Name: MALDI Monstervoorbereiding: de Ultra Thin Layer methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Leer de ultra thin layer methode voor MALDI-MS monsterpreparatie om eiwitten nauwkeurig te analyseren. Deze techniek verbetert de massabepaling en zorgt voor betrouwbare resultaten in analytische chemie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het is zeer belangrijk voor poeder-handschoenen te dragen tijdens de voorbereiding van de dunne laag. Reiniging van het monster plaat <ol><li> Gebruik een roestvrij staal of goud MALDI sample plaat. </li><li> Wassen met MeOH en veeg voorzichtig met een Kimwipe. Niet wrijven of het oppervlak scrub met de Kimwipe, om te voorkomen krassen op het oppervlak. </li><li> Wassen met H 2 O en veeg voorzichtig met een Kimwipe. </li><li> Wassen met MeOH en veeg voorzichtig met een Kimwipe. </li><li> Indien nodig, herhaal MeOH / H 2 O / MeOH reinigingscyclus, altijd eindigend met MeOH. </li><li> Zorg ervoor dat er geen spook vlekken of residu dat resteert op de plaat. Als er spook plekken, spoel de plaat met gedeïoniseerd water, terwijl het oppervlak te wrijven met de gehandschoende hand (Wrijf niet met Kimwipes). Herhaal de MeOH / H 2 O / MeOH reinigingscyclus. </li><li> Gebruik de plaat onmiddellijk na het wassen. </li></ol> Voorbereiding van de dunne laag substraat-oplossing <ol><li> Meng 1 deel van verzadigde 4-HCCA (2 delen ACN, een deel water, en 0,1% TFA finale) en 3 delen isopropanol. Opmerking: De dunne laag substraat oplossing is zeer stabiel, en kan bij kamertemperatuur bewaard worden in het donker voor een jaar. Het kan ook worden opgeslagen bij 4 ° C. </li></ol> Het maken van de dunne laag substraat <ol><li> Van toepassing zijn 20-50μL van de dunne laag substraat oplossing op de linker-midden van de plaat, en verspreid dit met de zijkant van een pipet tip. Vegen in een richting. </li><li> Als de oplossing droogt, het organische oplosmiddel verdampt heel snel, met achterlating van minuut druppels water op het oppervlak van de plaat. Op dit punt, wikkel je wijsvinger met een laag van Kimwipe en aanvankelijk voorzichtig vlek het oppervlak van de plaat mee. </li><li> Wanneer het oppervlak is bevrijd van waterdruppels, veeg de hele plaat met uni-directionele bewegingen vegen met behulp van een Kimwipe. Opmerking: Als de oplossing niet genoeg verspreid over het plaatoppervlak, verhoging van de ACN samenstelling en recreëren de dunne laag. Enkele parameters die van invloed kunnen de verspreiding van de oplossing zijn luchtvochtigheid en temperatuur. Let op: Met gouden platen, de laag meestal weergegeven als een geelachtige reflectie, afhankelijk van de kijk-en lichte hoeken. Met stalen platen, alleen de rand van de laag is normaal zichtbaar. </li><li> Maak de randen van de plaat met een frisse Kimwipe voordat u hem in de plaat houder matrix te voorkomen dat het besmetten van het instrument. </li></ol> De voorbereiding van de matrix-oplossing <ol><li> <a href="http://prowl.rockefeller.edu/protocols/saturated-4HCCA-solution.html">Verzadigde 4-HCCA</a> in FWI (3 delen mierenzuur, 1 deel water, 2 delen isopropanol) wordt aanbevolen voor de analyse van zowel de membraan en oplosbare eiwitten. Het kan ook gebruikt worden in bijzondere gevallen voor de analyse van zeer grote hydrofobe peptiden (M&gt; 4000 u). Zorg ervoor dat de matrix-oplossing wordt gebruikt voor het spotten van de eiwitten niet ~ 50% organisch gehalte overschrijden, omdat het volledig oplossen van de dunne laag substraat, het verslaan van de voordelen van de methode. </li></ol> Test van de dunne laag substraat <ol><li> Spot 0.5μL van de matrix-oplossing op de plaat. Een witte neerslag zal verschijnen op het grensvlak tussen de dunne laag en de druppel. Wanneer deze laag de onderkant van de druppel volledig dekt, meestal binnen 10-15 seconden, zuigen de overtollige vloeistof met een vacuüm lijn. Als het langer duurt dan 30 seconden voor de neerslag te vormen, is het een indicatie dat er mogelijk een probleem met de dunne laag substraat en / of de matrix oplossing. </li></ol> Voorbeeld applicatie <ol><li> De analyt concentratie in het begin oplossingen moeten worden binnen de 10 en 1000μM. </li><li> Verdun de analyt-oplossing in matrix-oplossing tot een uiteindelijke analietconcentratie tussen 0,2 en 2μM. Bijvoorbeeld, te beginnen met 1μl van het monster en de 9μl van matrix oplossing. Opmerking: Zorg ervoor dat de matrix is goed als verzadigd in de uiteindelijke oplossing, anders zult u Los het dunne laag substraat. Let op: Analyte concentraties die nodig om fatsoenlijk signalen te verkrijgen, zijn sterk afhankelijk van de oplossing de complexiteit en de samenstelling (bijvoorbeeld, contaminanten) en analyt ionizability. Opmerking: Als een single-stap verdunning geen goede resultaten opleveren, moet je nog een verdunning stap proberen. Hoewel de contra-intuïtieve, zeer geconcentreerde analyt oplossingen zelden tot goede spectra. Let op: Membraaneiwitten vereisen doorgaans een grotere verdunningen. </li><li> Spot 0.5μl van het monster / matrix mengsel op het bord. Een witte neerslag zal vormen op het grensvlak tussen de dunne laag en de druppel. Deze neerslag wordt het cocrystallization van de matrix en analyt. Wanneer deze laag de onderkant van de druppel volledig dekt, usubondgenoot binnen 10-15 seconden, zuigen de overtollige vloeistof met een vacuüm lijn. Als het langer duurt dan 30 seconden voor de neerslag te vormen, kan het een indicatie van een verontreiniging aanwezig is, dat voorkomt de kristallisatie, of je analiet is te geconcentreerd. </li></ol> Kalibrant toepassing <ol><li> Bereid de kalibrant / matrix mengsel in een vergelijkbare manier met een laatste kalibratieoplossing concentratie tussen 0,1-0.5μM. </li><li> Spot 0.5μl kalibrant / matrix mengsel op het bord in de nabijheid van het monster plekken. Deze fysieke nabijheid wordt gebruikt in een pseudo-interne kalibratie procedure waarin de plaat is uit de steekproef plek verplaatst naar de kalibratieoplossing plek tijdens afnemen van het monster, een paar shots van de laser kalibranten toe te voegen aan het spectrum. Deze aanpak staat garant voor een hogere nauwkeurigheid van massa&#39;s kalibratie dan externe kalibratie alleen. </li></ol> Wasstap <ol><li> Was elke spot met ongeveer 2μL van een ijskoude 0,1% waterige oplossing TFA. Aspireren overtollige vloeistof met een stofzuiger lijn. </li></ol> Overname van massaspectra <ol><li> U bent nu klaar om de massa spectra te verkrijgen. Als u de FWI matrix-oplossing, moet u uw verwerven spectra zo snel mogelijk om onomkeerbare wijziging te voorkomen dat de analyt, zoals formylering. </li></ol>

<ol><li>Xiang, F., Beavis, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+to+Increase+Contaminant+Tolerance+in+Protein+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization+by+the+Fabrication+of+Thin+Protein-Doped+Polycrystalline+Films%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).</li>
<li>Cadene, M., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Robust%2C+Detergent-Friendly+Method+for+Mass+Spectrometric+Analysis+of+Integral+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins.</a> Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).</li>
<li>Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+allosteric+control+of+cytoplasmic+dynein+ATPase+activity+by+the+stalk+and+C-terminal+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains.</a> J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).</li>
</ol>

Het is cruciaal dat alle reagentia zijn van de hoogste kwaliteit (bv HPLC-kwaliteit). Poedervrije handschoenen (latex of nitril) Roestvrij staal of goud MALDI monster plaat Methanol (MeOH) Water Kimwipes alpha-cyano-4-hydroxycinnamic zuur (4-HCCA) Trifluorazijnzuur (TFA) (uiteindelijke concentratie in 0,1% in H 2 O) Acetonitril (ACN) Mierenzuur Isopropanol

maldi monstervoorbereiding: de ultra thin layer methode

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

Deze video toont de voorbereiding van een ultra-dunne matrix / analyt laag voor het analyseren van peptiden en eiwitten door Matrix-assisted laser desorptie ionisatie massaspectrometrie (MALDI-MS) 1, 2. De ultra-dunne laag methode betreft de productie van een substraatlaag van matrix kristallen (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic zuur) op het monster plaat, die dienst doet als een seeding grond voor verdere kristallisatie van een matrix / analyt mengsel. Voordelen van de ultra-dunne laag methode ten opzichte van andere sample depositie benaderingen (bijv. gedroogde druppel) zijn die het biedt (i) een grotere tolerantie voor verontreinigingen zoals zouten en wasmiddelen, (ii) een betere resolutie, en (iii) hogere ruimtelijke uniformiteit. Deze methode is vooral handig voor de nauwkeurige bepaling van de massa van eiwitten. Het protocol werd in eerste instantie ontwikkeld en geoptimaliseerd voor de analyse van membraaneiwitten en worden gebruikt om met succes te analyseren ion kanalen, metaboliet vervoerders, en receptoren, die tussen 2 en 12 transmembraan-domeinen 2. Sinds de oorspronkelijke publicatie, is het ook aangetoond dat het ook nuttig zijn voor de analyse van oplosbare eiwitten. Inderdaad, we hebben het gebruikt voor een groot aantal eiwitten met een breed scala aan eigenschappen, waaronder die met moleculaire massa&#39;s zo hoog als 380 kDa 3. Het is op dit moment onze methode van keuze voor de moleculaire massa analyse van alle eiwitten. De beschreven procedure een constant hoge kwaliteit spectra, en het is gevoelig, robuust en eenvoudig te implementeren.

Deze video toont de voorbereiding van een ultra-dunne matrix / analyt laag voor het analyseren van peptiden en eiwitten door Matrix-assisted laser desorptie ionisatie massaspectrometrie (MALDI-MS).

MALDI Monstervoorbereiding: de Ultra Thin Layer methode

Deze video demonstreert de preparatie van een ultradunne matrix/analytenlaag voor de analyse van peptiden en eiwitten middels Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Welkom bij de CHI Lab-tutorial over de ultra-dunne laagmethode, die bijzonder nuttig is voor de nauwkeurige massabepaling van eiwitten. Vanwege de gevoeligheid van massaspectrometrie gebruiken we uitsluitend reagentia van HPLC-kwaliteit en poedervrije latex- of nitrilhandschoenen om de plaat te reinigen. Spoel af met afwisselend methanol en water, en tot slot opnieuw met methanol.Veeg tussen elke spoelbeurt door het overtollige oplosmiddel voorzichtig weg met lenspapier. Herhaal deze wasstappen indien nodig totdat de plaat schoon is. Gebruik de plaat onmiddellijk nadat deze is gereinigd en gedroogd.Breng 20 tot 30 µL van de dunne-laag substraatoplossing aan en verdeel deze over de schone MALDI-plaat. Hier gebruiken we een P250-pipetpunt om de oplossing gelijkmatig te verspreiden zonder de plaat te bekrassen. Terwijl de dunne laag droogt, worden eventuele resterende waterdruppels voorzichtig weggebloot met een Kimwipe.Veeg vervolgens de plaat voorzichtig in één vloeiende beweging af met een Kimwipe om de dunne laag correct te vormen. Maak tot slot de randen van de plaat schoon om contaminatie van de massaspectrometer te voorkomen. Het is essentieel om de dunne laag te testen voordat u uw monster aanbrengt.Als de testspot te lang nodig heeft om te drogen waardoor de kristallen niet homogeen zijn, kan het probleem in de dunne laag zelf of in de matrixoplossing liggen; reinig de plaat, breng de dunne laag opnieuw aan en voer de test opnieuw uit. Bij het aanbrengen van spots op de dunne laag is het niet wenselijk dat de spots volledig verdampen tot ze droog zijn. Verwijder in plaats daarvan het overtollige oplosmiddel zodra de kristallisatie is vertraagd en gestopt.Gebruik een vacuümaspirator. De aanwezigheid van verontreinigingen zoals zouten en detergentia, evenals een hoge analytconcentratie, kunnen de kristallisatie belemmeren. Verdere verdunning van het monster kan de kristallisatie verbeteren. Plaats de Ants in directe nabijheid van het monster. Dit maakt pseudo-interne kalibratie mogelijk, waarbij de plaat wordt verplaatst van de monsterplek naar de kalibratieplek.Tijdens de monstername garandeert deze aanpak, waarbij een paar laserpulsen van de CAS aan het spectrum worden toegevoegd, een hogere nauwkeurigheid van de massakalibratie dan externe kalibratie alleen. Het is zeer belangrijk om eventuele verontreinigingen zoals zout of detergent, die de ionisatie van de analyt kunnen beïnvloeden, weg te wassen. Doe dit door ijskoud, 0,1% trifluorazijnzuur in HPLC-waardig water direct op de spots te druppelen.Verwijder de wasoplossing met een vacuümaspirator, zoals hier wordt getoond. Deze methode levert uitstekende spectra op voor zowel membraan- als oplosbare eiwitten.

maldi-sample-preparation-the-ultra-thin-layer-method

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dopamine vervanging farmacotherapie met L-dopa is de meest gebruikte symptomatische behandeling van Parkinson, maar gaat gepaard met bijwerkingen zoals onwillekeurige abnormale bewegingen, genoemd...

MALDI massaspectrometrie Imaging van neuropeptiden bij de ziekte van Parkinson

Wij ontwikkelden een technologie op basis van silica mesoporeuze dunne film voor het selectief herstel van laagmoleculaire peptiden en eiwitten van humaan serum. De fysisch-chemische eigenschappen van onze mesoporeuze chips zijn volledig afgestemd op grote controle in peptide verrijking 'en derhalve profiel van de serum proteoom voor diagnostische doeleinden.

Laag moleculair gewicht eiwitverrijking op mesoporeuze silica dunne films voor de ontdekking van biomarkers

Nauwkeurige massa meting betekent een belangrijke stap tijdens het onderzoek van eiwitten. Matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie (MALDI) massaspectrometrie (MS) kan worden gebruikt voor deze vaststelling en van zijn belangrijkste voordeel is de tolerantie voor zouten, detergentia en verontreinigingen. Hier tonen we een toegankelijke benadering voor de analyse van eiwitten groter dan 100 kDa door MALDI-MS.

Matrix-laserdesorptie / ionisatie Time of Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrische analyse van intacte eiwitten groter dan 100 kDa

Massaspectrometrische imaging (MSI) is een krachtig instrument dat kan worden gebruikt om verschillende chemische stoffen ontdekken en identificeren intacte weefsels behoud van de verbindingen in hun eigen omgeving, waarin nieuwe inzichten in biologische processen kunnen leveren. Hierin een MSI werkwijze ontwikkeld voor de analyse van kleine moleculen beschreven.

MALDI-Massaspectrometrische Imaging voor onderzoek naar metabolieten in<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Wortelknolletjes

Een massaspectrometrie-beeldvormingsbron (MSI) die op atmosferische druk werkte, werd ontwikkeld door mid-infrarood laserdesorbentie te koppelen met post-ionisatie door middel van elektrospray. Exogeen ijsmatrix werd gebruikt als de energieabsorberende matrix om resonante desorbentie van weefselgerelateerd materiaal te vergemakkelijken. Dit manuscript biedt een stapsgewijs protocol voor het uitvoeren van IR-MALDESI MSI van een neonatale muis in zijn geheel.

Whole-body massaspectrometrie Imaging door Infrared Matrix-geassisteerde laser desorptie electrospray ionisatie (IR-MALDESI)

Een protocol voor het verminderen ruimtelijke heterogeniteit van ionen signalen in MALDI massaspectrometrie door het regelen substraattemperatuur tijdens droogprocessen monster wordt aangetoond.

Voorbereiding van de Homogene MALDI Monsters voor Quantitative Applications

Een nieuwe methode voor de bereiding van de monsters werd ontwikkeld zodat de cel- en weefseltransplantaties coculture op te sporen klein molecuul uitwisseling met behulp van spectrometrie van de massa van de beeldvorming.

Vastleggen van klein molecuul communicatie tussen de weefsels en cellen met behulp van Imaging massaspectrometrie

Het doel van dit protocol is om gedetailleerde richtlijnen te geven over de monstervoorbereiding bij het plannen van experimenten met MALDI MSI om metabole en moleculaire detectie in biologische monsters te maximaliseren.

Monstervoorbereiding voor metabole profilering met behulp van MALDI massaspectrometrie beeldvorming

Het doel van dit protocol is om gedetailleerde richtlijnen te geven over de juiste monstervoorbereiding voor lipide- en metabolietanalyse in kleine weefsels, zoals de Drosophila-hersenen , met behulp van matrixondersteunde laserdesorptie / ionisatie (MALDI) massaspectrometrie beeldvorming.

Monstervoorbereiding voor snelle lipidenanalyse in drosophila-hersenen met behulp van matrixondersteunde laserdesorptie / ionisatie massaspectrometrie beeldvorming

Dit protocol schetst het gebruik van microMS voor fluorescentiegeleide, eencellige MALDI-2-massaspectrometrie, waardoor verbeterde moleculaire profilering van primaire neuronale cellen van ratten mogelijk is.

Fluorescentiegeleide matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie met lasergeïnduceerde postionisatiemassaspectrometrie van individuele neurale cellen van ratten

Leer de ultra thin layer methode voor MALDI-MS monsterpreparatie om eiwitten nauwkeurig te analyseren. Deze techniek verbetert de massabepaling en zorgt voor betrouwbare resultaten in analytische chemie.

MALDI Monstervoorbereiding: de Ultra Thin Layer methode

Meer video's verkennen