Name: Detectie van Neu1 Sialidase activiteit in het reguleren van Toll-like receptor activering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Leer de sialidase-assay voor het bestuderen van Toll-like receptor-activering op levende macrofagen. Deze methode maakt real-time visualisatie van enzymatische activiteit mogelijk voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gedeeltelijke ondersteuning van beurzen aan MRS is van Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), de Harry Botterell Stichting voor Neuroscience Research, ARC, en de Garfield Kelly Cardiovascular Research and Development Fund. SRA is een ontvanger van de Universiteit van de Queen&#39;s Research Award en de Robert J. Wilson Fellowship. PJ is een ontvanger van Graduate van de Queen&#39;s Award en de Robert J. Wilson Fellowship. AG en SA zijn ontvangers van Graduate de Queen&#39;s Award. SF was de ontvanger van de Ontario Graduate Scholarship in wetenschap en technologie (OGSST). AG is de ontvanger van Franklin van de Koningin Bracken Graduate Scholarship. SA is de ontvanger van RS van de Koningin McLaughlin Graduate Scholarship.

1. Resurrecting Frozen macrofaagcellen <ol><li> Voordat wederopstanding van bevroren cellen van de -80 ° C vriezer, moet men kweekmedium met behulp van steriel gefiltreerd Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal bovine serum (FBS) en 5 ug / ml plasmocin voor te bereiden. Plasmocin is een antibiotica-oplossing wordt gebruikt in het onderzoek te elimineren en te voorkomen mycoplasma besmetting van celculturen. </li><li> Voor een flacon van bevroren cellen, voegt men 4 ml, 1 ml van de gekweekte medium om een 25 cm 2 celkweek kolf in een steriele biohazard containment kap. </li><li> Wanneer de flacon van bevroren cellen zijn afkomstig uit de -80 ° C vriezer, zijn ze snel ontdooid met de hand opwarming in de steriele kap, die ongeveer 2-3 minuten duurt. </li><li> Zodra de cellen ontdooid zijn, zijn ze snel overgebracht naar de kolf met het geconditioneerde medium met behulp van een 1 ml steriele pipet. </li><li> De kolf met de cellen zijn geplaatst in een weefselkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO 2. </li><li> De cellen gecontroleerd op groei en hechting op een dagelijkse basis totdat ze 75% tot 90% samenvloeiing met behulp van een omgekeerde microscoop. </li><li> Tijdens de celkweek incubatie, 12 mm ronde glazen dia&#39;s worden gesteriliseerd door ze te bedekken in 70% ethanol in een grote glazen petrischaal gedurende 1 uur in de biologisch gevaarlijk insluiting kabinet, is de alcohol daarna verwijderd en opgeslagen voor reusage, en de natte glazen zijkanten worden overgelaten blootgesteld aan de steriel gefiltreerd luchtstroom in de kast onder een UV-voor 24 uur of tot ze droog zijn. </li></ol> 2. Plating Cellen voor de Sialidase Assay <ol><li> Voordat plating de cellen, is een enkele steriele ronde glasplaatje voorzichtig in een putje van een BD Falcon 24-well vlakke bodem met deksel tissue-cultuur behandeld polystyreen plaat met behulp van een gesteriliseerd vlammend volledig gebogen, 4 &quot;, gekarteld, roestvrij staal pincet . Voor een fles van de cellen bij 75% confluentie, gebruiken we meestal 12 putjes van de petrischaal. </li><li> Voor hechtende macrofaag-cellen, is de DMEM geconditioneerde medium verwijderd uit de kolf met behulp van een 5 ml steriele pipet in de steriele insluiting kabinet. Ze wast de adherente cellen met 1x steriele Tris gebufferde zoutoplossing pH 7,4 op een serum bevattend medium te verwijderen, en voeg 1 ml calcium-medium vrij (CMF) fosfaat gebufferde zoutoplossing met een pH van 7,4 genoeg is om de cellen te dekken. De cellen zijn geplaatst in de 37 ° C incubator voor ongeveer 10 minuten, of totdat de cellen beginnen te af lift in de kolf. De kolf kan voorzichtig worden gewiegd of geschud om alle resterende hechtende cellen los te maken. </li><li> Om de 1 ml gesuspendeerd cellen in de kolf, voeg 3 ml DMEM geconditioneerd medium. Neem 0,5 ml van de geschorste cellen en steriel overgedragen aan het weefsel gekweekte plaat met de 12 mm ronde glazen dia&#39;s. Ongeveer, zijn 0,5 x 10 6 cellen overgebracht naar het ronde glazen dia&#39;s. </li><li> De weefselkweek plaat met cellen worden geïncubeerd bij 37 ° C in 5% CO 2 voor 24 uur, zodat de cellen zich te houden aan de ronde glazen dia&#39;s. </li></ol> 3. Sialidase Assay 1. Het maken van de controle <ol><li> Plaats een objectglaasje (mat: een einde, 1Schuif, 25 x 75 x 1 mm) in de insluiting kast of labtafel en voeg door het mengen in de juiste volgorde de volgende verbindingen: een pL DAKO + 1 ul van 4-MUNANA en tot slot + 3 pi van Tris gebufferde zoutoplossing pH 7,4 (TBS). </li><li> Na het verwijderen van de media uit een putje met de cellen, til de ronde glazen dia met de vier &quot;pincet om de hoek van de put. Voorzichtig het glaasje te verwijderen met de pincet en plaats de dia met de cellen naar op het mengsel oplossing op het objectglaasje. </li><li> Onmiddellijk de microcope dia om een ​​epi-fluorescentie microscopie, die is ingesteld voor de UV-filter en heeft een digitale camera voor het vastleggen van de fluorescerende beelden. </li><li> Focus van de microscoop onder fasecontrast totdat u kunt zien de cellen en vervolgens overschakelen naar TL-modus. Maak foto&#39;s van de cellen onder tl-op 1 min, 2 min, en 3 minuten. Maak een foto van de cellen onder fasecontrast. </li></ol> 2. Het maken van de positieve test <ol><li> Spot de volgende verbindingen in de volgorde op een andere microscoopglaasje: 1 pi DAKO + 1 ul van 4-MUNANA + 2 pi van LPS + 1 pi van TBS. </li><li> Herhaal de stappen 3.1.2 tot en met 3.1.4 hierboven. </li></ol> 3. Het maken van de positieve test, samen met neuraminidase-remmer Tamiflu <ol><li> Spot de volgende verbindingen in de onderstaande volgorde op een ander objectglaasje: 1μL DAKO + 1μL van 4-MUNANA + 2 pi van LPS + 1 pi van Tamiflu. </li><li> Tamiflu concentraties zijn al voorbereid in 1x Tris gebufferde zoutoplossing pH 7,4; de uiteindelijke concentratie van de verbindingen in contact met de levende cellen op de ronde glaasje zal een verdunningsfactor van 5 hebben. </li><li> Herhaal de stappen 3.1.2 tot en met 3.1.4 hierboven. </li></ol> 4. Bepaling van de concentratie van Inhibitor die nodig is om 50% van de Sialidase Activity (IC 50) Inhibit <ol><li> Te kwantificeren de fluorescerende rondom de cellen, worden de beelden geanalyseerd met behulp van ImageJ 1.38x met het analyseren plugin voor het meten van RBG. Neem 50 willekeurige plek metingen van de fluorescentie rond de cellen en berekent het gemiddelde van de totale fluorescentie. </li><li> De IC 50 is gegenereerd op basis van een plot van de inhibitor concentratie omgerekend als log-eenheden (bv., log ng / ml) op de x-as ten opzichte van de gemiddelde fluorescentie op de y-as met behulp van niet-lineaire regressie. </li></ol> 5. Geheimen tot succes <ol><li> Zorg ervoor dat de cellen in cultuur zijn besmetting vrij van mycoplasma. We routinematig gebruik van Plasmocin in een kweekmedium te controleren voor deze. </li><li> De kunstmatige neuraminidase ondergrond, 4-MUNANA, gebruikt moet worden vers bereid. De voorbereide substraat kan worden gebruikt binnen een week voor de sialidase test. </li><li> Als de cel lijn heeft een lage receptor expressie op het celoppervlak, kan men een hogere dosis van het ligand te gebruiken voor stimulatie. </li><li> We hebben ook ervaren dat cellen gepasseerd voor meer dan 6 keer kunnen hun receptor fenotype verliezen. Vers, moet herrijzen cellen worden gekweekt. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Zie geanimeerde protocol van de sialidase test met representatieve resultaten in het bijgevoegde <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2142/szewczuk_JoVE_sialidase_assay.pptx">PowerPoint-bestand</a> .

<ol><li>Amith, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neu1+desialylation+of+sialyl+alpha-2%2C3-linked+beta-galactosyl+residues+of+TOLL-like+receptor+4+is+essential+for+receptor+activation+and+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Neu1 desialylation of sialyl alpha-2,3-linked beta-galactosyl residues of TOLL-like receptor 4 is essential for receptor activation and cellular signaling.</a> Cell Signal. 22, 314-324 (2010).</li>
<li>Amith, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+pathogen+molecule-induced+Toll-like+receptor+activation+and+cell+function+on+Neu1+sialidase%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">Dependence of pathogen molecule-induced Toll-like receptor activation and cell function on Neu1 sialidase.</a> Glycoconjugate Journal. 26, 1197-1212 (2009).</li>
<li>Woronowicz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+neurotrophic+factor+activation+of+Trk+tyrosine+kinase+receptors+on+cellular+sialidase%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Dependence of neurotrophic factor activation of Trk tyrosine kinase receptors on cellular sialidase.</a> Glycobiology. 17, 10-24 (2007).</li>
<li>Jayanth, P., Amith, S. R., Gee, K., Szewczuk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neu1+Sialidase+and+Matrix+Metalloproteinase-9+Cross-talk+is+Essential+for+Neurotrophin+Activation+of+Trk+Receptors+and+Cellular+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Signal%22%5BJournal%5D)">Neu1 Sialidase and Matrix Metalloproteinase-9 Cross-talk is Essential for Neurotrophin Activation of Trk Receptors and Cellular Signaling.</a> Cell. Signal. 22, 1193-1205 (2010).</li>
<li>Finlay, T. M., Jayanth, P., Amith, S. R., Glimour, A., Guzzo, C., Gee, K., Beyaert, R., Szewczuk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymoquinone+from+nutraceutical+black+cumin+oil+activates+Neu4+sialidase+in+live+macrophage%2C+dendritic%2C+and+normal+and+type+I+sialidosis+human+fibroblast+cells+via+GPCR+G%CE%B1i+proteins+and+matrix+metalloproteinase-9%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Thymoquinone from nutraceutical black cumin oil activates Neu4 sialidase in live macrophage, dendritic, and normal and type I sialidosis human fibroblast cells via GPCR Gαi proteins and matrix metalloproteinase-9.</a> Glycoconj J. 27, 329-348 (2010).</li>
<li>Seyrantepe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Phagocytosis+in+Macrophages+by+Neuraminidase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of Phagocytosis in Macrophages by Neuraminidase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 206-215 (2010).</li>
</ol>

SRA en PJ droegen ook als eerste auteurs.

Met behulp van de nieuw ontwikkelde test om sialidase te detecteren in levende macrofaagcellen 2, hebben we gebruik gemaakt van deze technologie om sialidase activiteit te detecteren in ligand-geïnduceerde sialidase activiteit in live BMC-2 macrofaag-cellen in een dosisafhankelijke wijze zowel in live-DC-2.4 dendritische cellen , HEK-TLR4/MD2, HEK293, SP1 mammae adenocarcinoom cellen, menselijke WT en 1140F01 en WG0544 type I sialidosis fibroblast cellen. Neuraminidase-remmers zoals Tamiflu (oseltamivir fosfa...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-MUNANA</td><td>Biosynth International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foetaal kalfserum</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DakoCytomation, Fluorescent Mounting Media</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Tamiflu (Oseltamivirfosfaat)</td><td>Hoffmann-La Roche AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detectie van neu1 sialidase activiteit in het reguleren van toll-like receptor activering

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

Zoogdieren Toll-like receptoren (TLR&#39;s) zijn een familie van receptoren die pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen te herkennen. Niet alleen zijn TLRs cruciaal sensoren van micro-organismen (bijvoorbeeld virussen, bacteriën en parasieten) infecties, ze spelen ook een belangrijke rol in de pathofysiologie van infectieziekten, inflammatoire ziekten, en eventueel in auto-immuunziekten. Zo moeten de intensiteit en de duur van TLR responsen tegen infectieziekten goed worden gecontroleerd. Hieruit volgt dat het begrip van de structurele integriteit van sensor receptoren, hun ligand-interacties en signalering componenten essentieel is voor de volgende immunologische bescherming. Het zou ook belangrijke kansen voor de ziekte van wijziging door middel van sensor manipulatie. Hoewel de signaalwegen van TLR sensoren zijn goed gekarakteriseerd, de parameters die de interacties tussen de sensoren en hun liganden nog steeds slecht gedefinieerd. We hebben onlangs een nieuw mechanisme van TLR activering door zijn natuurlijke ligand, die nog niet eerder waargenomen 1,2. Het suggereert dat ligand-geïnduceerde TLR activatie strak wordt gecontroleerd door Neu1 sialidase activering. We hebben ook gemeld dat Neu1 strak neurotrofine receptoren zoals TrkA en TrkB 3, die Neu1 en matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) cross-talk in complex met de receptoren 4 te betrekken regelt. De sialidase test is in eerste instantie gebruiken om een nieuw ligand, thymoquinone vinden, in de activering van Neu4 sialidase op het celoppervlak van macrofagen, dendritische cellen en fibroblast cellen via GPCR Gαi eiwitten en MMP-9 5. Voor TLR receptoren, onze gegevens blijkt dat Neu1 sialidase al in complex met TLR-2, -3 en -4 receptoren, en wordt geïnduceerd na ligand binding aan een receptor. Geactiveerde Neu1 sialidase hydrolyseert sialyl α-2 ,3-gekoppelde β-galactosyl residuen afstand van ligand binding aan sterische hinder te verwijderen TLR-4 dimerisatie, MyD88/TLR4 complex werving en selectie, NFkB activering en pro-inflammatoire cel responsen. In een gezamenlijk rapport, is Neu1 sialidase is aangetoond dat fagocytose regelen macrofaagcellen 6. Tezamen genomen, heeft de sialidase test heeft ons met krachtige inzichten om de moleculaire mechanismen van ligand-geïnduceerde receptor activering. Hoewel de precieze relatie tussen Neu1 sialidase en de activering van TLR, Trk receptoren is nog niet volledig opgehelderd, zou het een nieuwe of baanbrekende benadering vertegenwoordigen naar cel regelgeving paden.

De sialidase test is een eenvoudige technische aanpak die nieuwe moleculaire mechanisme (s) van TLR sensoren van microbiële infecties en betrokkenheid bij inflammatoire ziekten op de receptor niveau op het celoppervlak van de live macrofagen zullen toelichten.

Detectie van Neu1 Sialidase activiteit in het reguleren van Toll-like receptor activering

Toll-like receptoren (TLR's) van zoogdieren vormen een familie receptoren die pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen herkennen. TLR's zijn niet alleen cruciale sensoren voor ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de inductie van cellulaire nieuwe one sase-activiteit te beoordelen als reactie op ligandbinding aan de specifieke receptor. Dit wordt bereikt door eerst cellen gedurende 24 uur te kweken op cirkelvormige glazen objectglazen van 12 millimeter in een 24-wells weefselkweekplaat. In een tweede stap worden de levende cellen die aan het glazen objectglas zijn gehecht, direct in contact gebracht met een vooraf bereid mengsel van sase-substraat en receptorligand, met of zonder specifieke remmers, op een microscoopglas.Het microscoopglaasje wordt onmiddellijk onder een fluorescentiemicroscoop geplaatst om de fluorescentiebeelden te visualiseren en digitaal vast te leggen. Na verloop van tijd worden resultaten verkregen die veranderingen in de nieuwe nase-activiteit op het celoppervlak tonen bij de met ligand behandelde levende cellen, gebaseerd op de blauwe fluorescentie-intensiteit rondom de cellen onder epifluorescentiemicroscopie.Het belangrijkste voordeel van het gebruik van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals spectrofotometrische analyse, is dat er minder reagentia worden gebruikt. Daarnaast kunt u de sase-activiteit in levende cellen observeren en hiervan beelden vastleggen. Deze methode kan worden gebruikt om kernvragen binnen het vakgebied van de immunologie te beantwoorden, zoals het onderzoeken van potentieel nieuwe ligand-receptorinteracties, evenals het bestuderen van de effecten van specifieke enzym- of proteïneremmers op de receptoractivatie.De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Ray Amit en Dr. PT Gath, voormalige PhD-studenten uit mijn laboratorium, die deze assay gebruiken in hun onderzoeksstudies. Bereid vóór het ontdooien van de bevroren macrofaagcellen het kweekmedium voor met steriel gefilterde delcos, modified eagles medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en vijf microgram per milliliter van het antibioticum plasmin. Voeg vervolgens vier milliliter van het kweekmedium toe aan een cellenkweekfles van 25 vierkante centimeter voor elk vial bevroren cellen; haal het vial met bevroren cellen uit de vriezer van -80 °C en ontdooi dit snel door handopwarming in de steriele biohazard-behuizing.Dit zal ongeveer twee tot drie minuten duren. Zodra de cellen zijn ontdooid, gebruikt u een steriele pipet van één milliliter om ze snel over te brengen naar de kweekfles met het geconditioneerde medium. Plaats de fles met de cellen in een weefselkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2 met behulp van een omgekeerde microscoop.Controleer de cellen dagelijks op groei en adhesie totdat ze enkele dagen vóór het uitplaten van de cellen voor de SASE-assay 75% tot 90% confluent zijn. Bereid de 12 millimeter ronde glazen objectglaasjes voor waarin de cellen geplaatst zullen worden. Voer dit uit in de biologische veiligheidskabinet.Plaats de objectglazen in een grote glazen Petrischaal en steriliseer deze door ze gedurende één uur onder te dompelen in 100% ethanol. Verwijder de alcohol en laat de natte objectglazen 24 uur lang, of totdat ze droog genoeg zijn om te platen, blootgesteld aan de steriele gefilterde luchtstroom in de kast onder UV-licht. Steriliseer vervolgens een volledige gebogen roestvrijstalen gekartelde pincet van vier inch door deze te vlammen.Gebruik vervolgens een pincet om voorzichtig één steriel rond glazen dekglas in elke put van een 24-wells platbodem polystyrene plaat voor weefselkweek te plaatsen. Verwijder met een steriele pipet van 5 mL het DMEM-geconditioneerde medium uit de kolf met de adherente macrofaagcellen. Was de cellen één keer met 1x steriele tris-gebufferde zoutoplossing pH 7.4 om elk serumhoudend medium te verwijderen.Voeg vervolgens 1 mL calciummedium-vrije fosfaatgebufferde zoutoplossing bij pH 7.4 toe. Plaats de cellen gedurende ongeveer 10 minuten in de incubator bij 37 °C, of totdat de cellen in de kolf beginnen los te laten. Zodra de cellen zijn losgelaten, voegt u 3 mL DMEM-geconditioneerd medium toe aan de gesuspendeerde cellen.Overbreng vervolgens 0,5 milliliters van de suspensie met ongeveer 0,5 miljoen cellen naar elk 12 millimeter rond glazen dekglas in de 24-well plaat. Incubeer de weefselkweekplaat met de macrofaagcellen gedurende 24 uur bij 37 degrees Celsius in 5% carbon dioxide om de cellen de mogelijkheid te geven aan de ronde glazen dekglazen te hechten. De assay voor sase-activiteit zal onder drie verschillende condities worden uitgevoerd op drie afzonderlijke microscopische dekglazen. Op het eerste dekglas, dat dient als negatieve controle,Controlecellen worden blootgesteld aan het monteermedium, het neuraminidase-substraat voor ANA en tris-gebufferde zoutoplossing, maar niet aan het toll-like receptor-ligand LPS. Op de tweede slide worden de cellen blootgesteld aan monteermedium, ANA, het toll-like receptor-ligand LPS en tris-gebufferde zoutoplossing.Op de derde objectglas worden cellen blootgesteld aan montagemedium voor ANA, LPS Tris, gebufferde zoutoplossing en de neuraminidase-remmer Tamiflu. We zullen de procedure voor enkel de tweede assay demonstreren, aangezien de drie assays alleen verschillen in de mengeling van verbindingen op het objectglas. Plaats het objectglas op de laboratoriumbank en voeg de volgende verbindingen in opeenvolgende volgorde toe.Eén microliter monteermedium, gevolgd door één microliter van twee microliter LPS en tot slot drie microliter tris-gebufferde zoutoplossing, pH 7.4. Verwijder vervolgens het medium uit één well van de 24-wells plaat die de cellen bevat. De volgende stap is het meest moeilijke aspect van deze procedure, omdat u het cirkelvormige glazen dekglas met een pincet van vier inch uit de well van de weefkweekplaat moet verwijderen zonder het te breken.Til het ronde glazen dekglas voorzichtig naar de hoek van de put en verwijder het vervolgens zorgvuldig om het dekglas met de cellen naar beneden in het oplossingsmengsel te plaatsen. Neem het microscoopglas onmiddellijk naar een epifluorescentiemicroscoop die is ingesteld op het UV-filter en is uitgerust met een digitale camera voor het vastleggen van fluorescentiebeelden. Stel de microscoop scherp onder fasecontrast totdat de cellen zichtbaar zijn en schakel vervolgens over naar de fluorescentiemodus.Leg beelden van de cellen vast in fluorescentiemodus na één minuut, twee minuten en drie minuten. Leg daarnaast een enkel beeld van de cellen vast in fasecontrastweergave. De resultaten van een sase-assay-experiment worden hier getoond.Ten eerste werden, als negatieve controle, levende cellen die aan een glazen objectglas hechtten, in direct contact gebracht met een spotmengsel van montage medium en form substraat IP sase activiteit aanwezig waren. Het substraat zou worden gehydrolyseerd om vrij ethyl lum beone te produceren, dat een fluorescentie-emissie heeft bij 450 nanometers na excitatie bij 365 nanometers, gemeten twee minuten na toevoeging van het substraat.Deze fluorescentieafbeelding vertoont geen sase-activiteit rondom de cellen. De volgende afbeelding toont de resultaten van een positieve test-SASE-assay, waarbij levende cellen die aan een glazen objectglas hechtten, in direct contact werden gebracht met een spotmengsel van montagemedium, substraat 4 en TLR 4-ligand LPS. Het substraat werd gehydrolyseerd door het sase-enzym om vrij ethyl lum beone te produceren, en de fluorescentieafbeelding die twee minuten na toevoeging van het substraat en LPS is genomen, wijst op hoge niveaus van sase-activiteit rondom de cellen.Wanneer levende cellen echter in direct contact werden gebracht met een spotmengsel van montage medium op een nanosubstraat met TLR4-ligand LPS, evenals de neuraminidase-remmer Tamiflu, was de sase-activiteit sterk verminderd of niet langer detecteerbaar, afhankelijk van de concentratie van de remmer. Ten slotte toont deze grafiek de 50% inhiberende concentratie van Tamiflu en Oseltamivir carboxylaat, bepaald door de afname in sase-activiteit uit te zetten tegen de logaritme van de concentratie van het middel; de gemiddelde fluorescentie rondom de cellen voor elke groep werd gemeten met Image J-software. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken de cellen 24 uur vóór aanvang van de Sade-assay te kweken op ronde glazen dekglasjes in 24-well weefselkweekplaten.Daarnaast moeten alle reagentia die in deze assay worden gebruikt, worden klaargemaakt voordat de assay wordt gestart.

detection-neu1-sialidase-activity-regulating-toll-like-receptor

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates an assay to examine the toll-like receptor(TLR)-dependent activity of the transcription factors nuclear factor-kappa-B (NF-κB) and activator protein-1 (AP-1) in macrophages. The TLRs trigger a pro-inflammatory signaling cascade upon recognizing damage-associated molecular patterns (DAMPs), activating NF-κB and AP-1. The engineered reporter macrophages produce secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) enzyme upon NF-κB and AP-1 activation, which is detected via a...

An Assay for TLR-Dependent NF-&kcy;B/AP-1 Transcription Factor Signaling in Macrophages

This video demonstrates a reporter cell-based assay for screening potential bioactive nanoparticles that inhibit Toll-like receptor (TLR) signaling. The assay involves introducing lipopolysaccharides (LPS) mixed with peptide-gold nanoparticle hybrids to reporter macrophages expressing the reporter proteins — secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) and luciferase. The reduction of LPS-induced TLR signal mediated by the hybrids is determined by measuring the reporter signals.

An Assay to Screen Bioactive Nanoparticles for Toll-Like Receptor Signaling Inhibition

Dendritische cellen (DCs) scheiden IL-1β reactie op TLR8 erkenning van synthetische purine, R848, gevolgd door NLRP3 inflammasome activering met nigericine derhalve IL-1β kunnen worden gebruikt om NLRP3 inflammasome te meten. Intracellulaire cytokine kleuring, immunoblotting en ELISA worden gebruikt om NLRP3 inflammasome priming en activering van IL-1β expressie nauwkeurig te meten.

Activering en waardering van NLRP3 inflammasome activiteit met behulp van IL-1β in Human Monocyt-afgeleide dendritische cellen

We beschrijven een HPLC-gebaseerde methode voor de bepaling van N-acetylneuraminezuur en N-glycolylenuraminezuur in muizenlever en melk.

Bepaling van Sialic Acids in Lever en Melk Monsters van Wild-type en<em&gt; CMAH</em&gt; Knock-out Muizen.

TLR-signalering speelt een belangrijke rol in de pathofysiologie van vele menselijke ontstekingsziekten, en het regelen van TLR-reacties door bioactieve nanopartikels wordt geacht in veel ontstekingsomstandigheden gunstig te zijn. THP-1-cel-gebaseerde reportercellen bieden een veelzijdig en robuust screeningsplatform voor het identificeren van nieuwe remmers van TLR-signalering.

Screening van bioactieve nanodeeltjes in phagocytische immuuncellen voor inhibitors van Toll-achtige Receptor Signalering

MALT1 regelt aangeboren immuniteit, maar hoe dit gebeurt blijft vaag. We gebruikten de selectieve MALT1 paracaspase remmer MLT-827 te ontrafelen van de bijdrage van MALT1 aan het aangeboren signalering stroomafwaarts van Toll-like of C-type lectine-achtige receptoren, aan te tonen dat MALT1 de productie van myeloïde cytokines regelt, en "downstream" C-type lectine-achtige receptoren, selectief.

Myeloïde aangeboren signalering Pathway regelgeving door MALT1 Paracaspase activiteit

Dit protocol biedt onderzoekers een snelle, indirecte methode voor het meten van TLR-afhankelijke NF-кB/AP-1 transcriptiefactor-activiteit in een muriene macrofaag cellijn in reactie op een verscheidenheid aan polymere oppervlakken en geadsorbeende eiwit lagen die de micro omgeving van het biomateriaal implantaat modelleren.

Een macrophage reporter Celassay om Tolachtige receptor-gemedieerde NF-kB/AP-1-signalering op geadsorbeerde proteïne lagen op polymere oppervlakken te onderzoeken

Dit protocol bevat een reeks neutrofiele functionele assays die kunnen worden gebruikt als screeningsmethode om functies van verschillende signaalroutes te dekken. Het protocol omvat een eerste en eenvoudige evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen, zuiverheid, productie van reactieve zuurstofsoorten, real-time migratie, fagocytose en een voorlopige suggestie van extracellulaire neutrofiele vallen.

Een reeks screeningstechnieken voor een snel overzicht van de neutrofielenfunctie

Er wordt een uniek, uitgebreid protocol gepresenteerd voor het genereren van gedesialyleerde humane monocyt-afgeleide dendritische cellen (mo-DC's) uit geïsoleerde perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) met behulp van een sialidasebehandeling. Verder worden methoden beschreven om de fenotypische en functionele karakterisering van mo-DC's te beoordelen en te evalueren hoe behandeling met sialidase het rijpingsniveau van mo-DC's verbetert.

Generatie van monocyt-afgeleide dendritische cellen met verschillende gesialyleerde fenotypes

Hier stellen we een eenvoudig protocol voor dat metabole oligosacharide-engineering, klikchemie en expansiemicroscopie combineert en dat bioimaging van intracellulaire gesialyleerde N-glycoproteïnen met verbeterde resolutie mogelijk maakt met behulp van routinematige microscopieapparatuur.

Visualisatie van intracellulaire sialylering met klikchemie en expansiemicroscopie

Leer de sialidase-assay voor het bestuderen van Toll-like receptor-activering op levende macrofagen. Deze methode maakt real-time visualisatie van enzymatische activiteit mogelijk voor immunologisch onderzoek.

Detectie van Neu1 Sialidase activiteit in het reguleren van Toll-like receptor activering

Meer video's verkennen