Name: Voorbereiding van de Klacht Matrices voor het kwantificeren van Cellular Contractie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Leer hoe je compliant matrices bereidt voor het kwantificeren van cellulaire contractie met tractiekrachtmicroscopie. Deze methode maakt analyse van ECM-stijfheid en celgedrag mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken het lab van Ulrich Schwarz voor computational tracking software die gebruikt wordt in de kwantificering van cellulaire trekkrachten (Sabass et al.., 2008). Dit werk werd ondersteund door een Burroughs Wellcome Career Award en de NIH directeur Pioneer Award (DP10D00354) naar ML Gardel en medische Scientist National Research Service Award (5 T32 GM07281) naar SP Winter.

<ol><li>Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+and+micropatterned+conjugation+of+extracellular+matrix+proteins+to+characterized+polyacrylamid+substrates+for+cell+mechanotransduction+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays.</a> Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).</li>
<li>Engler, A., Bacakova, L. N. ewman, Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. ischer <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+compliance+versus+ligand+in+cell+on+gel+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Substrate compliance versus ligand in cell on gel responses.</a> Biophys J. 86 ((1 Pt 1)), 617-628 (2004).</li>
<li>Gardel, M. L., Sabass, B., Ji, L., Danuser, G., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+stress+in+focal+adhesions+correlates+biphasically+with+actin+retrograde+flow+speed%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Traction stress in focal adhesions correlates biphasically with actin retrograde flow speed.</a> J Cell Biol. 183, 999-1005 (2008).</li>
<li>Rajagopalan, P., Marganski, W. A., Brown, X. Q., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+of+the+spread+area%2C+contractility%2C+and+migration+of+balb%2Fc+3T3+fibroblasts+adhered+to+fibronectin-+and+RGD-modified+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata.</a> Biophys J. 87 (4), 2818-2827 (2004).</li>
<li>Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+and+mechanics+of+endothelial+cell+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The dynamics and mechanics of endothelial cell spreading.</a> Biophys J. 89, 676-689 (2005).</li>
<li>Stricker, J., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+traction+force+microscopy+for+micron-sized+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys%3A+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">Optimization of traction force microscopy for micron-sized focal adhesions.</a> J. Phys: Condensed Matter. 22, 194104-194114 (2010).</li>
<li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophys J. 94, 207-220 (2008).</li>
<li>Yeung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+substrate+stiffness+on+cell+morphology%2C+cytoskeletal+structure%2C+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).</li>
<li>Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule%2Forganelle+motility+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule/organelle motility assays.</a> Curr Protoc Cell Biol. , 13.1.1-13.1.21 (1998).</li>
</ol>

De procedure hier beschreven voor het opzetten van een trekkracht microscopie (TFM) experiment samen, met de implementatie van computationele tracking routines (Sabass et al.., 2008), maakt voor de kwantificering van cellulaire krachten met micron-schaal ruimtelijke resolutie. Voor het optimaliseren van de experimentele protocol, is het van cruciaal belang voor een zuivere en uniforme gel substraat vormen met uniforme coating van ECM ligand. We bespreken hieronder mogelijke valkuilen: ...

<table><tbody><tr><td>3-aminopropyltrimethyloxilaan</td><td>Aldrich</td><td>28, 177-8</td><td></td></tr><tr><td>40% acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>2% bis-acrylamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1404</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 150-20</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179</td><td></td></tr><tr><td>40nm fluorescente microsferen</td><td>Invitrogen</td><td>F8789</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>Confocale beeldvormingskamer (RC-30)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0320</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasspinner</td><td>Zelfgemaakt</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Ultravioletlamp CL1000</td><td>UVP Inc.</td><td>95-0228-01</td><td></td></tr><tr><td>Rostvrijstalen rek</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72239-04</td><td></td></tr><tr><td>acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)hexanoïzuur)</td><td>Invitrogen</td><td>A-20770</td><td></td></tr><tr><td>Hydrazinehydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>225819</td><td></td></tr><tr><td>Natriummetaperiodaat</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>20504</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Collageen</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes (#1.5)</td><td>Corning</td><td>2940&amp;#8208;224</td><td></td></tr><tr><td>Glutaaraldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Rain-X</td><td>SOPUS Products</td><td>www.rainx.com</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Acros Organics</td><td>64-19-7</td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiding van de klacht matrices voor het kwantificeren van cellular contractie

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

De regulering van cellulaire adhesie aan de extracellulaire matrix (ECM) is essentieel voor cel-migratie en ECM remodeling. Focale adhesies zijn macromoleculaire assemblages dat het koppelen van de contractiele F-actine cytoskelet aan de ECM. Deze verbinding zorgt voor de overdracht van intracellulaire mechanische krachten over het celmembraan aan de onderliggende substraat. Recent werk is gebleken dat de mechanische eigenschappen van de ECM regelen focal adhesion en F-actine morfologie evenals tal van fysiologische processen, zoals celdifferentiatie, divisie, proliferatie en migratie. Zo is het gebruik van celkweek substraten een steeds gangbare methode om nauwkeurig te regelen en te moduleren ECM mechanische eigenschappen. Te kwantificeren tractie krachten op focale adhesies in een aanhanger cel, voldoen substraten gebruikt in combinatie met hoge-resolutie beeldvorming en computationele technieken in een methode genoemd trekkracht kracht microscopie (TFM). Deze techniek is gebaseerd op metingen van de lokale omvang en richting van substraat vervormingen veroorzaakt door cellulaire contractie. In combinatie met hoge-resolutie fluorescentie microscopie van fluorescent gelabelde eiwitten, is het mogelijk om correleren organisatie van het cytoskelet en remodeling met trekkrachten. Hier presenteren we een gedetailleerde experimentele protocol voor de bereiding van twee-dimensionale, compliant matrices voor het doel van het creëren van een celkweek substraat met een goed gekarakteriseerde, afstembare mechanische stijfheid, die geschikt is voor het meten van cellulaire contractie. Deze protocollen zijn de fabricage van polyacrylamide hydrogels, coating van ECM eiwitten op dergelijke gels, plating cellen op gels, en hoge-resolutie confocale microscopie met behulp van een perfusie kamer. Daarnaast bieden wij een representatieve steekproef van gegevens die aantonen locatie en de omvang van de cellulaire krachten met behulp van genoemde TFM protocollen.

In deze video, tonen we de experimentele technieken die gebruikt worden om compliant, extracellulaire matrix (ECM) gecoate substraten geschikt voor celcultuur fabriceren, en die vatbaar zijn voor trekkracht microscopie en het observeren van de gevolgen van ECM stijfheid op cel gedrag.

Voorbereiding van de Klacht Matrices voor het kwantificeren van Cellular Contractie

De regulatie van cellulaire adhesie aan de extracellulaire matrix (ECM) is essentieel voor celmigratie en ECM-remodellering. Fokale adhesies zijn ...

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van compliant matrixen voor het moduleren en kwantificeren van cellulaire contractie. Dit wordt bereikt door eerst een dekglas te activeren om verankering van de matrix mogelijk te maken. De tweede stap van de procedure is het polymeriseren van een polyacrylamidegel op het geactiveerde dekglas.De derde stap van de procedure is het uitplaten van de cellen op de gel en het laten hechten ervan. De laatste stap van de procedure is het beeldvormen van de gel om gegevens te genereren die kunnen worden geanalyseerd met protocollen voor tractiekrachtmicroscopie. Uiteindelijk kunnen er resultaten worden verkregen die via tractiekrachtmicroscopie laten zien dat cellen tractiekrachten uitoefenen op hun matrix.Hoi, ik ben Yvonne Eons van het laboratorium van Margaret ELL bij de afdeling natuurkunde en het Institute for Biophysical Dynamics aan de University of Chicago. Ik ben Steven Winter, ook van het Guard-laboratorium. Vandaag willen we u een procedure laten zien voor het maken van compliant matrices voor het meten van cellulaire contractie.We gebruiken deze procedures in ons laboratorium om contractiele actine-myosine-netwerken te bestude

preparation-of-complaint-matrices-for-quantifying-cellular-contraction

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We beschrijven de prototypische werkwijze voor het produceren microscoop dekglaasje bedekt met fluorescent gelatine visualiseren invadopodia-gemedieerde matrixafbraak. Rekentechnieken met beschikbare software gepresenteerd voor het kwantificeren van de niveaus van resulterende matrix proteolyse door enkele cellen in een gemengde populatie en voor meercellige groepen omvat gehele microscopische velden.

Kwantitatieve meting van Invadopodia-gemedieerde extracellulaire matrix proteolyse in Single en Meercellige contexten

This video describes the measurement of aortic smooth muscle cell (SMC) contraction using electrical cell-substrate impedance sensing, or ECIS. ECIS measures the locomotion of cells and is a reliable method for measuring contractions.

Measuring SMC Contraction In Vitro: A Non-Invasive Method to Evaluate Smooth Muscle Cells Contraction using Electric Cell-Substrate Impedance Sensing

Dit protocol beschrijft het gebruik van microschaal silicium consoles als buigzaam cultuur oppervlakken voor het meten van de contractiliteit van spiercellen in vitro. Cellular samentrekking cantilever buigen, die kan worden gemeten, geregistreerd en omgezet in uitlezingen van kracht, die een non-invasieve en schaalbaar systeem voor het meten contractiele functie in vitro.

Benutting van microschaal Silicon Cantilevers to Cellular contractiele functie Beoordelen In Vitro

Hier beschrijven we de ontwikkeling en toepassing van een gelcontractie-assay voor het evalueren van contractiele functie in mesenchymale cellen die een epitheel-mesenchymale overgang hebben ondergaan.

Ontwikkeling van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay om contractiele functie van mesenchymale Cellen die Onderging-mesenchymale transitie Evalueer

Celdifferentiatie wordt gereguleerd door een groot aantal micro-omgeving factoren, met inbegrip van zowel matrix samenstelling en de ondergrond eigenschappen. We beschrijven hier een techniek gebruikmaking cel microarrays in samenhang met trekkracht microscopie zowel celdifferentiatie en biomechanische cel- substraatinteracties als functie van de micro-omgeving context evalueren.

Een High-throughput Cell Microarray Platform voor Correlatieve Analyse van de Cel Differentiatie en trekkrachten

Mechanische krachten zijn belangrijk voor het beheersen van de Celmigratie. Dit protocol demonstreert het gebruik van elastische hydrogels die kunnen worden vervormd met behulp van een glazen micro pipet en een micro manipulator om cellen te stimuleren met een lokale stijfheids gradiënt om veranderingen in celstructuur en migratie teweeg te brengen.

Enkelvoudige cel Duro Taxis assay voor de beoordeling van de mechanische controle van cellulaire beweging en gerelateerde signalering van gebeurtenissen

We presenteren een protocol voor de evaluatie van de elektromechanische effecten van GtACR1 activering bij konijnencardiomyocyten. We geven gedetailleerde informatie over celisolatie, kweek- en adenovirale transductie, en over functionele experimenten met de patch-clamp en koolstofvezel technieken.

Elektromechanische beoordeling van optogenetisch gemoduleerde cardiomyocyteactiviteit

Dit artikel beschrijft een op explantcultuur gebaseerde methode voor de isolatie en kweek van primaire, patiëntspecifieke menselijke aorta gladde spiercellen en dermale fibroblasten. Verder wordt een nieuwe methode gepresenteerd voor het meten van celcontractie en daaropvolgende analyse, die kan worden gebruikt om patiëntspecifieke verschillen in deze cellen te bestuderen.

Isolatie van primaire patiëntspecifieke gladde spiercellen van aorta en semikwantitatieve real-time contractiemetingen in vitro

Dit werk presenteert een flexibel protocol voor het gebruik van fluorescerend gelabelde elastomeer contracteerbare oppervlakken (FLECS) -technologie in microwell-formaat voor vereenvoudigde, hands-off kwantificering van contractiele krachten met één cel op basis van gevisualiseerde verplaatsingen van fluorescerende eiwitmicropatronen.

Vereenvoudigde, high-throughput analyse van eencellige contractiliteit met behulp van microgepatterde elastomeren

De analyse van veranderingen in contractiele functie en cellulaire integriteit van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten is van immens belang voor de ontwikkeling van niet-klinische geneesmiddelen. Een hybride 96-well celanalysesysteem behandelt beide parameters op een real-time en fysiologische manier voor betrouwbare, voor de mens relevante resultaten, die nodig zijn voor een veilige overgang naar klinische stadia.

Hybride celanalysesysteem om structurele en contractiele veranderingen van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten te beoordelen voor preklinische cardiale risico-evaluatie

Dit protocol beschrijft hoe contractiliteit in volwassen menselijke primaire cardiomyocyten van donorharten kan worden gemeten met het MyoBLAZER-systeem, een betrouwbaar platform voor het beoordelen van door geneesmiddelen geïnduceerde veranderingen in contractiliteit tijdens preklinische ontwikkeling.

Meting van hartcontractiliteit in geïsoleerde volwassen menselijke primaire cardiomyocyten

Leer hoe je compliant matrices bereidt voor het kwantificeren van cellulaire contractie met tractiekrachtmicroscopie. Deze methode maakt analyse van ECM-stijfheid en celgedrag mogelijk.

Voorbereiding van de Klacht Matrices voor het kwantificeren van Cellular Contractie

Meer video's verkennen