Eukaryotische Polyribosome Profiel Analyse

Het algemene doel van deze procedure is om de mono-zone en polyribosoomfracties uit cellysaten te scheiden en te vergelijken. Dit wordt bereikt door eerst de betreffende cellen te kweken. De tweede stap van de procedure is het bereiden van het cellysaat.

De derde stap van de procedure is het centrifugeren van het lysaat via een sucrosegradiënt. De laatste stap van de procedure is het fractioneren van de gradiënt en het visualiseren van de verschillende ribosomale populaties via een UV-trace. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die via polyribosoomprofielanalyse veranderingen in de translatie onder verschillende experimentele omstandigheden aantonen.

Hallo, ik ben Anthony Esposito van het laboratorium van Dr. Terry Goss Kinsey van de afdeling Moleculaire Genetica, Microbiologie en Immunologie aan de UMD en de J Robert Wood Johnson Medical School. En ik ben Marcus Lewis, ook van het laboratorium van McKinsey hier aan de R-W-J-M-S.

Vandaag laten we u een procedure zien voor polyribosoomanalyse. In ons laboratorium gebruiken we deze procedure om veranderingen in de eiwitsynthese te bestuderen die voortkomen uit mutaties of omgevingsfactoren. Laten we beginnen. Sucrose.

Gradiënten moeten één dag voor gebruik worden bereid om ervoor te zorgen dat de gradiënten continu worden. Meng de juiste volumes van 7% en 47% sucrose-stamlopingen om 48 milliliter te maken van elk van de volgende sucroseconcentraties: 7%, 17%, 27%, 37% en 47%. Voeg één molar DTT toe aan elke sucrose-oplossing tot een eindconcentratie van één millimolar. Om de gradiënten te gieten, bevestigt u een pasta-pipet aan een spuit van 20 milliliter door deze te zekeren en af te dichten met parafilm.

Voeg zeven milliliters 7% sucrose toe aan de bodem van een poly-amer ultra-centrifugebuis van one inch bij 3,5 inch. Voeg vervolgens zeven milliliters 17% sucrose-oplossing onder de 7% oplossing toe door de pipetpunt dicht bij de bodem van de buis te plaatsen en langzaam te pipetteren. Het gieten van elke laag mag niet minder dan 20 seconden duren.

Herhaal dit met telkens zeven milliliters van 27%, 37% en 47% sucrose-oplossingen zodra de gradiënt is gevormd. Er zouden duidelijke lijnen tussen de lagen zichtbaar moeten zijn, wat aangeeft dat er minimale menging heeft plaatsgevonden. Bewaar alle gradiënten bij vier graden Celsius gedurende de nacht, samen met de rotoren, flessen en buizen die zullen worden gebruikt om de monsters te oogsten.

Om extracten van gistcellen te bereiden, begint u met het kweken van 100 25 milliliter gistcultuur tot een OD 600 van 0,8 tot 1. Voeg cycloheximide toe aan de cultuur tot een eindconcentratie van 100 microgram per milliliter en schud gedurende 15 minuten verder bij 30 °C. Giet na 15 minuten de cultuur in een centrifugefles van 250 milliliter en vul deze aan met ijs.

Houd alles vanaf dit punt op ijs; centrifugeer 5 minuten bij 8.000 ×g bij 4 °C. Resuspendeer de pellet in 10 mL ijskoude lysisbuffer en breng dit over naar 15 mL polypropyleen buisjes. Centrifugeer 3 minuten bij 5.900 ×g bij 4 °C. Resuspendeer.

Resuspendeer de pellet in 0,5 milliliter lysisbuffer. Breng de suspensie over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en voeg vervolgens 0,5 milliliter gekoelde, zuurgewassen glasparels toe. Vortex de cellen in vier intervallen van 32 seconden, waarbij de buis tussen elk interval 30 seconden op ijs wordt geplaatst.

Voeg vervolgens nog eens 0.5 milliliters lysisbuffer toe aan de 1.5 milliliter centrifugebuis en centrifugeer dit 5,000 ×g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Breng de supernatant over naar een nieuwe 1.5 milliliter microcentrifugebuis en centrifugeer op maximale snelheid gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.

Breng tot slot het supernatant over naar een nieuwe microcentrifugeebuis van 1,5 milliliter. Het extract kan worden bewaard bij minus 80 degrees Celsius voordat het lysaat naar de sucrosegradiënt wordt overgebracht. Plaats de pipetpunt tegen de wand van de buis vlak boven het oppervlak van de gradiënt en breng het lysaat voorzichtig aan bovenop de gradiënt.

Voor een gradiënt van 35 milliliter wordt doorgaans 500 microliters lysaat geladen. Plaats de gradiënt met een pincet voorzichtig in de emmer van een swinging-bucket rotor. Centrifugeer de gradiënten bij 100 000 ×g gedurende vier uur bij vier graden Celsius.

Ongeveer 30 minuten voordat het centrifugeren van vier uur is voltooid, wordt de naald aan de buisdoorborer bevestigd en de pen aan de online absorptie-fluorescentiemonitor. Zet de stroom van de absorptiemonitor aan, zodat een stabiele nullijn kan worden bereikt voordat de monsters worden geanalyseerd.

De elektronische acquisitie van het PolyZone-profiel kan eenvoudig in real-time worden verkregen door een DI 1 48 U data-acquisitie-unit aan te sluiten. Vul voor de grafiekenrecorder de spuitpomp met 50 milliliters florin nuts met behulp van de instelling voor snelle tegenstroom. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.

Verbind de slang van de spuit met de buisdoorboorder. Zet vervolgens kort de stroom van Flo inert aan op 6 mL per minuut in de voorwaartse richting. Om eventuele luchtbellen uit de slang te verwijderen, plaatst u een reeks buisjes onder de slang aan het uiteinde van de doorstroomcel om de monsteruitloop op te vangen.

Bereid een ijsbad voor met een vooraf gevormde uitsparing om de centrifugebuis met de sucrosegradiënt in te plaatsen. Wanneer de centrifugatie van vier uur is voltooid, worden de centrifugebuizen voorzichtig uit de centrifugerotor verwijderd en op ijs geplaatst. Zorg ervoor dat de gradiënten niet worden verstoord.

Om celextracten te analyseren, plaatst u de gradiëntbuis op de buisdoorboorder, verbindt u de bovenkant van de buis met de uitlaat en zet u deze vast. Verhoog het onderste platform naar de centrifugebuis zodat de naald door de bodem van de buis dringt. Start de stroom van Florin alert in voorwaartse richting met een snelheid van 6 ml per minuut.

Zodra de vloeistof in de buis begint te stromen, dient de beweging van de naald op de online UV-absorbantiemonitor te worden gevolgd. Zodra de naald begint te bewegen, wordt de grafiekbeweging ingeschakeld op een snelheidsinstelling van 60. Wanneer het einde van het polyribosoomprofiel is bereikt, wordt de stroom van Flo inert naar de centrifugebuis stopgezet en wordt de grafiekbeweging op de absorbantie-fluorescentiemonitor beëindigd.

Trek de Flo inert vanuit de centrifugebuis terug in de spuit door de stroom in omgekeerde richting op een hoge snelheid te starten, waarbij u ervoor zorgt dat er geen sucrose vanuit de buis in de spuit wordt getrokken. Schroef de centrifugebuis los van de buisdoorborer, laat de naald zakken en verwijder de buis. Een representatieve trace van een ribosoomextract geprepareerd uit gist in aanwezigheid van cyclo heximide wordt hier getoond.

UV-absorptiepieken die polyribosomen en 60 s- en 40 s-ribosomen bevatten, zijn aangegeven. We hebben zojuist laten zien hoe u een polyribosomanalyse uitvoert. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om snel te werken en de monsters koud en RNA-vrij te houden.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.