Genoom-brede analyse met behulp van chip Isoform-specifieke Gene targets te identificeren

Het algemene doel van het volgende experiment is om genomische doelen van KDM vijf a Jared een, een RBB twee histon demethylase te identificeren. Dit wordt bereikt door voorbereiding van cross-linked chromatine dat is gesonificeerd om DNA-fragmenten van de juiste grootte te produceren als tweede stap. RBB twee gebonden DNA-fragmenten worden geïmmunoprecipiteerd met RBB twee antilichamen.

Vervolgens wordt het teruggewonnen genomische DNA versterkt door PCR voor sequentiebepaling. Ten slotte worden Illumina gesequencede korte lezingen uniek uitgelijnd op het menselijk genoom, en significante pieken worden geïdentificeerd en geannoteerd aan de dichtstbijzijnde genen. Om de rbbb twee doelgenen te identificeren worden resultaten verkregen die moleculaire functies laten zien die geassocieerd zijn met Rrb B twee doelgenen op basis van genoom-wide identificatie van Rbbb twee verrijkte regio's.

Hallo, ik ben Mike. Zij komt uit het laboratorium van Dr. Elizabeth Bencia in het Department of Biochemistry and Molecular Genetics aan de University of Illinois in Chicago. En ik ben ala uit het laboratorium van Biomedical genomics geleid door Dr. NGA aan de BARCEL Biomedical Research Park University PO P fea.

En ik ben Danielle Dal. En ik ben William Richter. We zijn allebei ook in het Benevolence Skill Lab.

Vandaag gaan we je een procedure voor chromatine, immunoprecipitatie en sequentiebepaling laten zien. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de bindingsplaats van zijn dermatoloog te bestuderen. Dus laten we beginnen.

Om deze procedure te starten, kweek ongeveer 10 tot de achtste cellen. Voor elke immunoprecipitatie of ip. Hier, diffuus osteolytisch lymfoom.

U 9 37 cellen worden gebruikt en geïnduceerd voor monocytische differentiatie met TPA gedurende 96 uur na celgroei bij formaldehyde oplossing direct in het medium tot een eindconcentratie van 1%. Draai vervolgens de flacon kort en laat ze 10 minuten op kamertemperatuur zitten. Aspteer vervolgens het medium en spoel de cellen met 15 milliliter ijskoud PBS. Herhaal deze wassing eenmaal.

Voeg vervolgens zes milliliter lysis buffer één toe aan elk van de flessen op ijs. Wieg vervolgens de flessen gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Verzamel tenslotte de cellen met een celschraper en breng ze over naar 15 milliliter conische buisjes.

Op dit punt kunnen de cellen worden bewaard bij min 80 graden Celsius. Als de cellen bevroren waren, haal ze eruit. Eenmaal ontdooid, centrifugeer de cellen en gooi de overtollige vloeistof weg.

Spoel vervolgens de cellen opnieuw op in zes milliliter lysis buffer twee, wieg de buisjes voorzichtig op kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Herhaal de centrifugatie en spoel de cellen opnieuw op in 2,5 milliliter lysis buffer drie. Bereid vervolgens de suspensie voor voor sonicatie door deze in een beker met ijskoud water te plaatsen met de microtip van een Branson 450 sonier ingesteld op tussen 50 en 60% amplitude.

Soniceer de oplossing gedurende een 32ste constante burst en koel op ijs. Herhaal deze pulsen gedurende één minuut 10 tot 15 keer, pipet vervolgens de inhoud van de buis omhoog en omlaag en breng hem over naar een nieuwe buis. Blijf de oplossing pulseren en afkoelen.

Na de sonicatie, voeg 10% Triton X 100 toe aan een tiende van het oplossingsvolume. Breng vervolgens de lysaten over naar 1,5 milliliter centrifugebuisjes, en centrifugeer het puin eruit in een microcentrifuge voorafgaand aan chromatine, immunoprecipitatie of chip. Bewaar 50 microliter van het cellysaat als de input-monster.

Combineer vervolgens het opgeruimde cellysaat met dyna beads gebonden aan antilichamen die eerder zijn bereid zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Wieg het mengsel in aanvulling op de 50 microliter input-monster gedurende een nacht bij vier graden Celsius. Was de beads met één milliliter wasbuffer.

Gebruik vervolgens een magnetische stand om de beads te verzamelen en het supernatant te verwijderen. Herhaal deze wassing zes tot acht keer. Voer een laatste wassing uit met één milliliter TE plus 50 millimolar natriumchloride.

Centrifugeer de beads in een microcentrifuge na centrifugatie, aspireer eventueel resterend TE-buffer. Voeg vervolgens 100 microliter elubuffer toe aan de monsters. Direct daarna.

Incubeer de monsters gedurende 10 tot 15 minuten bij 65 graden Celsius. Kras de buisjes elke twee minuten tegen een 1,5 milliliter buis om de beads in suspensie te houden. Verzamel de beads met behulp van centrifugatie en de magnetische stand en breng de SNAT over naar een PCR-buis.

Haal vervolgens het eerder opgeslagen input-monster op en voeg drie volumes van de elutiebuffer toe. Plaats tenslotte de IP- en inputmonsters in de thermische cycler gedurende een nacht bij 65 graden Celsius. Om de cross-links om te keren, voeg de volgende dag één volume TE-buffer toe aan de monsters.

Voeg vervolgens RNAs A toe tot een eindconcentratie van 0,2 microgram per microliter. Incubeer de monsters in de thermische cycler gedurende één tot twee uur bij 37 graden Celsius. Voeg na incubatie proteinase K toe tot een eindconcentratie van 0,2 microgram per microliter.

Incubeer vervolgens de monsters in de thermische cycler gedurende twee uur bij 55 graden Celsius. Extraheer vervolgens de monsters eenmaal met één volume fenol. Extraheer de monsters een tweede keer met één volume fenyl chloroform isoamyl alcohol.

Extract tenslotte de monsters nogmaals met één volume chloroform isoamyl alcohol. Voeg vervolgens 30 microgram glycogen toe aan elk monster. Voeg ook natriumchloride toe tot een eindconcentratie van 0,2 molair en twee volumes ethanol aan de monsters.

Incubeer ze gedurende 30 minuten bij min 80 graden Celsius. Na incubatie, centrifugeer de monsters en gooi het overtollige weg. Was de pellets met 500 microliter 75% ethanol, droog vervolgens de pellets en breng ze opnieuw op in 40 microliter water.

Om de grootte van de DNA-fragmenten te controleren die zijn geproduceerd door de SONICATION-procedure, laad vijf microgram van het gezuiverde input-monster in een 1,8% agrogel en laat de gel lopen. De sonicatieprocedure zou fragmenten moeten produceren in het bereik van 150 tot 350 basenparen. Als de fragmenten niet in dit