Name: SDS-PAGE/Immunoblot Detectie van Aß multimeren in Human Corticale weefselhomogenaten met behulp van antigeen-epitoop (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-23T04:53:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Leer Aβ-multimeren detecteren in menselijk corticaal weefsel met SDS-PAGE en immunoblotting. Deze methode combineert weefselhomogenisatie, eiwitscheiding en antigeen-epitoopretrieval voor betrouwbaar onderzoek naar Alzheimer-pathologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Veel dank aan Elaine Pranski en Carolyn Suwyn voor een uitstekende technische bijstand en Harry LeVine III, M. Paul Murphy, en Marla Gearing voor belangrijke gesprekken. De financiering werd verstrekt door RR-00165, PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, de Woodruff Foundation en de Emory University Research Committee.

Deel 1: Voorbereiding van verduidelijkt weefsel homogenaten <ol><li> Dounce homogeniseren niet vastgelegde corticale weefsel in 4 keer het volume van ijskoude buffer (0,1 M fosfaat-gebufferde zoutoplossing [Ca + + - en Mg + +-free] plus 2x proteaseremmer cocktail [Santa Cruz]) met ongeveer 30 zelfs pestle slagen (dat wil zeggen toe te voegen 400μl buffer tot 100 mg weefsel). </li><li> Spin homogenaten gedurende 5 minuten bij 3000 g (4 ° C). Verwijder voorzichtig verduidelijkt supernatants en op te slaan fracties van deze producten bij -80 ° C tot gebruik. </li><li> Het vaststellen van totaal eiwit concentratie (ng / pl) voor verduidelijkt homogenaten met behulp van een bicinchoninic zuur (BCA) test, volgens de instructies van de fabrikant (ThermoFisher). </li></ol> Deel 2: SDS-PAGE Voorbereiding van het monster <ol><li> Met een 10 goed, 10-20% Tricine gel (Invitrogen), het maximale volume dat kan worden geladen per goed is ~ 25μl. Het totale volume omvat 2x SDS sample buffer en 10x reductiemiddel, zodat het maximale volume van homogenaat verduidelijkt dat kan worden geladen per goed 10μl is. Geklaarde 20% (w / v) corticale homogenaten moeten een totale eiwit concentratie groter dan 5 ug / ul, waardoor 50 microgram totaal eiwit per putje. Monsters met minder dan 5mg/ml eiwit zal het nodig zijn het laden van minder totaal eiwit per putje. Echter, een hoog eiwit-niveaus zijn optimaal voor de detectie van monomere en geaggregeerde Aß (50-60μg totaal eiwit is optimaal). Laad altijd dezelfde hoeveelheid totaal eiwit per putje. </li><li> Voor elke gel, belasting ten minste een goed met 10μl met een molecuulgewicht merker zoals SeeBlue Plus2 (Invitrogen). Als een positieve controle, run 10-100ng van synthetische Aβ40 of Aβ42 peptide (verdund in 1xPBS) in een ander goed. </li><li> Bereid reactiemengsels op het ijs, met behulp van vers ontdooide, verduidelijkt homogenaten. Vortex buizen voor 5-10 seconden, warmte in een droge bad bij 100 ° C gedurende 5 minuten, dan snel draaien alle monsters om condensatie te verwijderen in de dop. </li></ol> Deel 3: SDS-PAGE gel elektroforese <ol><li> Laad gevortexed monsters op een 10-20% Tricine gel in het XCell Sure Lock Mini-Cell Gelbox, met behulp van Tricine SDS loopbuffer, volgens de instructies van de fabrikant (Invitrogen), </li><li> Draaien gel met een constante spanning van 125V voor ongeveer 90 minuten. Laat monsters lopen tot de 4KDa marker band is ongeveer 1 cm van de onderkant van de gel. </li></ol> Deel 4: overbrengen eiwitten uit Gels naar Membranen <ol><li> Verwijder voorzichtig gels van de plastic behuizing en monteer de overdracht sandwich in de XCell II Blot Module, volgens de instructies van de fabrikant (Invitrogen). Pre-nat blotting pads en 0.2μm nitrocellulose membranen met Tris-Glycine overdracht buffer (20% methanol), en verwijder eventuele luchtbellen uit blotting pads of het filterpapier / membraan sandwich. </li><li> In de XCell Gelbox, vul de binnenste kamer met transfer buffer en vul de buitenste kamer met dih 2 O (methanol blootstelling kan slijten de kunststof gelbox loop van de tijd). </li><li> Voer de transfer voor 2-3 uur bij een constante stroomsterkte van 25 mA. </li><li> Wanneer de overdracht is voltooid, deconstrueren de sandwich en zet de gels in dih 2 O en de membranen in 1xPBS, zowel in vierkante plastic petrischaaltjes (of een andere geschikte container). </li><li> Te visualiseren van de efficiëntie van eiwit transfer, kan gels worden gekleurd met Simply Blue SafeStain (Invitrogen), en de membranen met rode vlek Ponceau S (Aldrich Sigma), beide volgens de instructies van de fabrikant. Deze vlekken hebben geen invloed op immunoblotting. Als vlekken onthult inefficiënt eiwit dragen, te wijzigen overstaptijd in stap 3. </li></ol> Deel 5. Antigeen-epitoop &amp; Immunoblotting <ol><li> Antigen herstel is een belangrijke stap in het openbaren van de Aß epitopen op het membraan voor antilichaambinding tijdens immunoblotting. Elke steamer, magnetron, of een waterbad dat een constante temperatuur van 100 ° C houdt voldoende. Voor antigeen ophalen in een steamer, warmte-seal het membraan in een heavy-duty Kapak plastic zakje gevuld met 1xPBS, bij kamertemperatuur. Leg het zakje flat in een voorverwarmde stomer, eenmaal het zakje begint uit te breiden, voor een extra 15 minuten incuberen. Laat het membraan langzaam afkoelen voordat u deze uit het zakje, om buitensporige rimpelen te voorkomen. </li><li> Bij kamertemperatuur, verwijder voorzichtig het membraan uit de dampende zak en spoel het membraan gedurende 5 minuten in 1xPBS, gevolgd door een 5-minuten spoelen in TBS-T (Tris-gebufferde zoutoplossing, pH 8,0 met 0,05% Tween-20 [Sigma] ), op een rondschudapparaat. Incubeer het membraan in het blokkeren van oplossing (2,5% magere melk in TBS-T) gedurende een uur, schudden. Zonder spoelen, overdracht membraan tot een gerecht of een plastic zakje met het primaire antilichaam verdund in het blokkeren van oplossing (6E10 op 1:1000 [1μg/ml] 1:5000 [0.2μg/ml] verdunning, Covance), het vermijden van Bubbles. Incubeer op een rondschudapparaat bij kamertemperatuur gedurende een uur en daarna 24-48 uur schudden bij 4 ° C (langere incubatietijd kan een beter signaal te geven). </li><li> Spoel het membraan gedurende 30 minuten in TBS-T (een snelle spoelen, gevolgd door 3 x 10 minuten spoelingen). </li><li> Incubeer het membraan in de HRP-geconjugeerd secundair antilichaam (Amersham ECL schapen anti-muis, GE Healthcare), verdund tot 1:10.000 in het blokkeren van oplossing, gedurende 90 minuten op de shaker bij kamertemperatuur. </li><li> Spoel het membraan gedurende 30 minuten in TBS-T (een snelle spoelen, gevolgd door 3 x 10 minuten spoelingen). </li><li> Op de shaker, incubeer het membraan in vers gemaakte SuperSignal West Pico Electrochemiluminescence reagens (ThermoFisher) gedurende 5 minuten, blot overtollige reagens op pluisvrije filtreerpapier en plaats het membraan in een film cassette, tussen de plastic plaat beschermers. Blot off extra SuperSignal reagens met stofvrij Kimwipes indien nodig. </li><li> Blootstellen aan Kodak Biomax MR film voor intervallen van 30 seconden tot 30 minuten en ontwikkelen in een film ontwikkelaar. Na 5 minuten zal het Aß monomeer bands waarschijnlijk verzadigd. </li><li> Membranen kunnen worden gestript (na het spoelen in TBS-T) door schudden in Restore Plus strippen buffer gedurende 30 minuten op kamertemperatuur en reprobed met extra antistoffen indien gewenst. </li></ol> Deel 6: Vertegenwoordiger immunoblot: <img src="/files/ftp_upload/1916/1916fig1a.jpg" alt="Figuur 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1a"> <img src="/files/ftp_upload/1916/1916fig1b.jpg" alt="Figuur 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1b"> <img src="/files/ftp_upload/1916/1916fig1c.jpg" alt="Figuur 1c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1c"> Figuren 1a-c. Geklaarde homogenaten met 50 microgram hoeveelheid eiwit uit zeven proefpersonen worden geanalyseerd op de aanwezigheid van multimere Aß en APP. Immunoblotting met antilichaam 6E10 onthult Aß monomeren, dimeren, trimeren, tetrameren, en APP (top band) in alle gevallen de ziekte van Alzheimer, evenals overvloedige hoger molecuulgewicht Aß multimeren in 2 AD gevallen. Synthetische Aβ40 bevestigt de identiteit van de lager moleculair gewicht bands. AD: de ziekte van Alzheimer, DLB: dementie met Lewy bodies, ND: niet-demente mens (a) 30 minuten durende film blootstelling, (b) 5 minuten durende film blootstelling, (c) 30 seconden film blootstelling..

<ol><li>Hardy, J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer%27s+disease%3A+progress+and+problems+on+the+road+to+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics.</a> Science. 297, 353-356 (2002).</li>
<li>Haass, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+protein+oligomers+in+neurodegeneration%3A+lessons+from+the+Alzheimer%27s+amyloid+beta-peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).</li>
<li>Walker, L. C., LeVine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cerebral+proteopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">The cerebral proteopathies.</a> Neurobiol. Aging. 21, 559-561 (2000).</li>
<li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+amyloid%2C+and+Alzheimer%27s+disease%3A+a+perspective+in+honor%5BTitle%5D)+AND+%22of+Carl+Cotman.+Neurochem.+Res%22%5BJournal%5D)">Aging, amyloid, and Alzheimer's disease: a perspective in honor.</a> of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).</li>
<li>Walsh, D. M., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abeta+oligomers+-+a+decade+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Abeta oligomers - a decade of discovery.</a> J. Neurochem. 101, 1172-1184 (2007).</li>
<li>Swerdlow, P. S., Finley, D., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+immunoblot+sensitivity+by+heating+of+hydrated+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters.</a> Anal. Biochem. 156, 147-153 (1986).</li>
<li>Ida, N., Hartmann, T., Pantel, J., Schröder, J., Zerfass, R., Förstl, H., Sandbrink, R., Masters, C. L., Beyreuther, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+hetergeneous+A4+peptides+in+human+cerebrospinal+fuid+and+blood+by+a+newly+developed+sensitive+Western+blot+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of hetergeneous A4 peptides in human cerebrospinal fuid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay.</a> J. Biol. Chem. 271, 22908-22914 (1996).</li>
</ol>

Ondanks het belang van Aß aggregatie in de pathogenese van de ziekte van Alzheimer 1,4,5, hebben weinig studies beschreven of gekwantificeerd de distributie van diverse Aß multimeren in menselijke corticale weefselmonsters 2. Veelgebruikte immunohistochemische technieken niet mogelijk voor de discriminatie van verschillende soorten multimere Aß in vaste corticale weefsel. In losgemaakte corticale weefsel homogenaten, kan Aß multimeren worden gescheiden en biochemisch beoordeeld met behulp van gelel...

<table><tbody><tr><td>Complete Protease Inhibitor Cocktail Tabletten</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-29130</td><td>1 tablet in 25ml buffer</td></tr><tr><td>BCA Protein Assay kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark</td><td>Invitrogen</td><td>EI0002</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS Sample Buffer (2X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC1676</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard</td><td>Invitrogen</td><td>LC5925</td><td></td></tr><tr><td>Novex 10-20% Tricine Gel 1,0 mm, 10 wells</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625BOX</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membranen, 0,2 &amp;mu;m poriegrootte</td><td>Invitrogen</td><td>LC2000</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS Running Buffer (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC1675</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td> interfereert niet met immunostaining</td></tr><tr><td>ATX Ponceau S Red kleuringsoplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09276</td><td> interfereert niet met immunostaining</td></tr><tr><td>Kapak hitte-afdichtbare plastic monsterzakjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>0181225AA</td><td></td></tr><tr><td>6E10 muis monoklonaal antilichaam tegen A&amp;#946;(1-16)</td><td>Covance</td><td>SIG-39320</td><td>Verdun 1:1.000 tot 1:5.000 voor WB</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>ECL Muis IgG, HRP-gekoppeld Whole A&amp;#946; (van schaap)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-1ML</td><td>Verdun op 1:10.000</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substraat</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>34077</td><td></td></tr><tr><td>Kodak Biomax MR Film</td><td>Carestream Health</td><td>870 1302</td><td></td></tr></tbody></table>

sds-page/immunoblot detectie van aß multimeren in human corticale weefselhomogenaten met behulp van antigeen-epitoop

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&beta; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

De abnormale vouwen en polymerisatie van de β-amyloïde (Aß) peptide is gedacht aan de neurodegeneratieve cascade bij de ziekte van Alzheimer pathogenese starten<sup&gt; 1</sup&gt;. Aß is voornamelijk een 40 - of 42-aminozuur peptide die gevoelig is voor zelf-aggregatie in de β-sheet-rijke amyloid fibrillen die gevonden worden in de kernen van cerebrale seniele plaques in de ziekte van Alzheimer. Steeds meer aanwijzingen dat een laag moleculair gewicht, oplosbare Aß multimeren giftiger zijn dan fibrillair Aß amyloid<sup&gt; 2</sup&gt;. De identificatie en kwantificatie van laag-en hoog moleculair gewicht multimere Aß soorten in hersenweefsel is een essentiële doelstelling bij de ziekte van Alzheimer onderzoek, en de methoden die ook gebruikt kunnen worden toegepast op de identificatie en karakterisatie van giftige multimeren in andere proteopathies<sup&gt; 3</sup&gt;. Natuurlijk voorkomende Aß multimeren kan worden gedetecteerd door SDS-polyacrylamide gel elektroforese, gevolgd door immunoblotting met Aß-specifieke antilichamen. Echter, de scheiding en detectie van multimere Aß vereist het gebruik van sterk geconcentreerde corticale homogenaten en antigen retrieval in kleine poriegrootte nitrocellulose membranen. Hier beschrijven we een techniek voor de bereiding van menselijke verduidelijkt corticale homogenaten, scheiding van eiwitten door SDS-PAGE, en antigeen-epitoop / Western blotting met antilichaam 6E10 van de N-terminale gebied van het Aß peptide. Met behulp van dit protocol, we consequent te sporen Aß monomeren, dimeren, trimeren, tetrameren en hoger molecuulgewicht multimeren in corticale weefsel van mensen met de ziekte van Alzheimer pathologie.

Beschrijven we een techniek voor de bereiding van menselijke verduidelijkt corticale homogenaten, eiwit scheiding door SDS-PAGE, antigen retrieval en immunoblotting met een antilichaam tegen het Aß peptide. Met behulp van dit protocol, wij consequent te sporen monomere en multimere Aß in corticale weefsel van mensen met de ziekte van Alzheimer pathologie.

SDS-PAGE/Immunoblot Detectie van Aß multimeren in Human Corticale weefselhomogenaten met behulp van antigeen-epitoop

Men gaat ervan uit dat de anomale vouwing en polymerisatie van het bèta-amyloïde (Aβ) peptide de neurodegeneratieve cascade bij Alzheimer initieert ...

Dit protocol maakt de detectie van beta-malters in menselijk corticaal weefsel mogelijk. Eerst wordt het gehomogeniseerde weefsel via probe-sonificatie behandeld en geklaard door middel van centrifugatie op lage snelheid. Vervolgens worden de gereduceerde monsters gekookt in SDS-buffer en geladen op een polyacrylamidegel.Gelproteïnen worden overgebracht op een nitrocellulosemembraan en het membraan wordt met stoom verhit in fosfaatgebufferde zoutoplossing. Vervolgens wordt het membraan op een orbitale schudmachine een nacht geïncubeerd in een primaire antilichaam, daarna in een HRP-geconjugeerd secundair antilichaam en ten slotte in een luminaal peroxide-reagens vóór blootstelling aan röntgenfilm. Hallo, ik ben Rebecca Rosen van het laboratorium van Larry Walker van de afdeling Neurowetenschappen aan het Yerkes National Primate Research Center van de Emory University.Vandaag laten we u zien hoe u Abeta-multimeren en corticale homogenaten kunt detecteren met behulp van SDS-gelelektroforese en immunobloting met hitte-geïnduceerde antigeenherwinning. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de niveaus en distributie van verschillende Abeta-multimeren te bestuderen in ongefi

sds-pageimmunoblot-detection-multimers-human-cortical-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De omkeerbare toevoeging van palmitaat aan eiwitten is een belangrijke regulator van intracellulaire eiwitten mensenhandel. Dit is van bijzonder belang in neuronen waar veel synaptische eiwitten gepalmitoyleerd. We gebruiken een eenvoudige biochemische methode gepalmitoyleerd eiwitten in gekweekte neuronen, die kunnen worden aangepast voor meerdere celtypes en weefsels.

Detectie van eiwit palmitoylering in gekweekte hippocampale neuronen door immunoprecipitatie en Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Een gemeenschappelijke eiwitextractie protocol met behulp van ureum / thioureum / SDS buffer voor menselijke en muizen hersenweefsel maakt het identificeren van eiwitten door 2D-DIGE en de daaropvolgende karakterisering door mini 2DE immunoblotting. Deze methode maakt een meer reproduceerbare en betrouwbare resultaten te verkrijgen van menselijke biopsies en experimentele modellen.

Consensus Brain-afgeleide eiwit, Extraction Protocol voor de studie van mensen en muizen Brain Proteome behulp Zowel 2D-DIGE en Mini 2DE Immunoblotting

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van steeds onoplosbaarder/geaggregeerd alfa-synucleïne (α-syn) uit post-mortem menselijk hersenweefsel. Door het gebruik van buffers met toenemende detergentsterkte en hoogsnelheids ultracentrifugeringstechnieken, kunnen de variabele eigenschappen van α-syn-aggregatie in zieke en niet-zieke weefsel worden onderzocht.

Sequentiële extractie van oplosbare en onoplosbare Alpha-Synuclein van Parkinson Brains

We presenteren een protocol om eiwitdeeltjes te identificeren die antigenen bevatten voor menselijke en muis IgM-antilichamen met specifieke kappa (Vκ) lichte ketens. Dit protocol is niet beperkt tot IgM-klasse antilichamen, maar is van toepassing op alle immunoglobuline isotypes die hun antigeen met voldoende hoge affiniteit targeten tijdens immunoprecipitaties.

Antilichaam bindende specificiteit voor Kappa (VK-) lichte keten bevattende de Mens (IgM) antilichamen: Polysialic Acid (PSA) Gehecht aan NCAM als Case Study

Een werkwijze voor het stabiliseren en scheiden van natieve eiwitcomplexen van ongewijzigd weefsellysaat onder toepassing van een amino-reactieve eiwit-crosslinker gekoppeld aan een nieuw tweedimensionaal polyacrylamide gelelektroforese (PAGE) systeem wordt gepresenteerd.

Multimeer-PAGE: Een methode voor het vastleggen en oplossen eiwitcomplexen Biological Samples

Hier presenteren de auteurs een eenvoudig en efficiënt protocol om een lineair antigeen epitoop te definiëren met behulp van een gezuiverd monoklonaal antilichaam en peptide scanning door dot-blot hybridisatie. De geïdentificeerde epitoop kan vervolgens worden gebruikt in therapeutische en diagnostische toepassingen.

Peptide Scanning-bijgestaan ​​Identificatie van een monoklonaal antilichaam-erkende Lineair B-celepitoop

Een verkorte fractionering protocol voor de verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke postmortem hersenen wordt beschreven.

Verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke Postmortem hersenen

Dit protocol wordt beschreven hoe voor te bereiden Aβ oligomeren van een synthetische peptide in vitro en relatieve hoeveelheid Aβ oligomeren evalueren door een stip bevlekken analyse.

A11-positieve β-amyloid oligomeren voorbereiding en de evaluatie met behulp van Dot bevlekken analyse

Dit werk beschrijft de synthese en karakterisering van een op pomalidomide gebaseerde, bifunctionele homo-PROTAC als een nieuwe benadering voor het induceren van alomtegenwoordige en afbraak van de E3 ubiquitine ligase cereblon (CRBN), het doelwit van thalidomide analogen.

Chemische inactivatie van de E3 Ubiquitin ligase Cereblon door Pomalidomide-based homo-PROTACs

Eiwit-eiwitinteracties zijn belangrijk voor het ophelderen van de functie van doeleiwitten, en co-immunoprecipitatie (co-IP) kan PPI's gemakkelijk bevestigen. We transfecteerden tijdelijk een plasmide dat codeert voor een epitoop-gelabeld eiwit in HEK-293-cellen en ontwikkelden een immunoprecipitatiemethode om de binding van twee doeleiwitten gemakkelijk te bevestigen.

Immunoprecipitatie met een Anti-Epitope Tag Affinity Gel om eiwit-eiwitinteracties te bestuderen

Hier beschrijven we een gistsysteem dat menselijke γ-secretase reconstrueert. Dit systeem maakt het mogelijk om mutaties die de activiteit beïnvloeden te identificeren en te bestuderen en om γ-secretaseremmers (GSI's) te screenen. Door gebruik te maken van het functieverlies van familiale mutanten voor de ziekte van Alzheimer, is het mogelijk om te screenen op γ-secretasemodulatoren (GSM's).

Saccharomyces cerevisiae Modellen van de ziekte van Alzheimer om genen, mutaties en chemicaliën te screenen die de productie van amyloïde bèta beïnvloeden door γ-secretase

Leer Aβ-multimeren detecteren in menselijk corticaal weefsel met SDS-PAGE en immunoblotting. Deze methode combineert weefselhomogenisatie, eiwitscheiding en antigeen-epitoopretrieval voor betrouwbaar onderzoek naar Alzheimer-pathologie.

SDS-PAGE/Immunoblot Detectie van Aß multimeren in Human Corticale weefselhomogenaten met behulp van antigeen-epitoop

Meer video's verkennen