Name: Kwantificatie van γH2AX Foci in weefselmonsters (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-28T17:33:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Leer een immunofluorescentieprotocol om γH2AX-foci in muizenweefsel te detecteren en te kwantificeren. Deze methode is geschikt voor het beoordelen van DNA-schade in ziekte-modellen en bij stralingsonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De steun van het Australian Institute of Nuclear Science and Engineering wordt erkend. TCK was de ontvanger van AINSE awards. Epigenomisch Medicine Lab wordt ondersteund door de National Health en Medical Research Council van Australië (566.559). LM wordt ondersteund door Melbourne Research (Universiteit van Melbourne) en Biomedical Imaging CRC aanvullende beurzen. De ondersteuning van Monash Micro Imaging (Drs Stephen Cody en Iska Carmichael) was van onschatbare waarde voor dit werk. MMT is dankbaar voor de deskundige hulp en advies van dr. Olga Sedelnikova van de National Institutes of Health.

Tissues <ol><li> Longweefsel, ingebed in mallen in optimale snij-temperatuur (LGO) verbinding 4583, werd doorsnede (5 micrometer) met behulp van een CM Leica 1950 cryostaat en gemonteerd op poly-L-lysine dia&#39;s. </li></ol> De bevroren monsters werden verkregen van dr. Simon Royce aan de Murdoch Children&#39;s Research Institute. Longweefsel werd verkregen van onbehandelde Balb / c muizen en van een muismodel van chronische allergische luchtwegaandoeningen die veel van de pathologische kenmerken van de menselijke astma zes shows. Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Animal Ethische Commissie van Onderzoek van de Murdoch Children&#39;s Institute, die voldoet aan de Australische Code of Practice voor de verzorging en het gebruik van proefdieren voor wetenschappelijke doeleinden in te stellen. <ol start="2"><li> Secties werden toegestaan ​​om droge lucht bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li></ol> Immunofluorescentiekleuring <ol><li> Secties werden gefixeerd met 2% (w / v) paraformaldehyde in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 20 minuten. </li><li> Secties werden geëquilibreerd met twee wasbeurten in PBS gedurende 15 minuten elk. </li><li> Secties werden behandeld met 70% ethanol (gekoeld tot -20 ° C) gedurende 20 minuten gevolgd door drie wasbeurten in PBS gedurende 10 minuten elk. </li></ol> Op dit punt dia&#39;s kunnen worden opgeslagen in verzegelde containers bij 4 ° C gedurende maximaal twee weken. <ol start="4"><li> Secties werden drie keer gewassen met PBS gedurende 10 minuten per stuk en vervolgens geblokkeerd met 100μL vers bereid in PBS met 8% BSA in PBS met 0,5% Tween-20 en 0,1% Triton X-100 (PBS-TT) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur . Alle incubaties werden uitgevoerd in een bevochtigde vlekken trog. </li><li> Secties werden gewassen met PBS-TT voor 5 minuten en een hydrofobe omtrek stond in het teken rond het weefsel met een Pap pen. </li><li> Excess buffer werd getipt en 100μl van primaire konijn polyklonaal anti-γH2AX antilichaam (1:500 verdund in 1% BSA in PBS, Millipore), werd toegevoegd aan elke sectie voor een 2 uur incubatie bij kamertemperatuur. Incubatie met de primaire antilichaam kan &#39;s nachts worden uitgevoerd bij 4 ° C. Voor verder bewijs, dat γH2AX brandpunten vertegenwoordigen DSB&#39;s, kan een primaire antilichaam dat een DSB reparatie eiwit ook worden gebruikt. Bijvoorbeeld, co-lokalisatie van γH2AX en fosfo-ATM is een veel gebruikte combinatie. </li><li> Secties werden twee keer gewassen in PBS-TT voor 5 minuten en geïncubeerd met 100μl van secundaire antilichaam (Alexa Fluor 488 geit anti-konijn IgG verdund 1:500, in 1% BSA, Invitrogen) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker . (Verwaterd antilichaam werd in het donker bewaard gedurende de procedure). </li><li> Secties werden drie keer gewassen met PBS-TT voor 5 minuten en geïncubeerd met 0.5mg/mL RNAse A gedurende 30 minuten bij 37 ° C. </li><li> Nucleaire tegenkleuring en montage werd uitgevoerd met Vectashield medium dat propidiumjodide. </li><li> De dia&#39;s werden verzegeld met nagellak en &#39;s nachts bewaard bij 4 ° C in het donker voor de analyse. </li></ol> Microscopie / Analyse <ol><li> Een Zeiss LSM510 Meta confocale microscoop werd gebruikt om beelden met behulp van de standaard GFP te verwerven (voor γH2AX - Alexa Fluor 488 geit anti-konijn IgG) en PI (543 nm) lasers. </li></ol> Beelden werden verworven in een Z-serie patroon met een stapgrootte van 0,5 micrometer. Tijdens de analyse werden de individuele vliegtuigen deconvoluted en gestapeld tot een maximum geprojecteerde beeld te produceren om de overlap van de brandpunten te minimaliseren. De methode van het creëren van een maximaal geprojecteerde beeld voorafgaand aan een deeltje tellen mag alleen worden gebruikt in omstandigheden waarin een dunne sectie (bv 5 urn) wordt gebruikt en waar de achtergrondkleuring is te verwaarlozen. Waar dikkere secties met een belangrijke achtergrond moet worden onderzocht, moet een meer complexe analyse, zoals 3D-object Counter zoals beschreven door Bolte en Cordelières (2006) worden gebruikt 7. <ol start="2"><li> Metamorph (Molecular Devices, USA) werd gebruikt om samengevoegd (rood en groen) beelden te creëren om nummers van de foci kwantificeren. </li></ol> Hoewel Metamorph kunnen worden gebruikt om brandpunten nummers kwantificeren, meestal bij het gebruik van weefsel foci worden handmatig geteld (door oog) voor een grotere nauwkeurigheid. Specifieke celtypen van belang kunnen geselecteerd worden voor kwantificatie, bijvoorbeeld longepitheelcellen. Dit kan worden gedaan op basis van histologie en onder verwijzing naar haematoxyline en eosine gekleurde seriële secties.

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+H2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li>
<li>Bhogal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+residual+gamma-H2AX+foci+in+murine+skin+are+dose+responsive+and+predict+radiosensitivity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo.</a> Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).</li>
<li>Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-H2AX+as+a+biomarker+of+DNA+damage+induced+by+ionizing+radiation+in+human+peripheral+blood+lymphocytes+and+artificial+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Space+Res%22%5BJournal%5D)">gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin.</a> Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).</li>
<li>Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+airway+remodeling+in+acute%2C+subacute%2C+and+chronic+models+of+allergic+airways+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).</li>
<li>Bolte, S. &amp, Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li>
</ol>

Voor de toepassing van deze demonstratie we muis longweefsel gebruikt van onbehandelde Balb / c muizen en van een muismodel van chronische allergische luchtwegaandoeningen. We gekwantificeerd verschillen in het aantal foci per cel met een iets hogere gemiddelden waargenomen in de beschadigde longen in vergelijking met onbehandelde delen. In het bijzonder, kwantificatie aangegeven 6,5 foci per / cel en 9,4 foci per / cel (handmatige telling van 20 cellen per sectie), in het onbehandelde weefsel en chronische allergische ...

<table><tbody><tr><td>Rundersereumalbumine (BSA)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>BSA (1%) wordt gebruikt om elke aspecifieke antilichaambinding te blokkeren. Primaire en secundaire antilichamen worden verdund in BSA.</td></tr><tr><td>PBS (zonder Ca2+)&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; en Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583</td><td></td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus</td><td>Poly-L-lysine slides</td><td>Menzel-Glaser</td><td>SF41296SP</td><td>Trekt bevroren weefselcoupes elektrostatisch aan en vermindert de noodzaak voor aanvullende coatings en adhesieven.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Reagens</td><td>Calbiochem</td><td>655205</td><td>Tween 20 (0,5%) is een detergent om cellen te permeabiliseren</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100 (0,1%) werd gebruikt om cellen te permeabiliseren.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-&amp;#947;H2AX (konijn polyklonaal antilichaam)</td><td>Primaire antilichaam</td><td>Upstate, Millipore</td><td>07-164</td><td>Verdunning van primaire antilichaam (1:500), in 1% BSA.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 geit anti-konijn IgG (H+L)</td><td>Secundair antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td>Verdunning van secundair antilichaam (1:500), in 1% BSA.</td></tr><tr><td>Ethanol (70%)</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>BSPEL316</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Reagens</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield PI</td><td>Reagens</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1300</td><td>Een op glycerol gebaseerd montage medium dat propidiumjodide bevat (een rode kernkleuring). Dit medium moet worden gebruikt met een olie-immersielens die overeenkomt met de brekingsindex ervan.&lt;br/&gt;&lt;Het lijkt erop dat er geen brontekst is opgegeven om te vertalen, enkel een HTML-tag (`br/`). Indien er tekst beschikbaar is, vertaal ik deze graag voor u.&gt;Opmerking: Veelgebruikte DNA-kleuring: 4,6-diamidino-2-fenylindooldihydrochloride (DAPI). Kan alleen worden gebruikt met microscopen die over de juiste excitatielaser beschikken.</td></tr><tr><td>Mini PAP-pen</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>008877</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasplaatjes (22x50mm)</td><td></td><td>Menzel-Glaser</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>Coplin-glas</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>Kleuringsbak</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta Confocale microscoop</td><td></td><td>Confocale microscoop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM Leica 1950 cryostaat</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Software voor beeldanalyse</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kwantificatie van γh2ax foci in weefselmonsters

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA dubbel-breuken (DSB&#39;s) zijn bijzonder dodelijk en genotoxische letsels, die kan ontstaan ​​door endogene (fysiologische of pathologische) processen of door exogene factoren, met name ioniserende straling en radiomimetische verbindingen. Fosforylatie van de H2A histon-variant, H2AX, op de serine-139 residu, in de zeer geconserveerd C-terminale SQEY motief, de vorming van γH2AX, is een vroege reactie op DNA-dubbel-breuken<sup&gt; 1</sup&gt;. Deze fosforylatie evenement wordt gemedieerd door het fosfatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) familie van eiwitten, ataxie telangiectasia gemuteerd (ATM), DNA-eiwit kinase katalytische subeenheid en ATM en RAD3-gerelateerde (ATR)<sup&gt; 2</sup&gt;. Over het geheel genomen DSB inductie resulteert in de vorming van discrete nucleaire γH2AX foci die kan gemakkelijk worden opgespoord en gekwantificeerd door immunofluorescentie microscopie<sup&gt; 2</sup&gt;. Gezien de unieke specificiteit en gevoeligheid van deze marker, een analyse van γH2AX foci heeft geleid tot een breed scala aan toepassingen in het biomedisch onderzoek, met name in de straling biologie en nucleaire geneeskunde. De kwantificatie van γH2AX foci is meest onderzocht in celkweek systemen in het kader van ioniserende straling-geïnduceerde DSB&#39;s. Naast de cellulaire radiosensitiviteit, hebben immunofluorescentie gebaseerde testen ook gebruikt om de werkzaamheid van de straling-modificerende verbindingen te evalueren. Daarnaast heeft γH2AX is gebruikt als een moleculaire marker om de effectiviteit van verschillende DSB-inducerende verbindingen te onderzoeken en is recent aangekondigd als belangrijke marker van veroudering en ziekte, met name kanker<sup&gt; 3</sup&gt;. Verder, immunofluorescentie-gebaseerde methoden zijn aangepast aan te passen detectie en kwantificering van γH2AX foci<em&gt; Ex vivo</em&gt; En<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 4,5</sup&gt;. Hier tonen we een typische immunofluorescentie methode voor de detectie en kwantificering van γH2AX foci in muis weefsels.

Kwantificering van DNA dubbelstrengs breuken aan de hand van γH2AX foci is uitgegroeid tot een instrument van onschatbare waarde, met name in de biologie straling, voor de evaluatie van weefsel stralingsgevoeligheid en de effecten van de straling wijzigen van verbindingen. Hier laten we zien het gebruik van een immunofluorescentie test voor kwantificatie van γH2AX foci in weefselmonsters.

Kwantificatie van γH2AX Foci in weefselmonsters

DNA-dubbelstrengsbreuken (DSB's) zijn bijzonder dodelijke en genotoxische laesies, die kunnen ontstaan door endogene (fysiologische of pathologische) ...

Hallo, mijn naam is Michelle Tang van de laboratoria voor Epigenomische Geneeskunde en Humane Epigenetica. Deze worden geleid door Dr. Tom Carianne, universitair docent ASAM Holster bij het Baker IDI Heart and Diabetes Institute. Vandaag zal ik een gamma H2AX-immunofluorescentie-assay in vivo demonstreren om de hoeveelheid DNA-schade in ziekweefsels te bepalen.H2AX is een histonvariant die ongeveer 2 tot 10% van het totale cellulaire histon H2A vertegenwoordigt en snel wordt gefosforyleerd op serine 139 in zoogdiercellen. In reactie op DNA-schade staat de gefosforyleerde vorm van H2AX ook bekend als γH2AX, en het is vastgesteld dat er een directe correlatie bestaat tussen het aantal dubbelstrengse breuken en γH2AX. γH2AX is een gevoelige moleculaire marker en het is aangetoond dat het een vroege indicator is van dubbelstrengse breuken. Daarom is het een nuttige techniek om DNA-schade te detecteren.Gamma H2AX kan worden gevisualiseerd als nucleaire foci op de plaatsen van DNA-schade onder fluorescentiemicroscopie. Voor dit experiment gebruik ik muizenlongweefsels verkregen van Dr. Simon Royce van het Murdoch Children's Research Institute. Ik zal DNA-schade onderzoeken in longweefsels van een muismodel voor chronische allergische luchtwegziekten, dat veel van de pathologische kenmerken van menselijk astma vertoont, waaronder hyperreactiviteit van de luchtwegen, remodellering van de luchtwegen en ontsteking van de luchtwegen.Laten we beginnen met het experiment. We starten hiermee door de monsters naar -20 °C te brengen door ze gedurende ongeveer 20 minuten in de cryostaat te plaatsen. Voor een optimale snijtemperatuur van de SRO's worden microscopische objectglazen gebruikt, zodat de weefselcoupes niet van de glaasjes loslaten.Tijdens de immunofluorescentiekleuring wordt OCT gebruikt om de monsters aan de houder te bevestigen; plaats de houder op het snijblok en zorg ervoor dat deze stevig is bevestigd. Stel de cryostaat in om weefselcoupes van vijf micrometer te snijden. Begin voorzichtig met het snijden door de monsters met een penseel naar u toe te trekken. Plaats de microscoopglasplaat boven de coupes; deze moeten aan het glasoppervlak hechten. Laat de coupes één uur drogen bij kamertemperatuur om er zeker van te zijn dat al het vocht is verwijderd voordat u verdergaat.Eerst fixeren we de weefselcoupes gedurende 20 minuten met 2% paraldehyde, bereid in PBS zonder calcium en magnesium. Giet het overtollige paraldehyde af en plaats de objectglazen in een Copeland-pot voor twee wasbeurten van 15 minuten in PBS om te permeabiliseren; na de permeabilisatiestap worden de celmembraanmonsters 20 minuten behandeld met 70% ethanol bij -20 °C. De monsters worden drie keer gewassen in PBS, telkens gedurende 10 minuten.Verwijder elke site individueel om te voorkomen dat de weefselcoupes uitdrogen. Absorbeer overtollig PBS van de objectglas en blokkeer vervolgens de coupes met 8% BSA in PBS met 0,5% tussen 20 en 0,1% Triton X 100, ook wel bekend als P-B-S-T-T. Deze objectglazen worden gedurende één uur bij kamertemperatuur geïncubeerd, waarna de geïncubeerde monsters vijf minuten worden gewassen met P-B-S-T-T.PBS TT wordt gebruikt om de penetratie van antilichamen in de nucleus te vergemakkelijken. De coupes worden vervolgens afgespoeld en gedroogd om overtollig P-B-S-T-T te verwijderen. Met een pap-pen wordt een cirkel rond de coupes getrokken om de hoeveelheid gebruikte reagentia te beperken.Er werd gebruikgemaakt van een primair antilichaam, een anti phospho gamma H tox, snel polyklonaal antilichaam. Een verdunning van 1:500 werd bereid in 1% BSA in P-B-S-T-T. Deze coupes werden in de bevochtigingskamer geplaatst en gedurende twee uur bij kamertemperatuur geïncubeerd.Klop de primaire antilichamen van de objectglazen af voordat er twee wasbeurten van vijf minuten in P-B-S-T-T worden uitgevoerd om overtollig primair antilichaam te verwijderen. Neem de objectglazen uit en blot het overtollige P-B-S-T-T weg. Er werd gebruikgemaakt van het floor 4 88 geiten anti Reid IJJ-antilichaam.Een verdunning van 1 op 500 van het secundaire antilichaam, bereid in 1% BSA in P-B-S-T-T, werd aan de monsters toegevoegd. De coupes werden vervolgens gedurende één uur geïncubeerd in een vochtige kamer; giet het secundaire antilichaam af voordat er drie keer gewassen wordt gedurende vijf minuten met N-P-B-S-T-T om overtollig secundair antilichaam te verwijderen.Bedek de Copeland-pot met aluminiumfolie om blootstelling aan licht tijdens elke wasstap te voorkomen. Verwijder de objectglazen en dep overtollig P-B-S-T-T weg. De toevoeging van 0,5 mg/mL RNAs A in PBS werd gebruikt om eventuele cytoplasmatische kleuring te verminderen.De monsters worden vervolgens 30 minuten geïncubeerd bij 37 °C met 5% koolstofdioxide. Na de incubatie wordt de RNA A afgegoten en worden de monsters kort gewassen in P-B-S-T-T om te voorkomen dat de coupes uitdrogen. Houd de monsters in het aluminiumfolie gewikkeld voordat het instreekmedium wordt toegevoegd.Verwijder de coupes één voor één en blot het overtollige P-B-S-T-T weg. Voeg over elke sectie een vector shield montagemedium toe dat propidiumjodide, een rode kernkleurstof, bevat. Laat vervolgens voorzichtig een dekglas zakken en probeer te voorkomen dat er luchtbellen worden ingesloten, en blot daarna eventueel overtollig vector shield weg op absorbent papier.Polijst vervolgens de randen van het dekglas om deze af te dichten en te voorkomen dat de monsters uitdrogen. Bewaar de monsters tot slot op een donkere plaats bij vier graden Celsius tot de preparaten nodig zijn voor microscopie. Een Zeiss LSM 510 Meta confocale microscoop werd gebruikt voor het verkrijgen van digitale beelden met een 63x olie-immersieobjectief, waarbij argon- en heliumneonlasers werden gebruikt bij een golflengte van 488 nanometers voor Alexa Fluor 488 en 543 nanometers voor propidiumjodide-kleuring.Elk veldbestand bestond uit acht tot 15 optische Z-serie koppelingen met een stapgrootte van 0,5 micrometers en een eenmalige zoom. Beelden worden geëxporteerd als individuele TIF-bestanden en geanalyseerd met metamorph Images. De beelden die zijn verkregen met de zes LSM vijf 10 meta focale microscoop worden geopend in het metamorph-programma voor beeldanalyse en initiële handmatige telling. Fluorescentiebeelden die als Z-serie zijn verkregen, worden gedeconvolueerd en gestapeld om een 2D-beeld te produceren met behulp van maximumprojectiefilters.Dit werd gedaan om het verlies van minder intense foci te minimaliseren. De maximale projectiebeelden worden omgezet in een binair beeld en morfologische filters zoals de top hat worden toegepast om de achtergrond te verminderen en de gevoeligheid van de detectie van foci te verbeteren. De overeenkomstige propidiumjodide-beelden worden geladen en de kernregio's worden geïdentificeerd.Deze gebieden worden geaccentueerd door handmatig regio's rond de kernen te tekenen om het aantal foci per veld te tellen. De regio's worden overgebracht naar de top-hat-afbeeldingen en er worden lichte drempelwaardefilters toegepast. De drempelwaarde is zorgvuldig gekozen door middel van visuele vergelijking in overeenstemming met de foci en om te voorkomen dat er achtergrondruis binnen elk veld wordt opgenomen.Geïntegreerde morpho-analyse voor IMA werd gebruikt om de foci te tellen. Als alternatief kunnen handmatige tellingen worden uitgevoerd om de betrouwbaarheid van de resultaten te waarborgen. Hiermee is het protocol voor immunofluorescentiekleuring in vivo om de hoeveelheid DNA-schade in ziekteweefsels te bepalen voltooid.Deze techniek is geschikt voor het detecteren van DNA-schade veroorzaakt door verschillende stimuli. Desalniettemin is deze het meest geschikt voor het evalueren van reacties op ioniserende straling en radiogevoeligheid. Dat is alles.Bedankt voor het kijken.

quantitation-of-h2ax-foci-in-tissue-samples

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Kwantificering van DNA dubbel-strengs strepen met behulp van γH2AX vorming als een moleculaire marker is uitgegroeid tot een onmisbaar instrument in straling biologie. Hier laten we zien het gebruik van een immunofluorescentie assay voor de kwantificering van γH2AX foci na blootstelling van cellen aan straling.

Kwantificering van γH2AX Foci in reactie op ioniserende straling

Microscopische analyse van γH2AX foei, welke vorm na de fosforylatie van H2AX op Ser-139 in reactie op DNA dubbelstrengs breuken, is uitgegroeid tot een onmisbaar instrument in straling biologie. Hier hebben we gebruik gemaakt van een antilichaam aan mono-gemethyleerde histon H3 op lysine 4 als een epigenetische marker van actief transcriberen euchromatin, om de ruimtelijke verdeling van de straling-geïnduceerde γH2AX formatie binnen de kern te evalueren.

Evaluatie van de ruimtelijke verdeling van γH2AX volgende ioniserende straling

In this video, we describe the immunofluorescence microscopy technique to detect specific DNA damage response proteins localized at the sites of DNA double-strand breaks in human mononuclear cells. The proteins are recognized by specific primary antibodies, which in turn bind to fluorophore-tagged secondary antibodies that fluoresce during microscopic visualization, enabling visualization of the proteins as distinct fluorescent foci within the cell nuclei.

Immunofluorescence Microscopy for the Analysis of DNA Double-Strand Breaks

Cellular veroudering, de onomkeerbare toestand van de celcyclus, kan worden geïnduceerd door verschillende cellulaire stress. Hier beschrijven we protocollen bij cellulaire veroudering en methoden ertoe te brengen markers van veroudering te beoordelen.

Technieken voor het induceren en te kwantificeren Cellulaire senescentie

Dit manuscript biedt een protocol voor de analyse van DNA dubbele-strand einden door immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1.

Immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 voor het analyseren van de vorming en de reparatie van DNA dubbele-strand einden

Reparatie van dubbele streng DNA pauzes is een dynamisch proces, waarbij niet alleen de vorming van reparatie complexen in de pauzes, maar ook hun resolutie na de laesie is gericht. Hier, gebruiken we immunofluorescentie microscopie voor voorbijgaande en langdurige double-stranded pauzes als een instrument om te ontleden dit genoom onderhoud mechanisme.

Karakterisering van de DNA-herstelsynthese op Transiënten- en Long-lasting Double-streng DNA-einden door immunofluorescentie microscopie

De gepresenteerde methode combineert de kwantitatieve analyse van DNA Double-strand Breaks (DSBs), celcyclus verdeling en apoptosis om de celcycluspecifieke evaluatie van de inductie en reparatie van DSB mogelijk te maken, evenals de gevolgen van herstel fouten.

Celcyclus-specifieke meting van γH2AX en apoptosis na genotoxische stress door flow Cytometrie

Na DNA-schade activeren menselijke cellen essentiële hersteltrajecten om de integriteit van hun genoom te herstellen. Hier beschrijven we de methode van indirecte immunofluorescentie als een middel om DNA-hersteleiwitten te detecteren, hun ruimtelijke en temporele rekrutering te analyseren en de eiwitinteractie op de sites van DNA-schade te helpen ondervragen.

Visualisatie van DNA Repair Proteins Interaction door Immunofluorescentie

Dit protocol presenteert de diavoorbereiding en geautomatiseerde scoring van de γ-H2AX foci assay op perifere bloedlymfocyten. Om de methode en gevoeligheid van de test te illustreren, werden geïsoleerde lymfocyten in vitrobestraald . Deze geautomatiseerde methode van DNA DSB-detectie is nuttig voor snelle en high-throughput biologische dosimetrietoepassingen.

Een geautomatiseerde microscopische scoringsmethode voor de γ-H2AX foci assay in menselijke perifere bloedlymfocyten

Dit protocol presenteert een methode om de vorming en reparatie van DNA-dubbelstrengsbreuken te beoordelen door de gelijktijdige detectie van γH2AX- en 53BP1-foci in interfasekernen van met bleomycine behandelde menselijke perifere lymfocyten.

Dubbele immunofluorescentie van γH2AX en 53BP1 in humane perifere lymfocyten

Hier presenteren we een eenvoudig en snel protocol voor de detectie van eiwitinteractie op DNA-schadeplaatsen.

Nabijheidsligandtest om eiwitten te lokaliseren op plaatsen van DNA-schade

Leer een immunofluorescentieprotocol om γH2AX-foci in muizenweefsel te detecteren en te kwantificeren. Deze methode is geschikt voor het beoordelen van DNA-schade in ziekte-modellen en bij stralingsonderzoek.

Kwantificatie van γH2AX Foci in weefselmonsters

Meer video's verkennen