vortex Mixer </td><td></td><td> Gebruik geen vortexmixer aan magnetische bolletjes gecoat met HT2-KLH of gekoppelde mengen met een immunologische ketting om te voorkomen dat denaturering van proteic onderdelen </td></tr><tr><td> Laboratorium oven of thermostaat ruimte </td><td></td><td> Kies een oven in staat om een ​​temperatuur van 37 ± 3 ° C te houden </td></tr></table>

elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) methode voor mycotoxine detection

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Immunoassays zijn een goed alternatief voor de duurdere en tijdrovende kwantitatieve HPLC of GC 1, 2 methoden voor het screenen detectie van gevaarlijke mycotoxinen in levensmiddelen. In dit protocol laten we zien hoe te fabriceren en te ondervragen een elektrochemische competitieve enzyme linked immunomagnetische assay gebaseerd op het gebruik van magnetische beads als vaste ondersteuning voor de immunochemische keten 3 en gezeefdrukt elektroden sensing platform. Onze methode heeft tot doel vast te stellen het totale bedrag van de HT-2 en T-2-toxine, mycotoxinen die behoren tot de trichothecenen familie en van groot belang voor de gezondheid van de mens 4. Het gebruik van een antilichaam kloon met een kruis reactiviteit van 100% naar HT-2 en T-2 maakt het mogelijk om gelijktijdig zowel de toxines te detecteren met een vergelijkbare gevoeligheid 5. De eerste stap van onze test is de coating stap waar we HT2-KLH conjugaat toxine immobiliseren op het oppervlak van de magnetische kralen. Na een blokkerende stap die nodig is om niet-specifieke absorptie te voorkomen, de toevoeging van een monoklonaal antilichaam kan de concurrentie tussen de geïmmobiliseerde HT-2 en gratis HT-2 of T-2 aanwezig is in het monster of opgelost in een standaard oplossing. Aan het einde van de wedstrijd stap, het bedrag van monoklonale antilichaam gekoppeld aan het geïmmobiliseerde HT-2 zullen worden omgekeerd evenredig aan de hoeveelheid gif in de monsteroplossing. Een secundaire antilichaam gelabeld met alkalische fosfatase (AP) wordt gebruikt om de binding tussen de specifieke antilichaam en het geïmmobiliseerde HT-2 te onthullen. De laatste meting stap wordt uitgevoerd door het droppen van een hoeveelheid van magnetische kraal ophanging, wat overeenkomt met een specifiek monster / standaard oplossing, op het oppervlak van een gezeefdrukte werkende elektrode, magnetische korrels worden geïmmobiliseerd en geconcentreerd door middel van een magneet precies onder de gezeefdrukt elektrode. Na twee minuten incubatie tussen magnetische kralen en een substraat voor AP, is de enzymatische product gedetecteerd door Differential Pulse voltammetrie (DPV) met behulp van een draagbaar instrument (PalmSens) ook in staat om automatisch acht metingen te starten binnen een interval van enkele seconden.

Een protocol om trichothecenen (mycotoxinen van zorg voor de gezondheid van de mens) met behulp van een nieuw ontwikkelde screening methode gebaseerd op een competitief immunochemische methode en een laatste elektrochemische detectie te detecteren is aangetoond.

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Methode voor Mycotoxine Detection

Immunoassays vormen een geldig alternatief voor de duurdere en tijdrovendere kwantitatieve HPLC- of GC-methoden1, 2 voor de screeningsdetectie van gevaarlijke ...

Hallo, mijn naam is Francesco Lichi. Ik ben postdoc-onderzoeker bij het bioanalytisch laboratorium van professor Palki aan de Universiteit van Rome Tor Vergata. Vandaag ga ik u, samen met mijn collega's, de bereiding van een elektrochemische CY laten zien voor de detectie van TCO-mycotoxine in voedselmonsters.Onder de verschillende methoden die worden gebruikt bij immunocellulaire tests, is de enzym-immunocellulaire methode een van de meest populaire. Hierbij wordt ofwel het antilichaam ofwel het antigeen gekoppeld aan een enzym. Onlangs is aangetoond dat het gebruik van elektrochemische methoden voor de detectie van de enzymactiviteit specifieke voordelen biedt voor bepaalde toepassingen.Elektrochemie is in feite minder gevoelig voor interferenties, is geschikt voor miniaturisering en voor massale detectie tegen lage kosten. Vanuit dit perspectief is het gebruik van screenprint-elektroden van groot belang om lage kosten en een eenvoudige procedure te waarborgen. Bovendien kan het gebruik van magnetische substraten worden gecombineerd met screenprint-elektroden om de best mogelijke gevoeligheid van de methode te verkrijgen.Vandaag laten we u zien hoe u een elektrochemische sensor voorbereidt op basis van gescreende elektroden en magnetische beads voor de detectie van trichotheceen-mycotoxinen (TCO's) in voedselmonsters. Trichotheceen-mycotoxinen komen vaak voor in granen en vormen daarom een ernstige bedreiging voor de veiligheid van op granen gebaseerde voedings- en veevoedersoorten. De belangrijkste toxinen binnen groep A zijn de T-2 en HT-2 toxinen.Zoals we zullen zien, kan deze methode eenvoudig worden uitgevoerd door ongetraind personeel en vereist deze goedkope en draagbare instrumentatie. Dit is een van de hoofddoelstellingen van het geïntegreerde project bio, gefinancierd door de Europese gemeenschap, in het kader waarvan dit werk is uitgevoerd. Laten we nu kijken naar het principe van de methode en de materialen die we zullen gebruiken.Laten we beginnen. Materialen: magnetische kralen zullen worden gebruikt als drager voor de immunologische kettingreactie. Een strip van acht gescreenprinte elektroden zal worden gebruikt als detectie-element.Elke sensor bestaat uit een grafiet werkelektrode, een tegenelektrode en een zilveren referentie-elektrode. Deze sensoren kunnen sequentieel en individueel in zeer korte tijd worden bediend met een draagbaar elektrochemisch instrument van PalmSense. Het principe van de methode is eenvoudig en is gebaseerd op een competitieve immunologische reactie.Het geconjugeerde toxine wordt geïmmobiliseerd op de magnetische beads, die vervolgens worden geblokkeerd om aspecifieke adsorptie te voorkomen. De meting zelf begint met de competitiestap. In deze fase krijgen de gecoate beads de kans om te reageren met een vaste hoeveelheid monoklonaal antilichaam; hierbij zullen het toxine in het monster en het toxine dat op de magnetische beads is geïmmobiliseerd, concurreren om de bindingsplaatsen van het antilichaam.De hoeveelheid antilichaam die aan de gecodeerde beads is gekoppeld, is omgekeerd proportioneel aan de hoeveelheid toxine in een monster. De competitiestap wordt vervolgens gevolgd door de labelingsstap. In dit geval krijgen de magnetische beads de tijd om te reageren met een secundair antilichaam dat is geconjugeerd met een labelingsenzym.Het secundaire antilichaam zal binden aan het monoklonale antilichaam en een efficiënte labeling waarborgen. De labelingsstap wordt tot slot gevolgd door de meetstap. In dit geval worden de magnetische kralen met behulp van het magnetische platform geconcentreerd op het elektrode-oppervlak, waarna we simpelweg het enzymsubstraat one napt phosphate toevoegen en de productie van one naptha meten.De gegenereerde bindingscurve zal hoge stroomwaarden vertonen bij lage toxineconcentraties en lage signalen bij een hoog toxinegehalte. De toxineconcentratie wordt bepaald aan de hand van een kalibratiecurve die is opgesteld in standaard gebufferde oplossingen. Om de eigenlijke assay in te richten, bereiden we een rek met schone Fendor-buisjes van twee mil voor, een apart buisje voor elke standaardoplossing van de kalibratiecurve en voor de monsters.Vervolgens wordt 10 µL van de kraal-suspensie in elke buis gepipetteerd. Deze oplossing bevat magnetische kralen die vooraf zijn gecoat met het geconjugeerde toxine. Voor het uitvoeren van de assay moet de bewaarvloeistof echter worden verwijderd, omdat het natriumazide dat als conserveermiddel is gebruikt, de enzymatische activiteit van het label zou beïnvloeden.Hiervoor wordt P-B-S-B-S-A-buffer toegevoegd. De buisjes worden geschud, waarna de magneet opnieuw wordt geplaatst en de wasbuffer wordt weggepipetteerd. De eerste eigenlijke stap van de assay wordt de blokkeringsstap genoemd.Tijdens deze stap wordt één ml blokkeringsoplossing aan elke buis toegevoegd. Vervolgens worden ze in een roterende mengmachine geplaatst en een half uur bij de ingestelde temperatuur geïncubeerd. Daarna wordt de blokkeringsoplossing verwijderd voor de volgende cruciale stap, de competitiestap, waarbij we monoklonale specifieke antilichaam- en toxine-oplossingen aan elke buis toevoegen.Hiervoor worden 200 µL monoklonaal antilichaam geïnjecteerd in de geoptimaliseerde concentratie. Vervolgens worden 200 µL van elke standaardoplossing of monster aan elke buis toegevoegd. Deze reagentia worden gedurende 30 minuten geïncubeerd.Om het contact tussen de op het oppervlak van de magnetische deeltjes geïmmobiliseerde reagentia en de moleculen in de oplossing te optimaliseren om dit proces te starten, worden de buisjes teruggeplaatst op de roterende monster-mixer om over te gaan naar de labelingsstap. Het is noodzakelijk om de oplossing uit de vorige stap te verwijderen. Vervolgens worden 400 µL gelabelde secundaire antilichamen aan elke buis toegevoegd, waarna deze teruggeplaatst worden op de roterende monster-mixer en gedurende 30 minuten worden geïncubeerd.Na het verwijderen van de labelvloeistof hebben we wasprocedures uitgevoerd met verschillende buffers om enige interferentie door ongebonden enzymatische reagentia te voorkomen. Ten slotte, ter voorbereiding op de eigenlijke metingen, worden de magnetische kralen opnieuw gesuspendeerd in 100 µL DEA-buffer, een buffer die geschikt is voor het optimaliseren van de enzymatische activiteit van het label. De meting wordt uitgevoerd met deze palmsends pot potentials stat, die verbonden is met een strip met acht elektroden eronder.Er is een speciale houder waarop acht sterke magneten precies onder het oppervlak van elke werkelektrode zijn bevestigd. De magneet dient om de beads op het oppervlak van de werkelektrode te concentreren. We pipetteren uit elke EOR een aliquot van 20 µL van de reactieve magnetische bead-dispersie en brengen deze aan op het corresponderende oppervlak van de werkelektrode.Om de eigenlijke meting uit te voeren, moet het enzymatische substraat worden toegevoegd, waarbij de volgorde van de stappen zorgvuldig moet worden gecontroleerd. We voegen ad microliters enzymatische substraatoplossing toe aan het oppervlak van de eerste elektrode. Vervolgens starten we een aftelling van twee minuten.Na 14 seconden voegen we substraatoplossing toe aan de tweede elektrode. Na nog eens 14 seconden voegen we substraatoplossing toe aan de derde elektrode. We gaan verder met hetzelfde tijdsinterval tot aan de laatste elektrode.In feite is het interval van 14 seconden berekend als de tijd die de potentiaalstat nodig heeft om de meting uit te voeren. Na de aftelling van twee minuten vanaf de eerste toevoeging van de enzymatische substraatoplossing, wordt het elektrochemische meetprotocol gestart. De feitelijke meting van het gevormde product wordt uitgevoerd met behulp van differentiële potentiometrie.De curven voor de opeenvolgende elektroden beginnen op het scherm te verschijnen, aangezien het om een competitieve assay gaat. De stroomintensiteit van het verkregen signaal is omgekeerd proportioneel aan de concentratie toxine die tijdens de competitiestap in de buis aanwezig was. Het stroomsignaal van de standaardoplossingen wordt uitgezet in een sigmoïdale curve en het toxinegehalte van onbekende monsters wordt bepaald door de concentratiewaarde te extrapoleren uit het geregistreerde signaal.Ik hoop dat deze demonstratie duidelijk en nuttig was om de voordelen van elektrochemische immunosensoren te begrijpen. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

elime-enzyme-linked-immuno-magnetic-electrochemical-method-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Magnetische modulatie biosensing systeem wordt gebruikt om snel, gevoelig en eenvoudig te detecteren biologische assays, zoals DNA-moleculen en eiwitten.

Homogene snelle detectie van biologische testen met behulp van Magnetic Modulation biosensing System

Identificatie van microbiële doelstellingen van adaptieve immuniteit in idiopathische ziekte kan worden bewerkstelligd door het gebruik van het enzym-linked immunospot assay.

Enzyme-linked immunospot Assay (ELISPOT): Kwantificering van de Th-1 cellulaire immuunreacties tegen microbiële antigenen

Met behulp van Luminex Corporation xMAP microsfeer technologie, hebben we de multiplexverzending fluorometrische immunoassay (MFIA) voor serologische tests van de verschillende proefdier. De MFIA een suspensie microarray waar antigen, weefselcontrole of immunoglobulinen covalent gekoppeld aan gekleurde polystyreen microsferen. De MFIA testmethode, evenals verschillende onderwerpen voor problemen oplossen is gericht.

Multiplexed fluorometrische Immunoassay Methodiek en problemen oplossen

Een protocol dat geïntegreerde concentratie, verrijking en eindpuntkleurmeting voor de detectie van door voedsel overgedragen ziekteverwekkers in grote volumes landbouwwater presenteert, wordt hier gepresenteerd. Het water wordt gefilterd door middel van Modified Moore Swabs (MMS), verrijkt met selectieve of niet-selectieve media, en de detectie wordt uitgevoerd met behulp van op papier gebaseerde analytische apparaten (µPAD) ingebed met bacteriële-indicatieve kleurmetingssubstraten.

Colorimetrische Papier-gebaseerde detectie van<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. En<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Van grote volumes of Agricultural Water

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van twee IgG-klasse monoklonale antilichamen (mAbs) die sterk reageren op myoglobine van cetacean. Deze mAbs worden toegepast op een colloïdaal goud immunochromatografische teststrip op basis van het sandwich-formaat om het Mb van cetacean te onderscheiden van zeehond en andere dieren.

Ontwikkeling van een colloïdaal goud-gebaseerde immunochromatographic teststrip voor detectie van walvisachtigen Myoglobin

De aanwezigheid van cyanobacteriëntoxines in zoetwaterreservoirs voor menselijke consumptie is een grote zorg voor waterbeheerautoriteiten. Om het risico van waterverontreiniging te evalueren, beschrijft dit artikel een protocol voor de detectie op locatie van cyanobacteriënstammen in vloeibare en vaste monsters door gebruik te maken van een antilichaam-microarray-chip.

Experimenteel protocol voor het opsporen Cyanobacteriën In vloeibare en vaste monsters met een antilichaam Microarray Chip

Elektrowetting-gebaseerde digitale microfluidic is een techniek die gebruik maakt van een spanning-gedreven verandering in de schijnbare contacthoek van een microliter-volume druppel om de manipulatie te vergemakkelijken. Door dit te combineren met gefunctionaliseerde magnetische kralen, kunnen meerdere laboratoriumeenheden worden ingebracht voor monstervoorbereiding en identificatie van ziekteverwekkers met behulp van immunosorbent Assay (ELISA) met enzymgebonden immunosorbent assay.

Elektrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

De elektrochemiluminescentie immunoassay (ECLIA) is een nieuwe benadering voor kwantitatieve detectie van endogene en exogenously toegepaste MeCP2 eiwitvarianten, die zeer kwantitatieve, nauwkeurige en reproduceerbare metingen produceert met een lage intra- en inter-assay-fout over een breed werkbereik. Hier wordt het protocol voor de MeCP2-ECLIA in een 96-well formaat beschreven.

Een op elektrochemiluminescentie gebaseerde test voor MeCP2-eiwitvarianten

Bij Mycoplasma pneumoniae-infectie kunnen serologische tests goede resultaten opleveren, maar met een lage specificiteit vanwege immunologische kruisreactie. De in-house antigeenvangst ELISA, beschreven in dit artikel, garandeert een hoge soortspecificiteit en is een betrouwbare screeningstest gebleken voor een nauwkeurige diagnose van M. pneumoniae.

Antigeen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay voor specifieke detectie van Mycoplasma pneumoniae

Dit protocol presenteert een gevalideerde massaspectrometriemethode voor vloeistofchromatografie-ionenmobiliteit en hoge resolutie om de aanwezigheid van moederkorenalkaloïden in voedsel te bepalen in overeenstemming met de onlangs uitgebrachte Verordening (EU) 2023/915 van de Commissie.

Detectie van gereguleerde moederkorenalkaloïden in voedselmatrices door middel van vloeistofchromatografie-ingesloten ionenmobiliteitsspectrometrie-time-of-flight massaspectrometrie

Leer de ELIME-methode voor gevoelige detectie van trichothecenen in voedselmonsters. Deze techniek combineert competitieve immunochemie met elektrochemische detectie voor verbeterde voedselveiligheid.

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Methode voor Mycotoxine Detection

Meer video's verkennen