Eukaryotische Polyribosome Profiel Analyse

Het algemene doel van deze procedure is om de mono zone en poly ribosoomfracties van cellysaten te scheiden en te vergelijken. Dit wordt bereikt door eerst de cellen van belang te kweken. De tweede stap van de procedure is het bereiden van het cellysaat.

De derde stap van de procedure is het centrifugeren van het lysaat door een sucrosegradiënt. De laatste stap van de procedure is het fractioneren van de gradiënt en het visualiseren van de verschillende ribosoompopulaties via een UV-trace. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die veranderingen in translatie onder verschillende experimentele omstandigheden laten zien door middel van poly ribosoomprofielanalyse.

Hallo, ik ben Anthony Esposito van het lab van Dr. Terry Goss Kinsey in de afdeling Moleculaire Genetica, microbiologie en immunologie aan UMD en J Robert Wood Johnson Medical School. En ik ben Marcus Lewis. Ook van McKinsey Lab hier bij R-W-J-M-S.

Vandaag laten we je een procedure zien voor poly ribosoomanalyse. We gebruiken deze procedure in ons lab om veranderingen en eiwitsynthese te bestuderen die voortkomen uit mutaties of omgevingsfactoren. Dus laten we beginnen. Sucrose.

Gradiënten moeten een dag voor gebruik worden bereid om gradiënten continu te laten worden. Meng de geschikte volumes van 7% en 47% sucrose-stockoplossingen om 48 milliliter van elk van de volgende sucroseconcentraties te maken, 7% 17% 27% 37% en 47%. Voeg een molair DTT toe aan elke sucrose-oplossing tot een eindconcentratie van één millimolair. Om de gradiënten te gieten, bevestigt u een pastapipet aan een 20 milliliter spuit door deze te bevestigen en af te sluiten met parafilm.

Voeg zeven milliliter 7% sucrose toe aan de bodem van een poly aamer ultracentrifugebuis van één inch bij 3,5 inch. Voeg vervolgens zeven milliliter 17% sucrose-oplossing toe onder de 7% oplossing door de pastapipetpunt dicht bij de bodem van de buis te plaatsen en langzaam te pipetteren. Het zou niet minder dan 20 seconden duren om elke laag te gieten.

Herhaal met zeven milliliter van elk 27% 37% en 47% sucrose-oplossingen wanneer de gradiënt is geboord. U zou duidelijke lijnen tussen de lagen moeten observeren, wat aangeeft dat minimaal mengen heeft plaatsgevonden. Bewaar alle gradiënten van vier graden Celsius een nacht lang, samen met de rotors, flessen en buizen die zullen worden gebruikt om monsters te oogsten.

Om extracten van gistcellen te bereiden, begin met het kweken van honderd 25 milliliter gistcultuur tot een OD 600 van 0,8 tot één. Voeg cyclo heide toe aan de cultuur tot een eindconcentratie van 100 microgram per milliliter en blijf schudden bij 30 graden Celsius gedurende 15 minuten. Na 15 minuten giet de cultuur in een 250 milliliter centrifugeerfles en vul met ijs.

Houd alles vanaf dit punt op ijs, centrifugeer bij 8.000 keer g voor vijf minuten bij vier graden Celsius. Resus, suspendeer de pellet in 10 milliliter ijs, koude lyse buffer, en breng over naar 15 milliliter polypropyleenbuizen. Centrifugeer bij 5.900 keer g gedurende drie minuten bij vier graden Celsius Resus.

Suspendeer de pellet in 0,5 milliliter lyse buffer. Breng de suspensie over naar een 1,5 milliliter micro fuge buis en voeg vervolgens 0,5 milliliter gekoeld gebakken zuur gewassen glaskralen toe. Vortex de cellen gedurende vier 32ste intervallen, waarbij de buis op ijs wordt geplaatst gedurende 30 seconden tussen elk interval.

Voeg vervolgens nog eens 0,5 milliliter lyse buffer toe aan de 1,5 milliliter buis, centrifugeer bij 5.000 keer g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Breng het supernatant over naar een nieuwe 1,5 milliliter micro centrifugeerbuis en centrifugeer bij maximale snelheid gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.

Ten slotte brengt u het supinate over naar een nieuwe 1,5 milliliter micro centribuis. Het extract kan worden bewaard bij min 80 graden Celsius om het lysaat over te brengen naar de sucrosegradiënt. Plaats de punt van het pipet tegen de wand van de buis nabij het oppervlak van de gradiënt en leg het lysaat voorzichtig bovenop de gradiënt.

Voor een gradiënt van 35 milliliter wordt doorgaans 500 microliter lysaat geladen. Gebruik pincetten om de gradiënt voorzichtig in de emmer van een schommelende emmerrotor te laten zakken. Centrifugeer de gradiënten gedurende vier uur bij 100.000 keer g bij vier graden Celsius.

Ongeveer 30 minuten voor de voltooiing van de vier uur durende spin. Bevestig de naald aan de buisprikker en bevestig de pen aan de online absorptiefluorescentiemonitor. Zet de stroom aan voor de absorptiemonitor om een stabiele basislijn te bereiken voordat u monsters analyseert.

Elektronische acquisitie van het PolyZone-profiel kan eenvoudig in realtime worden verkregen door een DI 1 48 U data-acquisitie-eenheid aan te sluiten. Naar de chartrecorder, vul de spuitpomp met 50 milliliter florine noten met behulp van de omgekeerde stroom snelle instelling. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.

Verbind de slang van de spuit met de buisprikker. En zet kort de stroom van Flo inert aan op zes milliliter per minuut in de voorwaartse richting. Om de slang van eventuele luchtbellen te ontdoen, plaatst u een reeks buizen onder de slang aan het einde van de flowcel om monsters te verzamelen.

Bereid een ijsketel voor met een voorgevormde uitsparing voor het vasthouden van de centrifugeerbuis met de sucrosegradiënt. Wanneer de centrifugatie van vier uur voltooid is, verwijdert u voorzichtig de centrifugeerbuizen uit de centrifugerotor en plaatst u ze op ijs. Zorg ervoor dat u de gradiënten niet verstoort.

Om cellysaat te analyseren, plaats de gradiëntbuis op de buisprikker en verbind de bovenkant van de buis met de uitlaat en bevestig. Verhoog de onderste fase tot de centrifugeerbuis zodat de naald de bodem van de buis doorboort. Begin met het stromen van Florin alert in de voorwaartse richting met zes milliliter per minuut.

Zodra de fluit is begonnen te stromen in de buis, controleert u de beweging van de naald op de online UV-absorp