SDS-PAGE/Immunoblot Detectie van Aß multimeren in Human Corticale weefselhomogenaten met behulp van antigeen-epitoop

Dit protocol maakt de detectie van beta-malters in menselijk corticaal weefsel mogelijk. Eerst wordt het gehomogeniseerde weefsel via probe-sonificatie behandeld en geklaard door middel van centrifugatie op lage snelheid. Vervolgens worden de gereduceerde monsters gekookt in SDS-buffer en geladen op een polyacrylamidegel.

Gelproteïnen worden overgebracht op een nitrocellulosemembraan en het membraan wordt met stoom verhit in fosfaatgebufferde zoutoplossing. Vervolgens wordt het membraan op een orbitale schudmachine een nacht geïncubeerd in een primaire antilichaam, daarna in een HRP-geconjugeerd secundair antilichaam en ten slotte in een luminaal peroxide-reagens vóór blootstelling aan röntgenfilm. Hallo, ik ben Rebecca Rosen van het laboratorium van Larry Walker van de afdeling Neurowetenschappen aan het Yerkes National Primate Research Center van de Emory University.

Vandaag laten we u zien hoe u Abeta-multimeren en corticale homogenaten kunt detecteren met behulp van SDS-gelelektroforese en immunobloting met hitte-geïnduceerde antigeenherwinning. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de niveaus en distributie van verschillende Abeta-multimeren te bestuderen in ongefixeerd corticaal weefsel van mensen met de ziekte van Alzheimer en oudere niet-menselijke primaten. Laten we beginnen.

Begin met ongeveer honderd milligram niet gefixeerd corticaal weefsel en homogeniseer dit in ongeveer 400 µL ijskoud buffer met ongeveer 30 gelijkmatige slagen met de stamper. Voor 20% gewicht per volume moet de verhouding tussen weefselgewicht en buffervolume één milligram per vier µL zijn. Breng de homogenaten na homogenisatie over naar een polypropyleen buis van vier milliliter en voer drie keer vijf seconden probe-sonicatie uit bij vermogen vijf.

Breng na sonificatie de homogenaten over naar 1,5 milliliter microcentrifugeebuisjes en centrifugeer vijf minuten bij 3000 G. Verwijder voorzichtig de geklaarde supernatanten en bewaar aliquots van 50 microliter van deze extracten bij min 80 graden Celsius tot gebruik. Bepaal vervolgens de totale eiwitconcentratie van vers ontdooide aliquots van de geklaarde homogenaten met een bio acid- of BCA-assay volgens de instructies van de fabrikant. Geklaarde 20% corticale homogenaten moeten een eiwitconcentratie hebben van meer dan vijf microgram per microliter en kunnen daarom 1 op 10 worden verdund om binnen het bereik van de plaatlezer te vallen. Bereid voor de BCA-assay denaturerende monsterreacties voor met dezelfde aliquots van de geklaarde homogenaten.

Gebruik ongeveer 50 tot 60 µg totaal eiwit en pas het volume van de corticale homogenaten dienovereenkomstig aan, zodat elk monster dezelfde totale eiwithoeveelheid bevat. Bereid monsters met een totaal volume van 25 µL voor elke 10 tot 20% trice gel die wordt geladen. Bereid voor elke gel een positieve controle van 10 tot 100 ng synthetisch a beta 40 of a beta 42 peptide, gedilueerd in 1X PBS tot 10 µL, met 12,5 µL van 2X SDS monsterbuffer en 2,5 µL van 10x reduceermiddel.

Nadat alle monsters zijn voorbereid, inclusief een bètacontrole, vortex deze gedurende vijf tot 10 seconden en verhit ze in een droogbad op 100 °C gedurende vijf minuten; centrifugeer vervolgens alle buisjes kort om condensatie in de dop te verwijderen. Laad de monsters op een gel die is ondergedompeld in Tris-SDS-runbuffer in een gelbak en laad ten minste één put met 10 µL van een onverdunde moleculaire gewichtsmarker. Run de gel bij een constante spanning van 125 V gedurende ongeveer 90 minuten of totdat de 4 kDa-marker ongeveer één centimeter van de onderkant van de gel bevindt.

Verwijder de gels voorzichtig uit de plastic cassettes en stel de transfersandwich samen volgens de instructies van de fabrikant. Bevochtig de blotting pads en nitrocellulosemembranen van 1 µm vooraf met tris-glycine transferbuffer en verwijder alle luchtbellen uit de blotting pads of de filtersandwich.

Vul de binnenkamer van het transferapparaat met transferbuffer en vul de buitenkamer met gedestilleerd water. Voer de transfer uit gedurende twee tot drie uur bij een constante stroomsterkte van 25 milliamps. Wanneer de transfer is voltooid, haal dan de sandwich uit elkaar en plaats de gels in een schaal met gedestilleerd water en de membranen in een schaal met 1x PBS voor alle volgende protocolstappen.

Zorg ervoor dat de gels en membranen volledig bedekt zijn met vloeistof om uitdroging te voorkomen. Om de efficiëntie van de eiwitoverdracht te visualiseren, worden de gels gedurende ongeveer een uur geïncubeerd met onverdunde SimplyBlue Safe-kleurstof en de membranen gedurende ongeveer vijf minuten met 1x Ponceau S-kleurstof. De incubatietijd dient te gebeuren volgens de instructies van de fabrikant; deze kleuring zal het immunoblotten niet beïnvloeden.

Als kleuring uitwijst dat de proteïneoverdracht inefficiënt was, pas dan de overdrachtstijd in stap drie aan voor antigeenherwinning. Verseal het membraan in een stevig CapEx-plastic zakje gevuld met ongeveer 50 milliliters 1x PBS op kamertemperatuur in een stoompan. Leg het zakje plat in een voorverwarmde stoompan bij 100 °C; zodra het zakje begint uit te zetten, laat u het nog 15 minuten incuberen voordat u het uit de stoompan haalt.

Laat het membraan langzaam afkoelen voordat u het uit de pouch haalt om overmatige kreukvorming bij kamertemperatuur te voorkomen. Verwijder het membraan voorzichtig uit de pouch en spoel het membraan vijf minuten in 1 XPBS op een orbitale schudder, gevolgd door een spoeling van vijf minuten in TBST op een orbitale schudder. Incubeer het membraan vervolgens gedurende één uur in blokkeringsoplossing op een orbitale schudder zonder te spoelen, en breng het membraan over naar een schaal met het primaire antilichaam six E 10, dat specifiek is voor de A beta en terminale regio, verdund 1:1000 tot 1:5.000 in blokkeringsoplossing.

Incubeer op een orbitale schudker door een uur bij kamertemperatuur en vervolgens 24 tot 48 uur onder schudding bij vier graden Celsius. Na één korte spoeling wordt het membraan 30 minuten gewassen. Spoel vervolgens drie keer gedurende 10 minuten in TBST op een orbitale schudker.

Incubeer het membraan gedurende 90 minuten op de schudmachine bij kamertemperatuur in HRP-geconjugeerd secundair antilichaam, verdund 1:10.000 in blokkeeroplossing. In dit protocol gebruiken we schapen anti-US antilichaam. Spoel het membraan vervolgens gedurende 30 minuten in TBST, beginnend met één korte spoeling, gevolgd door drie spoelingen van 10 minuten op een orbitale schudmachine.

Incubeer na de laatste spoeling het membraan gedurende vijf minuten in vers bereide, onverdunde Super Signal West Pico ECL-reagentia. Verwijder het membraan van de schudmachine op hoge RPM en blaas het overtollige reagens weg. Plaats het membraan, met behulp van pluisvrij filterpapier of Kimwipes, in een filmcassette tussen plastic beschermvellen en dep resterende Super Signal-reagentia weg met stofvrije Kimwipes.

Indien nodig, belicht de Kodak Biomax MR.Film gedurende intervallen van 30 seconden, tot maximaal 30 minuten, en ontwikkel deze in een filmontwikkelaar. Na vijf minuten zullen de A beta monomeerbanden in dit experiment waarschijnlijk verzadigd zijn. Gezuiverde homogenaten met 50 micrograms totaal eiwit van zeven menselijke proefpersonen werden geanalyseerd op de aanwezigheid van multimeer beta amyloïde of a beta en amyloid precursor proteïne of a PP, het transmembraanproteïne waaruit het A beta peptide wordt afgesplitst.

Hier tonen we representatieve beelden van een A beta a PP western blot experiment bij een belichtingstijd van 30 minuten en vijf minuten. Een belichting van 30 minuten maakt het mogelijk om de veel lichtere dimeer-, trimeer-, tetrameer- en banden met een hoger moleculair gewicht of ligamenteuze banden van Abeta te visualiseren, maar zorgt voor overbelichting van de andere banen bij een belichtingstijd van vijf minuten. Dezelfde tetrameerband is aanwezig maar zwak, waardoor andere banen duidelijk gevisualiseerd kunnen worden.

Corticale homogenaten van proefpersonen met de ziekte van Alzheimer of AD zijn te zien in baan één tot drie, een menselijke proefpersoon gediagnosticeerd met dementie met Lewy-lichaampjes of DLB en de ziekte van Alzheimer is te zien in baan vier, gevallen van dementie met Lewy-lichaampjes zijn te zien in baan vijf en zes, en een oudere niet-demente menselijke controlegroep in baan zeven. Immunoblotting met antilichaam 6C10 onthulde Aβ-monomeren, dimeren, trimeren, tetrameren en Aβ-oligomeren in alle Alzheimer-gevallen, evenals overvloedige Aβ-multimeren met een hoger moleculair gewicht in twee AD-gevallen, wat wijst op de heterogeniteit van Aβ-aggregatie tussen menselijke proefpersonen.

Een beta 40 in het rechterspoor bevestigt de identiteit van de banden met een lager molecuulgewicht. We hebben zojuist een SDS-PAGE Western blot-experiment gedemonstreerd om beta-multimeren te identificeren in niet-gefixeerde weefselhomogenaten uit de hersenen van mensen met neurodegeneratieve ziekten. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om sterk geconcentreerde corticale homogenaten voor te bereiden voor scheiding via gelelektroforese, om Abeta-multimeren met een lagere abundantie zichtbaar te maken.

Het is daarnaast belangrijk om hitte-geïnduceerde antigeen-epitope-herwinning uit te voeren voorafgaand aan immunoblotting met een antilichaam tegen het Abeta-peptide. Antigeenherwinning helpt om verborgen Abeta-epitopen bloot te leggen voor een optimale antilichaambinding tijdens de immunoblotting. Elke stoomapparaat, magnetron of waterbad dat 100 °C handhaaft, is hiervoor geschikt.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.