Name: Intraperitoneale injectie in de Adult zebravis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Leer intraperitoneale injectie bij volwassen zebravis met koudwateranesthesie en een NanoFil-microspuit. Deze methode maakt nauwkeurig onderzoek naar glucosehomeostase en metabole processen in Danio rerio mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deze studie werd ondersteund door de Juvenile Diabetes Research Foundation te verlenen 5-2007-97 (tot VEP), door National Institute of Diabetes en Maag-, Darm-en Kidney Diseases beurzen R01DK064973 (tot VEP), R01DK48494 (tot LHP), T32DK07074 (ondersteunt SCE), K01DK083552 (naar MDK), en door P60DK20595 aan de Universiteit van Chicago Diabetes Research and Training Center. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de NIDDK of de NIH.

1. Pre-injectie Voorbereidingen <ol><li> Snel de vis voor ten minste 24 uur voorafgaand aan de injectie. Dit zal het legen van de darm-lamp (maag) inhoud. De basis vasten protocol is om de vissen te dragen, op hun normale dichtheid, met een schone tank, dan onthouden eten. Voor de langere termijn vasten dat strengere voorwaarden vereist (bijv. voor bloedglucose studies), zie aanvullende overwegingen in de discussie. </li><li> Bereid Cortland zoutoplossing (Perry et al.., 1984). Voor een 100 ml volume, Los de volgende in gedistilleerd water: 725 mg NaCl (124,1 mM) 38 mg KCl (5,1 mM) 41 mg Na 2 HPO 4 (2,9 mm) 24 mg MgSO 4 ∙ 7H 2 O (1,9 mm) 16 mg CaCl 2 ∙ 2H 2 O (1,4 mm) 100 mg NaHCO 3 (11,9 mM) 4 g polyvinylpyrrolidon (PVP) (4%) 1000 USP eenheden heparine Filter, steriliseren en bewaren bij 4 ° C. </li><li> Bereid de microscoop. <ul><li> Bedek de microscoop voet met plasticfolie voor de bescherming in geval van lozingen. </li><li> Plaats een papieren handdoek op de top van de plastic verpakking. De chirurgische tafel zal zitten op de top van de papieren handdoek. </li><li> Pre-scherpstelling door het bekijken van de chirurgische tafel en zich te concentreren op de spons. </li></ul> Tip: Leg je vinger op de top van de spons en de focus op dat. Dit zal elimineren of te minimaliseren verder focale aanpassing zodra de vis is op de chirurgische tafel. </li><li> Weeg de vis. <ul><li> Vul een bekerglas van 500 ml ongeveer 1 / 3 vol met vis faciliteit water. </li><li> Tarra de balans. </li><li> Verzamel de vis met behulp van een net. Wick overtollig water uit de buurt van het net en de vis door kort deppen het net op keukenpapier. Breng de vis aan de beker. </li><li> Weeg de vis. </li><li> Breng de vis op een schone tank. </li><li> Breng elke vis gewogen om zijn eigen label tank. </li><li> Bereken het injectievolume voor elke vis op basis van vis gewicht. </li></ul></li><li> Bereid de spuit en de bijbehorende injectiemateriaal. Voor injectie, adviseren wij een 35G afgeschuind stalen naald en een 10 ul NanoFil injectiespuit. Bereid de spuit en NanoFil silflex buizen volgens de instructies van de fabrikant. Het is belangrijk om eventuele luchtbellen uit de spuit en slangen. Na het vullen van de spuit en slangen, monteert u de spuit op de pomp, en het programma de injectie volume voor de eerste vis. </li><li> Bereid de chirurgische tafel. <ul><li> Snijd een zachte spons (zoals # L800-D, Jaece Industries), zodat het is ongeveer 20 mm in de hoogte. Op het plat gezicht, een snit die is 10-15 mm diep. Deze snede is de trog dat de vissen zal houden voor injectie. </li><li> Stel de spons in een 60 mm petrischaal. </li><li> Zet de petrischaal met een spons in een voldoende omvang pipetpunt deksel. Het deksel moet groot genoeg zijn om water vast te houden om te helpen spons temperatuur te houden, maar het moet ondiep genoeg om niet in de weg. We maken gebruik van een deksel van een P200 tip box die is 11,4 cm L x 7,7 cm B x 1,5 cm D. </li></ul> Deze drie items samen gemonteerd (spons in petrischaal in het deksel) vormen de chirurgische tafel. </li><li> Bereid de narcose. <ul><li> Maak gemalen ijs met behulp van blokjes gemaakt van vis faciliteit water. </li></ul> Tip: Met behulp van typische ijsblokjes, het duurt drie trays tot 10-12 vissen verdoven. <ul><li> Vul een schone emmer ijs met het gemalen ijs. </li><li> Doe de chirurgische tafel in een grotere container, zoals een 2.4 liter Rubbermaid voedsel opslag container. </li><li> Giet wat faciliteit water (warm) in de buitenste container en de chirurgische tafel. Houd een reserve van warm water voorziening in de buurt. </li><li> Leg een thermometer in de buitenste container. </li></ul></li></ol> 2. Anesthesie, injectie en herstel <ol><li> Plaats de verdoving buitenste container plus chirurgische tafel naast de microscoop. De buurt is de emmer met ijs chips. </li><li> Breng het water temperatuur tot 17 ° C door het toevoegen van ijs chips. Belangrijk: Ga niet onder 17 ° C voor deze stap. </li><li> Gebruik een net om de vis naar de buitenste container. </li><li> Voeg langzaam ijs chips om de container om de temperatuur omlaag te brengen tot 12 ° C, in de loop van enkele minuten. </li><li> Monitor vis gedrag: Bij 17 ° C of iets lager, de vis zal typisch horizontaal gespreid zijn borstvinnen, snik, en hebben een snelle operculum bewegingen. Naarmate de temperatuur daalt, zullen de vissen zwemmen langzamer en eindelijk te stoppen met zwemmen. Als de chirurgische vlak van anesthesie is benaderd, zullen hijgend stoppen en operculum bewegingen zal vertragen. De vis is klaar voor injectie wanneer hij reageert niet op worden behandeld. Voor de meeste vissen, 12 ° C is voldoende. Grotere vissen kan verlangen kouder water. </li><li> Als de gewenste temperatuur is bereikt (~ 12 ° C of kouder), drukt u op de spons om het te verzadigen. </li><li> Houd uw vingers in het koude water voldoende, zodat ze niet zullen warm-up van de vis en breng het uit de verdoving tijdens de behandeling. </li><li> Met koude vingers voorzichtig overdracht van de vis naar het dieptepunt van de spons. Plaats de vis met de buik omhoog en de kieuwen in de trog. </li><li> Snel overbrengen van de chirurgische tafel om de microscoop podium. </li><li> Snel te werken, zorgvuldig steek de naald in de middellijn tussen de buikvinnen. De naald moet craniaal punt en dichter bij de bekkengordel ingebracht dan aan de anus. U moet in staat zijn om te voelen wanneer de naald is diep om het lichaam muur. Injecteer de juiste volume en trek de naald. </li><li> Na injectie, onmiddellijk weer over de vis aan zijn warm-water (~ 28,5 ° C) tank voor herstel door het vrijgeven van de vis uit de spons over de tank water. Tip: Als de vis niet begint te zwemmen onmiddellijk, helpen te herstellen door voorzichtig schudden water naar de kieuwen. </li><li> Controleer de naald. Af en toe een schaal kan worden gemonteerd en moet worden verwijderd voordat de volgende injectie. </li><li> Voor de volgende injecties, gebruik van warm water mogelijkheid om de narcose kamer temperatuur van het water terug te brengen tot 17 ° C alvorens de volgende vis. </li></ol> 3. Representatieve resultaten: <img src="/files/ftp_upload/2126/2126fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Representatieve resultaten na intraperitoneale injectie van 0,5 mg / g glucose of voertuig. Vissen waren gevast gedurende 72 uur voorafgaand aan de injectie. De x-as geeft de tijd, post-injectie. Gemiddelde ± SEM.

<ol><li>Perry, S. F., Davie, P. S., Daxboeck, C., Ellis, A. G., Smith, D. G. Perfusion methods for the study of gill physiology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPerry%2C+SF+%22Fish+Physiology+Volume+X%3A+Gills%2C+Part+B%3A+Ion+and+Water%22">Fish Physiology Volume X: Gills, Part B: Ion and Water</a>. Hoar, W. S., Randall, D. J. , Academic Press, Inc. Orlando. 325-388 (1984).</li>
<li>Brown, L. A. Anesthesia and restraint. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrown%2C+LA+%22Fish+Medicine%22">Fish Medicine</a>. Stoskopf, M. K. , Saunders Company. Philadelphia. 79-90 (1993).</li>
<li>Eames, S. C., Philipson, L., Prince, V. E., Kinkel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+sugar+measurement+in+zebrafish+reveals+dynamics+of+glucose+homeostastis%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostastis.</a> Zebrafish. 7, 205-213 (2010).</li>
<li>Chavin, W., Young, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+in+the+determination+of+normal+serum+glucose+levels+of+goldfish+Carassius+auratus+L%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol%22%5BJournal%5D)">Factors in the determination of normal serum glucose levels of goldfish Carassius auratus L.</a> Comp Biochem Physiol. 33, 629-653 (1970).</li>
<li>Groff, J. M., Zinkl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematology+and+clinical+chemistry+of+cyprinid+fish.+Common+carp+and+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Exot+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Hematology and clinical chemistry of cyprinid fish. Common carp and goldfish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2, 741-776 (1999).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. Oxford. 7-37 (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , University of Oregon Press. Eugene. (1995).</li>
<li>Iwama, G. K., Ackerman, P. A. Anaesthetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIwama%2C+GK+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+of+Fishes%2C+Volume+3%3A+Analytical+Techniques%22">Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, Volume 3: Analytical Techniques</a>. Hochachka, P. W., Mommsen, T. P. , Elsevier. Amsterdam. 1-15 (1994).</li>
<li>Reavill, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+diagnostic+and+clinical+techniques+for+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Exot+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Common diagnostic and clinical techniques for fish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9, 223-235 (2006).</li>
<li>Stoskopf, M. K. Surgery. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStoskopf%2C+MK+%22Fish+Medicine%22">Fish Medicine</a>. Stoskopf, M. K. , Saunders Company. Philadelphia. 91-97 (1993).</li>
</ol>

Intraperitoneale injectie omvat vijf stappen: vasten, wegen, verlamming, injectie, en herstel. Voor elke stap zijn er best practices die kunnen zorgen voor succes. Succes bestaat uit een gezonde vissen patiënt als een goede experimentele resultaat. Vasten: Een 24-uur snel moet legen van de darm lamp. Deze praktijk is afkomstig van de vis veterinaire literatuur (bijv. Brown 1993). Extra vasten overwegingen worden hieronder besproken. Langere termijn vasten: We hebben vastgesteld dat een 72-uur vasten is nodig om de bloedglucose verlagen naar een basisniveau voor de injectie (Eames et al., 2010.). We hebben ook geconstateerd dat voor glucose studies zijn er verschillende procedures die nodig zijn om ervoor te zorgen dat de vissen goed zijn vasten. Begin met een schone tank (geen puin op de bodem). Tanks moeten worden offline, duidelijk gemarkeerd als &#39;vasten&#39;, en op een plaats waar enthousiaste vis verzorgend personeel zal niet voeden. Evalueer de externe omgeving van de tank en stappen ondernemen om de vis te voorkomen dat benadrukt van verstoringen, zoals stress is bekend dat de bloedglucose (Chavin en Young, 1970.; Groff et al., 1999) te verhogen. Bijvoorbeeld, hadden we een vasten experiment waarin een radio dagelijks werd gebruikt op de bank, dat hield de vis tanks. We vonden dat het bloed glucose was ongewoon hoog en concludeerde dat de vissen werden benadrukt door de trillingen. Een andere stressfactor is overbevolking. Vis moet worden bewaard bij een dichtheid die in overeenstemming is met goede vis veehouderijpraktijken. Voor aanbevelingen, zie Brand et al.. (2002) en Westerfield (1995). We hebben goede resultaten vasten onze vis bij een dichtheid van 10-12 vis in een 9 liter tank (met 3 lagen knikkers toegang tot een deel van dat volume). Het scheiden van de seksen kan stress veroorzaken, dus we raden het onderhouden van een mixed-sex bevolking tijdens het vasten. Dit betekent dat de eieren kunnen worden gelegd, en de eieren moeten worden afgezonderd, zodat ze niet worden opgegeten. Een eenvoudige manier om eieren afzonderen is om de tank onderkant met 2-3 lagen knikkers. De waterkwaliteit moet worden gehandhaafd door het verwijderen van eieren en afval en door de vervanging van ongeveer 10-15% van de tank water, per dag. Voor het verwijderen van eieren en afval, overhevelen werkt goed. Wegen: Bij de weging van vis die niet verdoofd zijn, zorg moeten worden genomen zodat er minimaal water uit het net in het bekerglas, om nauwkeurig wegen te garanderen. Als het net (met vis) is uitgewist op papier handdoeken, kan het grootste deel van het overtollige water worden verwijderd, en het gewicht nauwkeurig kan worden gemeten. Het kan makkelijker zijn voor de vissen verdoven voor het wegen, maar we hebben niet getest de mogelijke effecten van de verlamming een vis twee keer op een dag. We hebben onze techniek getest door weging van de vis eerst met de netten / blotting methode en vervolgens opnieuw de vis weegt, nadat het is verdoofd, en voorzichtig drooggedept. We vonden geen significant verschil in gewicht tussen de methodes (P = 0.7927, t-test). Daarnaast hebben we getest of dit gaas / blotting methode beïnvloed bloedglucose, in vergelijking met alleen de overdracht van de vis aan de beker zodra het is gesaldeerd (geen blotting). We vonden geen significant verschil in het bloed glucose-niveau tussen de twee overdrachtsmethodes (P = 0.2241, t-test). Verlamming: Chemische anesthesie kunnen geschikt zijn voor veel studies. Hier hebben we aangetoond koud water verdoving als een alternatief, omdat veel anesthetica (inclusief tricaine/MS-222 (Brown, 1993)), verhogen bloedglucose. In eerdere studies hebben we vastgesteld dat koud water niet bloedglucose te verhogen in zebravis (Eames et al.., 2010). Voor koud water anesthesie, dient de temperatuur langzaam worden verminderd. Het tempo van de daling lijkt af te hangen van de grootte van de vis, met kleinere vissen onder te gaan sneller dan de grotere vissen. Na de injectie, kan het zijn dat de vis is te langzaam herstelt van de narcose (zie hieronder). Dit kan ontstaan ​​wanneer het begin-temperatuur te laag is, of wanneer de temperatuur te snel af. De start temperatuur is te laag als de vis buigt zijdelings bij het binnenkomen van het water. Als de begintemperatuur juist is, zal de vis in eerste instantie houden aan haar balans. Het zal draaien zijn borstvinnen naar een horizontale positie, snik, en hebben een snelle operculum bewegingen. Doorgaans zal het zwemmen. Naarmate de temperatuur daalt, zullen de bewegingen verminderen en de vis zal verliezen evenwicht. Een chirurgisch vlak van anesthesie is bereikt wanneer de vis kan worden behandeld zonder te reageren. Handhaving van de vis onder chirurgische anesthesie, moet uw vingers koud zijn, zodat deze vóór te houden in het water om het hanteren van de vis. De spons moet ook worden bewaard koud op dezelfde temperatuur als het water gebruikt voor verlamming van de vis. Het is belangrijk om te verzadigen de spons met water dat is sufficiently koud om narcose te onderhouden als de vis op de plaat legt. Injectie: Voorafgaand aan de onderneming injecties, wilt u misschien om ten minste een vis ontleden om een gevoel van het lichaam van de wanddikte te krijgen. Dit kan u helpen om te beoordelen hoe ver de naald moet plaatsen om de buikholte te voeren. Bovendien, als je de naald, voel je het lichaam muur &quot;geven&quot; wanneer de naald komt in de buikholte. Tijdens de injectie, stappen ondernemen om de patiënt tevreden. Zorg ervoor dat de spons is verzadigd met de juiste temperatuur koud water om de vissen te voorkomen dat doen herleven tijdens de injectie. Een goed verzadigd en zachte spons is belangrijk voor het minimaliseren van schade aan de schubben en slijm bedekken van de huid. Een goed verzadigde spons is ook belangrijk voor het bijhouden van de kieuwen belucht. We raden het schuim spons hierna vermeld onder Materials. Tot slot, wanneer de vis is verdoofd, snel werken om de tijd dat de vis is onder te minimaliseren. Herstel: De vissen moeten uit de narcose te herstellen vrijwel bij het ​​betreden van het warme bak water. Als de vis niet begint te zwemmen onmiddellijk voorzichtig krul het water naar de kieuwen het herstel bespoedigen. Als het herstel is traag, dan is de vis onder ging te snel en je moet de anesthesie procedure juiste wijze aan te passen. De mogelijke oorzaken van langzaam herstel worden besproken onder verlamming.

<table><tbody><tr><td>Foamspons</td><td>Jaece Industries</td><td>L800-D</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petrischaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deksel van pipetpuntendoos</td><td></td><td></td><td>niet te diep, bijv. 1,5 cm</td></tr><tr><td>Plastic bewaarbak</td><td></td><td></td><td>diep, bijv. 7 cm </td></tr><tr><td>Thermometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crushed ice</td><td></td><td></td><td>gemaakt van water uit de faciliteit</td></tr><tr><td>Warm water uit de faciliteit</td><td></td><td></td><td>1 liter of meer</td></tr><tr><td>500 ml bekerglas</td><td></td><td></td><td>voor het afwegen</td></tr><tr><td>NanoFil spuit</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NANOFIL</td><td>of Hamilton spuit</td></tr><tr><td>35 gauge naald</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NF35BV-2</td><td>geschaafd</td></tr><tr><td>Silflex slang</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SILFLEX-2</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump III en Micro4 controller</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMPS-1</td><td></td></tr><tr><td>Voetschakelaar</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>15867</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vershoudfolie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papieren handdoeken</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cortland zoutoplossing</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

intraperitoneale injectie in de adult zebravis

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Een handige methode voor het chemisch behandelen van zebravis is om het reagens te introduceren in de tank water, waar het zal worden genomen door de vis. Echter, deze methode maakt het moeilijk om te weten hoeveel reagens wordt geabsorbeerd of opgenomen per vis. Sommige experimentele vragen, met name die met betrekking tot metabolische studies, kunnen beter worden aangepakt door het leveren van een bepaalde hoeveelheid aan elke vis, op basis van gewicht. Hier presenteren we een methode voor intraperitoneale (IP) injectie in volwassen zebravissen. Injectie is in de buikholte, posterior aan de bekkengordel. Deze procedure is een bewerking van diergeneeskundige methoden die worden gebruikt voor de grotere vissen. Het is veilig, zoals we hebben gezien nul sterfte. Daarnaast hebben we gezien bloeden op de injectieplaats in slechts 5 van de 127 injecties, en in elk van die gevallen het bloeden was kort, van enkele seconden, en de hoeveelheid verloren bloed was klein. Succes met deze procedure vereist voorzichtige behandeling van de vissen door middel van verschillende stappen waaronder vasten, wegen, verlamming, injectie, en herstel. Voorzorgsmaatregelen nodig zijn om stress te minimaliseren tijdens de gehele procedure. Onze voorzorgsmaatregelen zijn onder meer met behulp van een kleine injectie volume en een 35G naald. We maken gebruik van Cortland zout-oplossing als het voertuig, die osmotisch evenwichtig is voor zoetwatervissen. Beluchting van de kieuwen wordt gehandhaafd tijdens de injectie procedure door eerst brengen van de vis in een chirurgische vlak van anesthesie, die langzame bewegingen operculum toelaat, en ten tweede, door te oordelen de vis in een trog in een met water verzadigde spons tijdens de injectie zelf. Tonen we het nut van IP-injectie door het injecteren van glucose en het toezicht op de stijging van de bloedsuikerspiegel en de daaropvolgende weer normaal. Als stress is bekend dat het bloedglucosegehalte in teleost vis te verhogen, vergelijken we de bloedsuikerspiegel in de auto-injectie en de niet-gespoten volwassenen en laten zien dat de procedure niet een aanzienlijke stijging van de bloedsuikerspiegel veroorzaken.

Tonen we intraperitoneale injectie in volwassen zebravissen. We maken gebruik van een 10 ul NanoFil injectiespuit bestuurd door een Micro4 controller en UltraMicroPump III. Deze demonstratie omvat het gebruik van koud water als een verdoving.

Intraperitoneale injectie in de Adult zebravis

Een handige methode voor de chemische behandeling van zebravissen is het toevoegen van het reagens aan het tankwater, waarna het door de vissen wordt opgenomen. Echter, ...

Het algemene doel van deze procedure is om een oplossing in de peritoneale holte van de volwassen zebravis te injecteren. In dit voorbeeld injecteren we glucose in ons laboratorium. We gebruiken deze procedure om de glucosestase in het bloed te bestuderen.Dit wordt bereikt door eerst de vis te wegen om te bepalen hoeveel oplossing per gram lichaamsgewicht moet worden geïnjecteerd. De tweede stap van de procedure is het anesthetiseren van de vis met koud water. De derde stap van de procedure is het overbrengen van de vis naar de microscooptafel en het uitvoeren van de injectie.De laatste stap van de procedure is om de vis terug in het aquarium te plaatsen voor herstel. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die veranderingen in de glucosehomeostase aantonen door middel van de meting van de bloedglucosewaarden. Hallo, ik ben Mary Kinkle van het laboratorium van Victoria Prince in de afdeling Organismal Biology and Anatomy aan de University of Chicago.Ik ben Stephanie Ames, ook van het Prince Lab. Vandaag laten we u een procedure zien voor intraperitonele injectie bij volwassen Zebrafish. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de regulatie van de bloedglucosehomeostase te bestuderen.Laten we beginnen. Om de vissen voor injectie voor te bereiden, begint u met het overbrengen van de vissen naar een schoon aquarium en houdt u ze vasten. Laat de vissen 24 uur vasten om de inhoud van de darmbol te legen en 72 uur om de bloedglucosewaarden terug te brengen naar het basisniveau.De dichtheid die in dit protocol wordt gebruikt, is 10 tot 12 individuen van een gemengde populatie vissen per tank van negen liter met drie lagen knikkers; de knikkers isoleren de eitjes zodat ze niet worden opgegeten. Verwijder dagelijks de eitjes en het afval door de tank af te hevelen.Bereid vervolgens de Cortland-zoutoplossing met 124,1 millimolaire natriumchloride, 5,1 millimolaire kaliumchloride, 2,9 millimolaire natriumpyrofosfaat, 1,9 millimolaire magnesiumsulfaatheptahydraat, 1,4 millimolaire calciumchloride-dihydraat, 11,9 millimolaire natriumbicarbonaat, vier gram polyvinylpyrrolidon en 1000 USP-eenheden heparine tot een eindvolume van 100 milliliters met gedeïoniseerd water; filter, steriliseer en bewaar bij vier graden Celsius. Los vervolgens vijf gram glucose op in 10 milliliters Cortland-zoutoplossing om een 0,5 milligram per microliter glucoseloplossing te maken; filter, steriliseer en bewaar bij vier graden Celsius.Bereid vervolgens de operatietafel voor door een zachte spons op het platte vlak tot een hoogte van ongeveer 20 millimeter te snijden. Maak een inkeping van 10 tot 15 millimeter diep om de vis voor de injectie te fixeren. Plaats de spons in een Petrischaal van 60 millimeter en zet de Petrischaal met de spons in het deksel van een P 200 pipetpuntendoos.Bereid vervolgens de microscoop voor door de voet van de microscoop te bedekken met plasticfolie en papieren handdoeken ter bescherming. Zet bij risico op morsen de operatietafel bovenop de papieren handdoek. Stel de focus vooraf in door naar de operatietafel te kijken en scherp te stellen op de spons.Plaats uw vinger bovenop de spons en stel deze scherp om verdere scherpstellingsaanpassingen te minimaliseren wanneer de vis op de operatietafel ligt. Weeg vervolgens de vis door een bekerglas van 500 milliliter voor ongeveer een derde te vullen met water uit de visfaciliteit. Breng de vis met een net en zo min mogelijk overtollig water over naar de beker op een weegschaal en noteer het gewicht; breng elke gewogen vis over naar een duidelijk gelabeld aquarium.Bereken het injectievolume op basis van het gewicht. In dit voorbeeld injecteren we een oplossing van 0,5 milligram per gram lichaamsgewicht glucose opgelost in Cortland-zoutoplossing. Aangezien onze oplossing 0,5 milligram per microliter is, is de berekening: één maal het gewicht van de vis in grammen is gelijk aan het te injecteren volume in microliters; bereid de spuit en de bijbehorende injectieapparatuur voor.Dit protocol maakt gebruik van een 30 5G schuine stalen naald, een ultra micro pomp en micro four processor en een 10 microliter nano fill microspuit voor glucose-injectie; vul de spuit met 0,5 milligram per microliter glucose opgelost in Cortland zoutoplossing. Het is belangrijk om alle luchtbellen uit de spuit te verwijderen. Monteer de spuit op de ultra micro pomp en programmeer het injectievolume voor de eerste vis door het volume in nanoliters in te voeren met het numerieke toetsenbord op de micro four processor. Bereid ten slotte het ijsanestheticum voor door voldoende ijsblokjes te crushen die zijn gemaakt van water uit de visfaciliteit.Om een ijsbak te vullen, plaatst u de operatietafel in een grotere bak, zoals een rubberen bewaarcontainer van 2,4 liter. Giet wat warm kraanwater in de buitencontainer en de operatietafel. Houd een reservereservoir met warm kraanwater in de buurt.Bevestig een thermometer aan de buitencontainer. Plaats de buitencontainer met anestheticum en de operatietafel naast de microscoop. Houd de emmer met ijssnippers in de buurt.Begin met het toevoegen van ijsstukjes totdat de watertemperatuur 17 °C is. Ga bij deze stap niet onder de 17 °C. Gebruik een net om de vissen naar de buitenste container over te brengen.Bij 17 graden of iets daaronder zal de vis doorgaans de borstvinnen horizontaal spreiden, happen en snelle bewegingen van de kieuwdeksels vertonen. Voeg langzaam ijschips toe aan de container om de temperatuur gedurende enkele minuten te verlagen naar 12 °C. Naarmate de temperatuur daalt, zal de vis langzamer zwemmen en uiteindelijk stoppen met zwemmen.Uiteindelijk zal het happen naar lucht stoppen en zullen de bewegingen van de vinnen vertragen. De vis is klaar voor injectie wanneer deze niet meer reageert op hantering. Zodra de vereiste temperatuur is bereikt, knijp dan in de spons om deze te verzadigen.Houd uw vingers lang genoeg in het koude water zodat ze de vis niet opwarmen en deze uit de anesthesie brengen. Plaats de vis terwijl u koude vingers heeft voorzichtig in de goot van de spons. Positioneer de vis met de buik naar boven en de kieuwen in de goot.Verplaats de operatietafel snel naar de microscooptafel. Positioneer de naald snel en zorgvuldig, zodat de punt naar craniaal wijst en zich dichter bij de bekkengordel bevindt dan bij de anus. Steek de naald in de middellijn tussen de bekkenvinnen.U moet kunnen voelen wanneer de naald door de lichaamswand is gedrongen. Terwijl u de naald inbrengt, kunt u voelen dat de lichaamswand meegeeft. Zodra de naald de buikholte binnendringt, injecteert u het juiste volume met behulp van de microprocessor.Gebruik het voetpedaal om één microliter per gram lichaamsgewicht van de vis te injecteren; verwijder na de injectie de naald en plaats de vis onmiddellijk terug in het warmwaterreservoir voor het herstel. Terwijl de vis vanuit de spons in het tankwater wordt vrijgelaten, dient de naald onder de microscoop te worden gecontroleerd. Soms blijft er een schub aan kleven, die verwijderd moet worden vóór de volgende injectie.Ga na een passende periode verder met uw downstream-assay. We hebben vastgesteld dat een vastenperiode van 72 uur nodig is om de bloedglucose naar een basisniveau te verlagen voorafgaand aan de injectie. In deze figuur vertonen de niet-geïnjecteerde controledata in het groen bloedglucosewaarden die niet significant verschillen van de voertuig-geïnjecteerde controles, hier in het rood weergegeven.De blauwe lijn toont echter de bloedglucosewaarden voor vissen waarin glucose is geïnjecteerd en illustreert de stijging en daling van de circulerende glucose. Gedurende de tijd waren zowel de dieren waarin glucose was geïnjecteerd als de dieren waarin het vehikel was geïnjecteerd onder chirurgische anesthesie tijdens de injectieprocedure, terwijl de niet-geïnjecteerde controles niet onder chirurgische anesthesie waren. We hebben u zojuist laten zien hoe u een intraperitoneale injectie bij volwassen zebravisen uitvoert.In ons laboratorium bestuderen we veranderingen in de bloedglucoseconcentratie op verschillende tijdstippen na intraperitoneale (IP) injectie van een glucoseoplossing. Echter kan de techniek die we zojuist hebben gedemonstreerd, worden gebruikt om elke gewenste oplossing te injecteren. Denk erbij het uitvoeren van deze procedure aan om de vis langzaam te anesthetiseren en voorzichtig te behandelen.Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

intraperitoneal-injection-into-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier laten we zien hoe retro-orbitale injectie te doen in volwassen zebravissen.

Retro-orbitale injectie in Adult zebravis

Deze video beschrijft de techniek van intramusculaire injectie voor het leveren van verbindingen in de rugspieren van een volwassen zebravis.

Intramusculaire (IM) injectie: samengestelde toediening in de dorsale spier van een volwassen zebravis

Deze video beschrijft een techniek van intraperitoneale injectie, een methode voor het leveren van oplossingen in de buikholte van Adult Zebrafish.

Intraperitoneale injectie: een methode voor oplossingsafgifte in de buikholte van een volwassen zebravis

Deze video beschrijft de techniek van het leveren van verbindingen in het hart van volwassen zebravissen met behulp van intrathoracale injectie.

Intrathoracale injectie: samengestelde levering aan het volwassen zebravishart

Hier beschrijven we een protocol voor de immunisatie van de volwassen zebravissen (Danio rerio) met een op basis van DNA vaccin en de validatie van een succesvolle vaccinatie evenement aan te tonen. Deze methode is geschikt voor de preklinische screening van vaccin kandidaten in verschillende modellen van de infectie.

Immunisatie van volwassen Zebrafish voor de preklinische Screening van DNA-gebaseerde vaccins

Deze methode baseert zich op de injectie van 0.5 − 3 l van oplossing in de thorax van volwassen zebravis. De procedure levert efficiënt proteïnen en chemische samenstellingen in de nabijheid van het zebravis hart zonder het orgaan te beschadigen. De aanpak is geschikt voor het testen van effecten van exogene factoren op verschillende weefsels van het hart.

Intrathoracale injectie voor de studie van volwassen zebravis hart

Een nieuwe intraperitoneale (IP) injectiemethode bij volwassen zebravissen wordt beschreven. Bij het hanteren van giftige stoffen zoals doxorubicine is deze procedure effectiever dan de twee eerder gerapporteerde IP-methoden. De techniek is zo ontworpen dat het gemakkelijk kan worden toegepast door onderzoekers met beperkte ervaring in het zebravismodel.

Een intraperitoneale injectietechniek bij volwassen zebravissen die lichaamsschade en bijbehorende sterfte minimaliseert

Hier presenteren we een geoptimaliseerd en effectief protocol voor de intraveneuze injectie van cellen of farmacologische middelen in volwassen zebravissen, wat resulteert in verbeterde celtransplantatie en verhoogde overlevingskansen van de behandelde zebravissen.

Geoptimaliseerde intraveneuze injectie bij volwassen zebravissen

Transplantatie van Whole nier Marrow in Adult zebravis

Na de vorming van neurale buis, de neuroepithelium vernauwt en plooien, terwijl de buis gevuld met embryonale cerebrospinale vloeistof (eCSF) om de embryonale hersenen ventrikels vormen. We hebben deze ventrikel injectie techniek om beter te visualiseren van de vloeistof gevulde ruimte in tegenstelling tot de neuro-vorm in een live-embryo.

Zebravis hersenventrikel Injection

Leer intraperitoneale injectie bij volwassen zebravis met koudwateranesthesie en een NanoFil-microspuit. Deze methode maakt nauwkeurig onderzoek naar glucosehomeostase en metabole processen in Danio rerio mogelijk.

Intraperitoneale injectie in de Adult zebravis

Meer video's verkennen