Pulse-chase analyse van N-gebonden suikerketens van glycoproteïnen in zoogdiercellen

De analyse van de ongebonden suikerketens op glycoproteïnen begint met de markering van de glycanen en cellen met tritiërend mannose. De pulse-schaal wordt op ijs gekoeld, terwijl de chase-schaal gedurende een gewenste chase-periode wordt geïncubeerd zonder markering. Vervolgens worden de monsters gelyseerd, wordt een glycoproteïne van belang immunogezuiverd en gedenatureerd, en worden de glycanen enzymatisch vrijgemaakt.

De oligosachariden worden verder gezuiverd door moleculaire filtratie, waarmee ze worden gescheiden van de eiwitten en andere verontreinigingen groter dan 30 kilodalton. De glycanen worden vervolgens gescheiden via HPLC. De hoeveelheid van elke glycaanvorm wordt bepaald door de intensiteit van het radioactieve signaal in elke geëlueerde fractie te meten.

Hallo, ik ben Edward Azo van het laboratorium van Hi Geraldo Letter Kremer van de afdeling Celonderzoek en Immunologie aan de Tel Aviv University. Ik ben ook verbonden aan het Gerardo Letter Kremer Slab. Vandaag laten we u een procedure zien voor het isoleren en analyseren van metabolisch gelabelde en gekoppelde oligosachariden.

Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de dynamiek van de verwerking van suikerketens te bestuderen voor zowel totale cellulaire glycoproteïnepools als individuele glycoproteïnen. Oké, laten we nu beginnen. Om deze procedure te starten, gebruikt u NIH 3T3-cellen die gedurende één nacht zijn gekweekt in een schaal van 90 mm.

Voor elk monster is de cultuur subconfluënt om de cellen glucose te onthouden; bereid vers tweemaal glucosevrij medium voor, aangevuld met 20% gedialyseerd FCS en acht millimolar natiumpyruvaat. Verdun één volume van de gewenste hoeveelheid tweemaal medium met één volume gedeïoniseerd water. Verwarm het medium voor en incubeer vervolgens elk celmonster in vijf milliliter van het verse voorverwarmde medium gedurende vijf tot 15 minuten. Indien chase-perioden langer dan 12 uur vereist zijn, moeten de cellen onder steriele omstandigheden worden behandeld.

Markeer aan het einde van de incubatieperiode de schalen die overeenkomen met de pulse- en chase-monsters. Om de N-glycanen te labelen voor glycoproteinanalyse via immunoprecipitatie, vervangt u het uithongeringsmedium door één milliliter voorverwarmd glucosevrij medium aangevuld met 400 microcuries per milliliter tritiumgelabelde mannose. Gebruik 65 microcuries per milliliter voor de labeling en analyse van totale glycoproteïnen.

Nadat het uithongeringsmedium is vervangen, worden de cellen gedurende één uur geïncubeerd onder normale kweekcondities. Aan het einde van de incubatie van één uur wordt het labelingsmedium uit alle monsters verwijderd. Voeg voorzichtig twee milliliter PBS bij vier graden Celsius toe aan de monsters die bestemd zijn voor de pulse-fase en plaats deze op ijs. Deze monsters worden aangeduid als pulses.

Gebruik twee milliliters voorverwarmd normaal compleet kweekmedium om de chase-monsters drie keer te spoelen. Voeg vervolgens vijf milliliters van het voorverwarmde reguliere medium toe aan de cellen.

Plaats de chase-monsters in een kooldioxide-incubator bij 37 °C voor de gewenste chase-perioden. Spoel tijdens de incubatie van de chase-monsters de pulse-monsters, die op ijs waren achtergelaten, drie keer af met 2 mL ijskoud PBS. Gebruik vervolgens een celscraper om de cellen van de kweekschaal af te schrapen.

Breng de vrijgekomen cellen in 2 mL PBS over naar een EOR-buis van 2 mL. Centrifugeer de cellen bij 16.000 ×g gedurende 6 tot 10 seconden om het supernatant te scheiden en vries de celpellet in bij -80 °C. Spoel de chase-monsters wanneer de incubatie is voltooid.

Centrifuge en bewaar ze zoals zojuist getoond voor de pulsmonsters. Wanneer u klaar bent om door te gaan met de cellyse, haalt u de cellen uit de vriezer. Voor de IP-analyse lyseert u de cellen door 300 µL buffer toe te voegen.

Vortex kortstondig en incubeer 20 minuten op ijs. Voor analyse van de monsters van totale glycoproteïnen bij 300 µL buffer B. Incubeer de cellen 20 minuten op ijs, gevolgd door sonicatie vier keer, telkens 10 seconden bij maximale amplitude. Kook de monsters vervolgens vijf minuten.

Centrifugeer tot slot alle lysaten 20 minuten bij 16 000 Gs bij vier graden Celsius. Breng het supernatant over naar een nieuwe EOR-buis en verwijder de pellet. Ga over tot IP om een eiwit van belang te onderzoeken voor immunoprecipitatie van het hier gedemonstreerde H two A-glycoproteïne.

Voeg 20 µL per monster proteïne A/G-beads en 3 µL per monster van het rabbit polyclonal anti-H2A-antilichaam van het laboratorium toe aan het supernatant van de gelyseerde cellen. Incubeer de monsters gedurende 4 tot 16 uur bij 4 °C, waarbij constant wordt gemengd door langzame rotatie. Centrifugeer aan het einde van de incubatie de beads en verwijder voorzichtig het supernatant met een vacuüm; spoel de beads vier keer door 500 µL buffer T toe te voegen.

Centrifuge de kralen kort om deze neer te slaan en verwijder het supernatant om de gebonden eiwitten van de kralen los te maken. Voeg 10 µL denatureringsbuffer uit de endo H kit toe aan de kralpellet en kook de monsters gedurende vijf minuten. Centrifugeer de kralen en breng het supernatant over naar een nieuwe EOR-buis.

De ellu-proteïnen zijn nu klaar voor deglycosylering. De glycanen worden vrijgemaakt uit zowel de IP- als de totale proteïnemonsters met behulp van het enzym en OH. Voeg voor de IP-monsters 0,5 µL endo H-enzym toe aan elk monster, samen met 10 µL van de twee x endo H-reactiebuffer. Incubeer de monsters gedurende drie uur bij 37 °C.

Breng voor totale glycoproteïnen het supernatant van de cellysaten aan op een MicroCon-filter met een afsnijwaarde van 30 kilodalton. Was het totale eiwitextract drie keer met 100 µL buffer E door herhaalde centrifugatie bij 14.000 ×g. Voeg na drie minuten drie µL van de 10 x endo H reactiebuffer en 1,5 µL van het endo H-enzym toe aan de MicroCon waar de gewassen eiwitten achterblijven, en incubeer dit gedurende drie uur bij 37 °C samen met de IP-monsters.

Verdun na het einde van de incubatie van drie uur het IP-monster vijfmaal met gedeïoniseerd water, plaats dit op een nieuw MicroCon-filter en centrifugeer 3 minuten bij 14,000 Gs. Was vervolgens zowel de IP- als de totaalproteïnemonsters door 50 µL gedeïoniseerd water toe te voegen en de monsters te centrifugeren. Herhaal dit nog twee keer. Bewaar indien gewenst het filtraat dat de gesplitste glycanen bevat in buisjes met endo H. De endo H-resistente glycoproteïnen worden vervolgens 16 uur geïncubeerd met 200 mU N-glycosidase F in 15 µL buffer C bij 37 °C.

Elutie met gedeïoniseerd water wordt uitgevoerd zoals zojuist getoond. Droog de monsters volledig met een speed vac concentrator bij een temperatuur tot 45 °C om het proces te versnellen. Resuspendeer de droge pellets in 12 µL van het HPLC-oplosmiddel en breng de monsters aan op een sphe- of aminokolom die is geïnstalleerd in het HPLC-apparaat.

Voer de monsters uit zoals beschreven in het bijbehorende geschreven protocol. Verzamel 48 fracties voor elke monsteranalyse. Gebruik een scintillatieteller om de CPM-waarden van de verzamelde fracties te meten en zet de CPM-uitlezing uit tegen het fractienummer.

Bereken het percentage manose-residuen van alle glycaansoorten zoals beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol. Hier volgen representatieve resultaten van de suikerketenanalyse van totale glycoproteïnen uit een monster met een pulse-labeling van één uur. De CPM-uitlezing van de HPLC-fracties is in het resulterende profiel uitgezet als functie van het fractienummer.

Elke piek vertegenwoordigt een specifieke glycaansoort die is geïdentificeerd door een HPLC-run van bekende glycaanstandaarden. Voor elke glycaansoort wordt het molaire percentage van de totale glycanen uitgezet als functie van de chase-tijd. Hier wordt een dergelijke analyse getoond voor een specifiek misvouwen glycoproteïne dat door immunoprecipitatie is geïsoleerd uit een monster dat is behandeld met de proteasoomremmer MG 1 32.

De getrimde glycaansoort M five six hoopt zich op tijdens de chase-periode, wat leidt tot de conclusie dat oligosachariden op een verkeerd gevouwen eiwit een uitgebreide mannose-trimming ondergaan voorafgaand aan de degradatie. Dit staat in contrast met de oligosachariden op totale glycoproteïnen uit monsters die op dezelfde wijze zijn behandeld. Hier blijft M nine eight de belangrijkste glycaansoort tijdens de chase, met slechts een geringe toename van de hoeveelheid M five six. Dit leidt tot de conclusie dat slechts een klein deel van de totale pool aan glycoproteïnen wordt gericht op ER-geassocieerde proteïndegradatie.

Afgekort rad. Zoals verder wordt uitgelegd in het bijbehorende schriftelijke protocol, hebben we zojuist gedemonstreerd hoe een combinatie van pulse-labeling in levende cellen en HPLC-analyse kan worden gebruikt om de dynamiek van de compositie van ongebonden oligosachariden tijdens de levensduur van een glycoproteïne te volgen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te voorkomen dat chase-monsters besmet raken met sporen van radioactieve monomeren, aangezien dit zal leiden tot ongewenste labeling van de glycanen tijdens de chase-periodes tijdens de grootte-scheiding.

Het is ook belangrijk om de HPLC in te stellen op een constante druk om de consistentie van de glycaanfractionering te waarborgen. Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.