Het isoleren van stamcellen uit Soft musculoskeletale weefsels

Het algemene doel van deze procedure is om volwassen stamcellen te isoleren uit musculoskeletale weke delen zoals skeletspier. Dit wordt bereikt door eerst een biopsie van het weefsel te nemen, het te ontdoen en het fijn te snijden. De tweede stap van de procedure is om het weefsel enzymatisch te verteren.

De derde stap van de procedure is om de stamcellen te isoleren door herhaalde pre-platteringsstappen. De laatste stap van de procedure is het identificeren van de geïsoleerde stamcellen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de morfologische en cellulaire gedragingen van de cellen laten zien met behulp van immunofluorescentie, microscopie en/of flowcytometrie.

Hallo, ik ben y Lee van het Lab of Molecular Pathology in het Department of Orthopedic Surgery aan de Universiteit van Pittsburgh. Vandaag laat ik je zien hoe je een volwassen stamcel isoleert uit de weke delen van het musculoskeletaal systeem zoals skeletspier. Hallo, ik ben Dr. Johnny Ward.

Ik ben professor aan de University of Pittsburgh School of Medicine binnen het Department of Orthopedic Surgery. Ik werk, weet je, nauw samen met Dr. Young Lee en deze procedures om verschillende soorten stamcellen te isoleren uit skeletspier en andere weefsels zoals standaard. We gebruiken de procedures in ons laboratorium om stamcellen te isoleren voor fundamenteel onderzoek en toegepaste geneeskunde.

Laten we beginnen. De weefsels waaruit stamcellen kunnen worden geïsoleerd, omvatten pezen en skeletspieren die worden geoogst uit de tibia of soleus spieren van de achterpoot van wilde muizen. Na het verwijderen van restanten van huid en bot, plaats de weefsels in een schaal met koud HBSS aangevuld met 5% FBS.

Plaats vervolgens het weefsel afzonderlijk op collageen gecoate schalen met koud HBSS. We gebruiken skeletspierweefsel om de basisprocedures voor weefseldissociatie en -vertering te demonstreren. Gebruik microschaar of scalpelmessen om het skeletspierweefsel in een grove slurry te snijden, pH enzymatisch vertering van de weefsels.

Begin met het overbrengen van de MIT weefsel slurries naar afzonderlijke 15 milliliter buisjes in een centrifuge bij ongeveer 3.500 RPM bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder de SANE was door Resus te suspenderen in HBSS en herhaal de centrifugatie. Na het verwijderen van de supernatant, verteer de slurries door 10 milliliter voorverwarmde 0,2% collagenase toe te voegen.

Type 11 incubeer gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius, terwijl je de buisjes elke 10 minuten met de hand schudt wanneer de 60 minuten incubatie klaar is. Centrifugeer en resuspendeer vervolgens de slurries in 10 milliliter DYS ruimte oplossing. Incubeer gedurende 45 minuten bij 37 graden Celsius, terwijl je elke 10 minuten met de hand schudt. Na de 45 minuten incubatie centrifugeer en resuspendeer de slurries in 10 milliliter 0,2% trips in HBSS oplossing.

We incuberen meestal 15 tot 20 minuten bij 37 graden Celsius terwijl we de buisjes omkeren elke 10 minuten, de incubatie is voltooid. Wanneer voldoende enkele cellen zijn vrijgekomen uit de weefsels zoals hier geïllustreerd, centrifugeer de resulterende cellen en resuspendeer het cellenpellet in vijf milliliter proliferatie. Medium PM dissocieert de celsuspensie door de extract door een reeks naalden twee keer door een 18 gauge naald te laten gaan, dan eenmaal door een 23 gauge naald en tenslotte eenmaal door een 27 gauge naald.

Ten slotte, laat het cellenextract door een 70 micron cellenzaaier gaan om de prepl techniek te beginnen. Centrifugeer het zojuist bereide cellenextract en resuspendeer de pellets in proliferatie. Medium plateert vijf milliliter van de cellenmix op een collageen gecoate T 25 flacon en markeert als PP een, geïncubeerd bij 37 graden Celsius in een bevochtigde 5% koolstofdioxide incubator gedurende twee uur.

Na twee uur. Breng de niet-aangehechte cellen over naar een nieuwe collageen gecoate T 25 flacon en markeer als PP twee. Voeg vijf milliliter PM toe aan de vorige T 25 flacon gelabeld PP een.

Breng beide flessen terug naar de incubator voor 24 uur. Na 24 uur, breng niet-aangehechte cellen van PP twee over naar een nieuwe collageen ENC gecoate T 25 flacon en markeer deze als PP drie. Voeg vijf milliliter proliferatie medium toe aan de flacon gelabeld PP twee.

Breng de flessen terug naar de incubator. Herhaal de procedure elke 24 uur tot populatie PP zes. De stamcelpopulatie is gemaakt.

De geïsoleerde PP zes cellen zijn zeer weinig in aantal en moeten worden gehandhaafd in FBS rijk proliferatie medium. Dat verandert dagelijks. Hoewel de meeste cellen in de PP zes cultuur zullen sterven tijdens de volgende een tot twee weken van kweken.

Een grote gezonde PP zes populatie wordt meestal gemaakt na een extra een tot twee weken van expansie. Bewaar ook alle andere groepen van geschorste cellen, laat ze prolifereren en onderzoek ze regelmatig met behulp van een omgekeerd microscoop. De vroege aanhechtende cellen die zich hechten aan de PP een en PP twee flessen zijn meestal fibrotische cellen.

Cellen die zich hechten aan collageen gecoate flessen na een langere periode binnen 48 tot 96 uur. PP drie en PP vier zijn meestal myoblasten. Terwijl spier satellietcellen vaak meestal in PP vijf worden gezien, de latere prepl cellen 96 uur of later PP zes worden beschouwd als volwassen stamcellen en zien er klein, rond en doorschijnend uit.

Aan het begin van hun isolatie, kunnen ze verder worden gekarakteriseerd door immunohistochemie voor hun expressie van stamcelmarkers zoals stamcel, antigeen een en CDC 34. We hebben je net laten zien hoe je stamcellen isoleert van een tweede massa van de muis. Wanneer je deze procedure doet, is het belangrijk om te onthouden om steroïden te behouden tijdens alle procedures.

Zodra de stamcel is geïsoleerd, zorg ervoor om die cellen als lage dichtheid te kweken om de stamcelkarakteristieken van de cellen te behouden. Dus dat is het. Bedankt voor het kijken en veel succes met je ervaring. En ik wens je veel succes