Split-Ubiquitine membraanfilters op Yeast Two-Hybrid (mythe) Systeem: een krachtig hulpmiddel voor het identificeren van eiwit-eiwit interacties

Het mythe-systeem is gebaseerd op het concept van gesplitst ubiquitine, wat verwijst naar het vermogen van ubiquitine om stabiel te worden gescheiden in N-terminale NUBI- en C-terminale CUB-helften die in staat zijn om opnieuw te worden samengevoegd tot een volledig pseudo-ubiquitinemolecuul. Hoewel deze reconstitutie spontaan verloopt bij gebruik van wild-type NUBI, vermindert de introductie van een isoleucine 13 naar glycine-mutatie, waarbij een fragment genaamd NUBG wordt geproduceerd, de affiniteit voor CUB aanzienlijk, waardoor de vorming van pseudo-ubiquitine wordt geblokkeerd. Als NUBG en CUB respectievelijk gefuseerd zijn aan proteïne A en proteïne B, en A en B in staat zijn tot interactie, dan kan het pseudo-ubiquitinemolecuul opnieuw worden gevormd.

In dit systeem zijn integrale membraan-lokken gefuseerd aan een domein bestaande uit het CUB-fragment dat is gekoppeld aan een kunstmatige transcriptiefactor. Terwijl de prooien zijn gefuseerd aan het NUBG-fragment, leidt een interactie tussen de lok en de prooi tot de reconstitutie van het pseudo-ubiquitine, dat op zijn beurt kan worden herkend door cytosolische de-ubiquitinerende enzymen, weergegeven als scharen. Deze enzymen splitsen na de C-terminus van CUB, waardoor de transcriptiefactor vrijkomt, die vervolgens de kern kan binnentreden en een reportersysteem kan activeren, wat de selectieve isolatie en identificatie mogelijk maakt van cellen waarin lok-prooi-interacties plaatsvinden.

Hallo, ik ben Janie Snyder van het Igor STAARs Lab van de afdelingen Moleculaire Genetica en Biochemie aan de Universiteit van Toronto. Vandaag laat ik u een procedure zien voor membrane yeast two-hybrid, oftewel MyTH. In ons lab gebruiken we deze procedure om de interacties van integrale membraaneiwitten te bestuderen. Laten we beginnen.

Verifieer vóór het uitvoeren van de myth-analyse of het N- en/of C-terminus van uw bait-eiwit zich in het cytosol van de cel bevindt. De CUB Lex A VP 16-tag moet aan een dergelijke terminus van uw eiwit gefuseerd zijn. Aangezien de gedeubiquitinerende enzymen die nodig zijn voor de vrijgave van de transcriptiefactor zich in het cytosol bevinden, kunt u, indien de topologie van uw bait-eiwit onbekend is, constructen genereren die aan zowel de N- als C-terminus getagd zijn. Gebruik vervolgens de N-U-B-G-I-controletest die kort wordt beschreven om te bepalen of een van deze geschikt is voor gebruik in myth, wat aangeeft dat een specifieke terminus cytosolisch is.

Bepaal vervolgens welke van de twee belangrijkste varianten van myth geschikt is voor uw experiment. Voor inheemse gistproteïnen is geïntegreerde myth of immy de methode van voorkeur. In Imy worden Bates endogeen getagd met een CUB Lex a VP 16-tag, waardoor ze onder controle blijven van hun eigen promoter.

Dit is voordelig, aangezien het wildtype-expressieniveau van Bates helpt bij het elimineren van problemen die gepaard gaan met eiwit-overexpressie, zoals een verhoogd aantal fout-positieven voor niet-natieve gisteiwitten; traditionele myth of T myth kan worden gebruikt waarbij CU B Lex A V VP 16 tag bait worden ectopisch overgeëxprimeerd vanuit een plasmide. In dit protocol richten we ons op T myth, aangezien deze vorm van myth breder toepasbaar is; met uitzondering van de initiële constructie van de bait en de gebruikte media worden beide vormen van myth op een in essentie identieke wijze uitgevoerd. De bait moet worden gekloond in een geschikte vector voor tagging en expressie.

Er zijn momenteel diverse T myth-vectoren beschikbaar, zoals BV four, p, a, BV four en PCM BV four, waarmee c-terminaal getagde Bates, Beit Cub Lexie, VP 16 kunnen worden geconstrueerd onder controle van respectievelijk een zeer sterke TF one, sterke A DH one en zwakke CYC one-promotor. Zodra de team-effector is geselecteerd, wordt het plasmide met restrictie-enzymen verteerd op de juiste restrictieplaats. De splitsing moet uitsluitend plaatsvinden in de directe nabijheid van de CU B Lxe VP 16-tag, stroomopwaarts van de tag voor c-terminale tagging of stroomafwaarts voor n-terminale tagging.

Wanneer de PAM BV-vector wordt gebruikt, is SFI one bijvoorbeeld een ideale keuze. Nadat het plasmide is gedigesteerd en bij -20 °C is bewaard tot het gebruik, is de volgende stap het ontwerpen van primers voor de amplificatie en klonering van het gen van interesse. Het 5'-uiteinde van de forward primer moet overeenkomen met ongeveer 35 tot 40 nucleotiden stroomopwaarts van de restrictieplaats. Het 3'-uiteinde moet overeenkomen met de eerste 18 tot 20 nucleotiden van het doelgen, in dit geval DRB 2, dat codeert voor de bèta 2 generieke receptor.

In ons voorbeeld moet het 5'-uiteinde van de reverse primer overeenkomen met het reverse complement van ongeveer 35 tot 40 nucleotiden stroomafwaarts van de restrictieplaats. Met het 3'-uiteinde dat overeenkomt met het reverse complement van de laatste 18 tot 20 nucleotiden van het doelgen, waarbij de stopcodon wordt weggelaten als de CUB Lex say VP 16-tag aan de C-terminus wordt geplaatst zoals in het getoonde voorbeeld, dient u — afhankelijk van of N- of C-terminale tagging wordt uitgevoerd — ervoor te zorgen dat de geselecteerde 35 tot 40 nucleotiden van de plasmidsequentie die in de forward of reverse primer worden gebruikt, resulteren in het klonen van het doelgen in frame met de CU B Lex, a VP 16-tag. Aangezien in ons voorbeeld de C-terminus van het A DRB twee-eiwit zal worden getagd.

De 35 basen van een MBV-sequentie in de reverse primer zijn zo gekozen dat de A DRB twee- en CUB-gensequenties zich in hetzelfde leesraam bevinden; amplificeer het gen van belang via PCR met behulp van de geselecteerde primers. De PCR-parameters zijn afhankelijk van het specifieke enzym en de gebruikte specifieke primers om een omgeving te creëren waarin gap repair homologe recombinatie kan plaatsvinden. Het eerder gedigesteerde plasmide en het geamplificeerde gen van belang worden getransformeerd in een geschikte giststam met behulp van een standaard gisttransformatieprotocol, zoals beschreven door geets en woods.

Zodra de getransformeerde gist op de plaat is gegroeid, wordt een enkele kolonie van de stam opgepikt en geinoculeerd in vijf milliliter SD minus leucine. De vloeibare media worden gedurende één nacht bij 30 °C gekweekt totdat de cultuur is gegroeid en verzadiging heeft bereikt. Centrifugeer de cellen bij 700 ×g gedurende vijf minuten en verwijder het supernatant. Isoleer het bait-plasmid-DNA uit de celpellet met behulp van een willekeurige commerciële mini-prepkit.

Volg het standaardprotocol met één aanpassing om voldoende lysis van de gistcellen te waarborgen: voeg bij een klein volume van 0,5 millimolar soda lime glasparels toe aan het pellet na de initiële resuspensie en vortex krachtig gedurende vijf minuten. Ga vervolgens verder volgens het commerciële protocol. Transformeer het geïsoleerde gist-DNA in een chemisch competente e coli-stam die geschikt is voor plasmidpropagatie, met een transformatie-efficiëntie van ten minste 1 × 10⁷ cellen per µg DNA.

Nadat het plasma-DNA uit de getransformeerde e coli is geoogst, dient de correcte constructie van het bait-plasmide door middel van sequencing te worden geverifieerd voordat het wordt gebruikt. De bait-stammen moeten worden geanalyseerd om te garanderen dat de bait-eiwitten correct gelokaliseerd zijn in het gistmembraan. De lokalisatie wordt bepaald met behulp van fluorescentiemicroscopie. De inclusie van een YFP-molecuul in de bait-tagsequentie maakt directe visualisatie van levende cellen mogelijk en wordt veelvuldig gebruikt in imy.

Als alternatief kan, nadat de juiste lokalisatie van het lokaas is vastgesteld, een standaard immunofluorescentie-aanpak worden gebruikt met een antilichaam tegen de Lex A- of VP 16-componenten van de tag. Het is noodzakelijk om te controleren of het lokaas niet zelfactiverend is, oftewel dat het het reportersysteem niet alleen of in de aanwezigheid van niet-interacterende prooien activeert; om te garanderen dat het lokaas niet zelfactiverend is, passen we de N-U-B-G-I-test toe. In deze test.

Het lokaas wordt getransformeerd met interagerende positieve en niet-interagerende negatieve controle-prooien, waarna verschillende verdunningen van elke transformant op geschikte selectieve media worden gespot. Het lokaas moet groeien op selectieve media in aanwezigheid van de positieve controle en mag niet groeien in aanwezigheid van de negatieve controle om geschikt te zijn voor gebruik in de gist-twee-hybride-analyse. Zodra het lokaas is gevalideerd, kan de reporterstam voor de gist-twee-hybride-analyse die het lokaas bevat, worden getransformeerd met een prooisubstroom van belang om te screenen op eiwit-eiwitinteracties.

Om te beginnen met deze grootschalige gisttransformatie, inoculeert u een enkele kolonie van de myth-reporterstam die uw bait bevat in vijf milliliter SD-medium minus leucine en incubeert u dit gedurende de nacht bij 30 °C onder schudcondities. Verdun de overnight-cultuur in 200 milliliter SD-medium minus leucine en incubeer dit bij 30 °C onder schudcondities totdat een OD 600 van 0,6 tot 0,7 wordt bereikt. Wanneer de doelse OD 600 is bereikt, verdeelt u de 200 milliliter cultuur over vier centrifugebuizen van 50 milliliter met schroefdop en oogst u de cellen via centrifugatie.

Na het wassen van de pellets met steriel dubbel gedestilleerd water en lithiumacetaat-trissy DTA-oplossing, suspenderen we elke pellet in 600 µL lithiumacetaat-trissy DTA-oplossing in elk van vier 15 mL schroefdoppen-centrifugeebuizen. Voeg 2,5 mL PEG-lithiumacetaatoplossing toe aan de 600 µL resuspenderde cellen, 100 µL zalm-sperm-DNA-oplossing en zeven µg prey-library-DNA. Schud de buizen gedurende één minuut om een grondige menging te waarborgen en incubeer ze vervolgens 45 minuten in een waterbad van 30 °C.

Meng kort elke 15 minuten na de incubatie van 45 minuten. Voeg 160 µL dimethylsulfoxide of DMSO toe aan elke buis en meng onmiddellijk door de buizen te inverteren. Incubeer 20 minuten in een waterbad van 42 °C.

Wanneer de hittebehandeling is voltooid, worden de cellen verzameld door centrifugatie en geresuspendeerd. Suspendeer elk van de pellets in drie milliliter tweevoudig Y-P-A-D. Breng alle monsters samen in één enkele centrifugebuis van 50 milliliter met schroefdop.

Incubeer de cellen 90 minuten bij 30 °C voor herstel van de cellen. Centrifugeer de cellen en resuspendeer de celpellet in 4,9 ml steriele 0,9% natriumchloride met behulp van 100 µL geresuspendeerde cellen. Bereid een tienvoudige seriële verdunning in steriele 0,9% natriumchloride variërend van 10x tot 10.000x; breng 100 µL van de 100x en 1000x verdunning aan op selectieve media en incubeer dit twee tot drie dagen bij 30 °C.

Deze platen dienen als controle en worden gebruikt om de efficiëntie van de transformatie op dezelfde wijze te berekenen. Verdeel de resterende 4,8 milliliters van de resuspenderde cellen over grote 150 millimeter platen en incubeer deze gedurende drie tot vier dagen bij 30 °C. Zodra de kolonies zijn gegroeid, worden individuele kolonies, die elk cellen bevatten met een potentieel interagerend bait-prey-paar, geresuspendeerd in 100 µL van 0,9% natriumchloride; breng vervolgens aliquots van vijf µL aan op selectieve media met XG en laat deze slechts twee tot vier dagen groeien.

Kolonies die een robuuste groei en een blauwe kleur vertonen, worden geselecteerd voor verdere analyse. Na het isoleren en sequencen van de plasmiden uit de positieve gistkolonies, worden alle sequencinggegevens verzameld en geanalyseerd om de voorlopige lijst van interactoren op te stellen. Om deze interacties opnieuw te controleren, wordt de bait-afhankelijkheidstest toegepast.

Bij deze test worden alle prey-plasmiden die de geïdentificeerde interactors tot expressie brengen, teruggetransformeerd in zowel de oorspronkelijke bait-stam als in de stam met een controle-artificiële bait, bestaande uit een enkel transmembraandomein gefuseerd aan de CUB Lex, een VP 16-tag. Resuspendeerde enkelkolonies van deze transformaties in 100 µL steriel dubbel gedestilleerd water en spot volumes van 5 µL op de juiste selectieve media plus X sc. Idealiter moeten er meerdere transformanten worden geselecteerd voor elke prey, en moeten zowel de oorspronkelijke bait als de artificiële bait op dezelfde plaat worden gespot. Incubeer de platen twee tot vier dagen bij 30 °C. Gisten die de artificiële bait dragen in prey die activatie van het reportersysteem veroorzaken, worden beschouwd als promiscuös en die specifieke prey wordt uit de lijst van interactors verwijderd.

Bevestig de groei en blauwe kleur bij de gist met het aas van interesse, maar niet bij het kunstmatige aas. Bevestig hiermee een specifieke interactie. Indien de gist die de prooi en uw aas van interesse bevatten echter niet groeien.

Deze prooi wordt uit de lijst met interactoren verwijderd. De overgebleven prooien vormen de volledige lijst van interactoren die in het myth-screen zijn geïdentificeerd. Na voltooiing van de myth-procedure beschikt u over een interactoomkaart.

Dit vormt een verzameling van potentiële interacties die de onderzoeker verder moet analyseren aan de hand van specifieke studies die per geval worden bepaald. Om de biologische significantie van elk van deze interacties te beoordelen, hebben we zojuist gedemonstreerd hoe de membraan E2-hybride- of MYTH-procedure moet worden uitgevoerd om interactiepartners van een eiwit van belang te identificeren. Bij het uitvoeren van de MYTH-procedure is het belangrijk om te verifiëren of het eiwit van belang zijn N- en/of C-terminus in het cytosol van de cel heeft, en om de tagging-strategie dienovereenkomstig te ontwerpen.

Bovendien is het belangrijk om zorgvuldig vast te stellen of uw bait-stammen het bait-eiwit correct tot expressie brengen en of het bait-eiwit correct gelokaliseerd is. Daarnaast is het belangrijk om de NUB GI Controle-test uit te voeren, aangezien dit nuttig is bij het vaststellen van de screeningscondities. Verifieer tot slot alle interacties die u met behulp van myth detecteert onafhankelijk.

Het volgen van deze eenvoudige stappen zou ervoor moeten zorgen dat u de best mogelijke resultaten uit de myth-procedure behaalt. Dat was het. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.