Intraperitoneale injectie in de Adult zebravis
30 augustus 2010
Tonen we intraperitoneale injectie in volwassen zebravissen. We maken gebruik van een 10 ul NanoFil injectiespuit bestuurd door een Micro4 controller en UltraMicroPump III. Deze demonstratie omvat het gebruik van koud water als een verdoving.
Het algemene doel van deze procedure is om een oplossing in de peritoneale holte van de volwassen zebravis te injecteren. In dit voorbeeld injecteren we glucose in ons laboratorium. We gebruiken deze procedure om de glucosestase in het bloed te bestuderen.
Dit wordt bereikt door eerst de vis te wegen om te bepalen hoeveel oplossing per gram lichaamsgewicht moet worden geïnjecteerd. De tweede stap van de procedure is het anesthetiseren van de vis met koud water. De derde stap van de procedure is het overbrengen van de vis naar de microscooptafel en het uitvoeren van de injectie.
De laatste stap van de procedure is om de vis terug in het aquarium te plaatsen voor herstel. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die veranderingen in de glucosehomeostase aantonen door middel van de meting van de bloedglucosewaarden. Hallo, ik ben Mary Kinkle van het laboratorium van Victoria Prince in de afdeling Organismal Biology and Anatomy aan de University of Chicago.
Ik ben Stephanie Ames, ook van het Prince Lab. Vandaag laten we u een procedure zien voor intraperitonele injectie bij volwassen Zebrafish. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de regulatie van de bloedglucosehomeostase te bestuderen.
Laten we beginnen. Om de vissen voor injectie voor te bereiden, begint u met het overbrengen van de vissen naar een schoon aquarium en houdt u ze vasten. Laat de vissen 24 uur vasten om de inhoud van de darmbol te legen en 72 uur om de bloedglucosewaarden terug te brengen naar het basisniveau.
De dichtheid die in dit protocol wordt gebruikt, is 10 tot 12 individuen van een gemengde populatie vissen per tank van negen liter met drie lagen knikkers; de knikkers isoleren de eitjes zodat ze niet worden opgegeten. Verwijder dagelijks de eitjes en het afval door de tank af te hevelen.
Bereid vervolgens de Cortland-zoutoplossing met 124,1 millimolaire natriumchloride, 5,1 millimolaire kaliumchloride, 2,9 millimolaire natriumpyrofosfaat, 1,9 millimolaire magnesiumsulfaatheptahydraat, 1,4 millimolaire calciumchloride-dihydraat, 11,9 millimolaire natriumbicarbonaat, vier gram polyvinylpyrrolidon en 1000 USP-eenheden heparine tot een eindvolume van 100 milliliters met gedeïoniseerd water; filter, steriliseer en bewaar bij vier graden Celsius. Los vervolgens vijf gram glucose op in 10 milliliters Cortland-zoutoplossing om een 0,5 milligram per microliter glucoseloplossing te maken; filter, steriliseer en bewaar bij vier graden Celsius.
Bereid vervolgens de operatietafel voor door een zachte spons op het platte vlak tot een hoogte van ongeveer 20 millimeter te snijden. Maak een inkeping van 10 tot 15 millimeter diep om de vis voor de injectie te fixeren. Plaats de spons in een Petrischaal van 60 millimeter en zet de Petrischaal met de spons in het deksel van een P 200 pipetpuntendoos.
Bereid vervolgens de microscoop voor door de voet van de microscoop te bedekken met plasticfolie en papieren handdoeken ter bescherming. Zet bij risico op morsen de operatietafel bovenop de papieren handdoek. Stel de focus vooraf in door naar de operatietafel te kijken en scherp te stellen op de spons.
Plaats uw vinger bovenop de spons en stel deze scherp om verdere scherpstellingsaanpassingen te minimaliseren wanneer de vis op de operatietafel ligt. Weeg vervolgens de vis door een bekerglas van 500 milliliter voor ongeveer een derde te vullen met water uit de visfaciliteit. Breng de vis met een net en zo min mogelijk overtollig water over naar de beker op een weegschaal en noteer het gewicht; breng elke gewogen vis over naar een duidelijk gelabeld aquarium.
Bereken het injectievolume op basis van het gewicht. In dit voorbeeld injecteren we een oplossing van 0,5 milligram per gram lichaamsgewicht glucose opgelost in Cortland-zoutoplossing. Aangezien onze oplossing 0,5 milligram per microliter is, is de berekening: één maal het gewicht van de vis in grammen is gelijk aan het te injecteren volume in microliters; bereid de spuit en de bijbehorende injectieapparatuur voor.
Dit protocol maakt gebruik van een 30 5G schuine stalen naald, een ultra micro pomp en micro four processor en een 10 microliter nano fill microspuit voor glucose-injectie; vul de spuit met 0,5 milligram per microliter glucose opgelost in Cortland zoutoplossing. Het is belangrijk om alle luchtbellen uit de spuit te verwijderen. Monteer de spuit op de ultra micro pomp en programmeer het injectievolume voor de eerste vis door het volume in nanoliters in te voeren met het numerieke toetsenbord op de micro four processor. Bereid ten slotte het ijsanestheticum voor door voldoende ijsblokjes te crushen die zijn gemaakt van water uit de visfaciliteit.
Om een ijsbak te vullen, plaatst u de operatietafel in een grotere bak, zoals een rubberen bewaarcontainer van 2,4 liter. Giet wat warm kraanwater in de buitencontainer en de operatietafel. Houd een reservereservoir met warm kraanwater in de buurt.
Bevestig een thermometer aan de buitencontainer. Plaats de buitencontainer met anestheticum en de operatietafel naast de microscoop. Houd de emmer met ijssnippers in de buurt.
Begin met het toevoegen van ijsstukjes totdat de watertemperatuur 17 °C is. Ga bij deze stap niet onder de 17 °C. Gebruik een net om de vissen naar de buitenste container over te brengen.
Bij 17 graden of iets daaronder zal de vis doorgaans de borstvinnen horizontaal spreiden, happen en snelle bewegingen van de kieuwdeksels vertonen. Voeg langzaam ijschips toe aan de container om de temperatuur gedurende enkele minuten te verlagen naar 12 °C. Naarmate de temperatuur daalt, zal de vis langzamer zwemmen en uiteindelijk stoppen met zwemmen.
Uiteindelijk zal het happen naar lucht stoppen en zullen de bewegingen van de vinnen vertragen. De vis is klaar voor injectie wanneer deze niet meer reageert op hantering. Zodra de vereiste temperatuur is bereikt, knijp dan in de spons om deze te verzadigen.
Houd uw vingers lang genoeg in het koude water zodat ze de vis niet opwarmen en deze uit de anesthesie brengen. Plaats de vis terwijl u koude vingers heeft voorzichtig in de goot van de spons. Positioneer de vis met de buik naar boven en de kieuwen in de goot.
Verplaats de operatietafel snel naar de microscooptafel. Positioneer de naald snel en zorgvuldig, zodat de punt naar craniaal wijst en zich dichter bij de bekkengordel bevindt dan bij de anus. Steek de naald in de middellijn tussen de bekkenvinnen.
U moet kunnen voelen wanneer de naald door de lichaamswand is gedrongen. Terwijl u de naald inbrengt, kunt u voelen dat de lichaamswand meegeeft. Zodra de naald de buikholte binnendringt, injecteert u het juiste volume met behulp van de microprocessor.
Gebruik het voetpedaal om één microliter per gram lichaamsgewicht van de vis te injecteren; verwijder na de injectie de naald en plaats de vis onmiddellijk terug in het warmwaterreservoir voor het herstel. Terwijl de vis vanuit de spons in het tankwater wordt vrijgelaten, dient de naald onder de microscoop te worden gecontroleerd. Soms blijft er een schub aan kleven, die verwijderd moet worden vóór de volgende injectie.
Ga na een passende periode verder met uw downstream-assay. We hebben vastgesteld dat een vastenperiode van 72 uur nodig is om de bloedglucose naar een basisniveau te verlagen voorafgaand aan de injectie. In deze figuur vertonen de niet-geïnjecteerde controledata in het groen bloedglucosewaarden die niet significant verschillen van de voertuig-geïnjecteerde controles, hier in het rood weergegeven.
De blauwe lijn toont echter de bloedglucosewaarden voor vissen waarin glucose is geïnjecteerd en illustreert de stijging en daling van de circulerende glucose. Gedurende de tijd waren zowel de dieren waarin glucose was geïnjecteerd als de dieren waarin het vehikel was geïnjecteerd onder chirurgische anesthesie tijdens de injectieprocedure, terwijl de niet-geïnjecteerde controles niet onder chirurgische anesthesie waren. We hebben u zojuist laten zien hoe u een intraperitoneale injectie bij volwassen zebravisen uitvoert.
In ons laboratorium bestuderen we veranderingen in de bloedglucoseconcentratie op verschillende tijdstippen na intraperitoneale (IP) injectie van een glucoseoplossing. Echter kan de techniek die we zojuist hebben gedemonstreerd, worden gebruikt om elke gewenste oplossing te injecteren. Denk erbij het uitvoeren van deze procedure aan om de vis langzaam te anesthetiseren en voorzichtig te behandelen.
Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Overzicht
Dit artikel demonstreert de procedure voor intraperitonele injectie bij volwassen zebravisjes, waarbij gebruik wordt gemaakt van een NanoFil-microspuit en anesthesie met koud water. De methode is gericht op het bestuderen van de bloedglucosehomeostase door middel van nauwkeurige injecties.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Fysiologie
Achtergrond
- Intraperitoneale injecties zijn essentieel voor het direct toedienen van stoffen in de peritoneale holte.
- Zebravisjes zijn een waardevolle modelorganisme voor het bestuderen van metabole processen.
- Inzicht in de regulatie van de bloedglucosespiegel is cruciaal voor het begrijpen van metabole stoornissen.
- Het gebruik van anesthesie is noodzakelijk om stress tijdens de procedure te minimaliseren.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode voor intraperitonele injectie bij zebravisjes te demonstreren.
- Om onderzoek naar glucosehomeostase en de regulatie daarvan te faciliteren.
- Om een protocol te bieden dat in andere laboratoria kan worden gereproduceerd.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van de vissen door vasten en wegen om het injectievolume te bepalen.
- Anesthesie van de vissen met koud water om minimale beweging tijdens de injectie te garanderen.
- Injectie van een glucoseoplossing in de peritoneale holte met behulp van een nauwkeurige microspuit.
- Monitoring van het herstel van de vissen na de injectie om de impact van de procedure te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- De procedure maakt op succesvolle wijze de injectie van stoffen in volwassen zebravis mogelijk.
- Na de injectie kunnen de bloedglucosewaarden worden gemeten om metabole veranderingen te bestuderen.
- De vissen herstellen goed na de procedure, wat wijst op de effectiviteit van de gebruikte anesthesie.
- De resultaten dragen bij aan een beter begrip van de glucosehomeostase bij zebravis.
Conclusies
- Deze methode biedt een waardevol instrument voor onderzoekers die metabole processen bij zebravisjes bestuderen.
- Intraperitoneale injectie is een haalbare en effectieve techniek voor het toedienen van oplossingen.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op dit protocol om diverse metabole condities te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Precieze toediening van verbindingen in zebravissen maakt mechanische risicoanalyse van metabole targets mogelijk door dosis-responsrelaties vast te stellen in een gewerveld systeem. Deze benadering ondersteunt targetvalidatie via gecontroleerde perturbatie van de glucosehomeostase, waardoor ambiguïteit bij het onderzoeken van signaalpaden wordt verminderd. De methode vergroot het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door kwantitatieve, reproduceerbare fenotypische read-outs te bieden die relevant zijn voor het modelleren van metabole ziekten.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door het toedienen van gedefinieerde doses om de interactie met het doelwit in glucose-reguleringspaden te beoordelen.
- Operationele waarde: Zorgt voor reproduceerbare toediening van verbindingen om variabiliteit bij de beoordeling van het metabole fenotype te minimaliseren.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door directe meting van veranderingen in de bloedglucose als functionele readout van metabole doelwitmodulatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve metingen van de afhankelijke variabele (bloedglucosewaarden), wat dosis-responsanalyse mogelijk maakt voor de identificatie van lead-verbindingen.
- Operationele waarde: Standaardiseert het injectievolume op basis van het gewicht van de vis, waardoor de reproduceerbaarheid van de assay over verschillende experimentele batches wordt verbeterd.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de preparatie van gevalideerde biologische systemen voor downstream metabole screening-workflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Sluit aan bij ziekterelevante systemen door de verstoring van de glucosehomeostase te modelleren die relevant is voor de diabetische pathofysiologie.
- Operationele waarde: Garandeert procedurele consistentie door gestandaardiseerde protocollen voor vasten, anesthesie en injectie, wat de reproduceerbaarheid tussen laboratoria ondersteunt.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt mechanische risicoreductie mogelijk door het effect van geïnjecteerde verbindingen te isoleren van stress-geïnduceerde glucoseverhoging via voertuigcontroles.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie tot lead-optimalisatie, door een betrouwbare route te bieden voor de toediening van verbindingen in metabole assays bij zebravis.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking bij glucoseregulatie door nauwkeurige toediening van verbindingen aan volwassen zebravis mogelijk te maken.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde, op gewicht gebaseerde injectievolumes die een consistente blootstelling aan de verbinding garanderen.
- Analytics: Genereert kwantitatieve bloedglucosemetingen die vergelijking van metabole responsen tussen behandelingsgroepen mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door het gebruik van een gewervde modelorganisme met geconserveerde glucose-homeostatische mechanismen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare capaciteit voor metabole fenotype-screening over meerdere verbindingenseries en targetklassen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in doelwitvalidatie door mechanistische ambiguïteit in metabole padanalyse te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie door gedefinieerde injectievolumes en gecontroleerde anesthesieprocedures.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door duidelijke dosis-responshistorie te verschaffen over de modulatie van de glucosehomeostase.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van gevalideerde metabole effecten in een systeem van het gehele organisme.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van zebravissen, anesthesie en microspuiten-injectietechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot ultra-micropompen, NanoFil-spuiten en temperatuurgecontroleerde anesthesiesets.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de vastenduur, gewichtsmeting en berekening van het injectievolume.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen aan verschillende oplosbaarheden van verbindingen en injectievolumes in Cortland-zoutoplossing als vehikel.
- Beperkt door de technische vaardigheid die nodig is om de kieugaeratie te behouden en trauma op de injectieplaats tijdens de uitvoering van de procedure te vermijden.
