Voorbereiding van de Klacht Matrices voor het kwantificeren van Cellular Contractie

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van compliant matrixen voor het moduleren en kwantificeren van cellulaire contractie. Dit wordt bereikt door eerst een dekglas te activeren om verankering van de matrix mogelijk te maken. De tweede stap van de procedure is het polymeriseren van een polyacrylamidegel op het geactiveerde dekglas.

De derde stap van de procedure is het uitplaten van de cellen op de gel en het laten hechten ervan. De laatste stap van de procedure is het beeldvormen van de gel om gegevens te genereren die kunnen worden geanalyseerd met protocollen voor tractiekrachtmicroscopie. Uiteindelijk kunnen er resultaten worden verkregen die via tractiekrachtmicroscopie laten zien dat cellen tractiekrachten uitoefenen op hun matrix.

Hoi, ik ben Yvonne Eons van het laboratorium van Margaret ELL bij de afdeling natuurkunde en het Institute for Biophysical Dynamics aan de University of Chicago. Ik ben Steven Winter, ook van het Guard-laboratorium. Vandaag willen we u een procedure laten zien voor het maken van compliant matrices voor het meten van cellulaire contractie.

We gebruiken deze procedures in ons laboratorium om contractiele actine-myosine-netwerken te bestuderen. Laten we beginnen. Voorafgaand aan de activering van de dekglasjes werden verschillende 22 bij 40 millimeter nummer 1,5 dekglasjes geplaatst.

Spoel af met 70% ethanol in een rek van roestvrij staal, zodanig dat de dekglasjes verspreid liggen en elkaar niet raken. Bereid, terwijl u in een chemische zuurkast werkt, een 2% three or minor profile trimeth-oplossing in isopropanol voor in een vierkante glazen schaal. Gebruik een glazen pasteurpipet om de three or minoro profile toe te voegen.

Vanwege de reactiviteit met plastic moet trimethoxy de dekglasjes volledig onderdompelen in deze oplossing; incubeer deze gedurende 10 minuten onder constant roeren op een roerplaat in de zuurkast. Was de dekglasjes na het weken door ze onder te dompelen in dubbel gedestilleerd water. Ververs het water vier keer; gebruik het water na de laatste verversing.

Laat de dekglasjes 10 minuten weken onder roering. Droog de dekglasjes vervolgens 10 minuten in een incubator bij ongeveer 37 °C. Laat ze na het drogen afkoelen tot kamertemperatuur.

Dompel de dekglasjes 30 minuten lang onder in een 1% glutaraldehyde-oplossing in dubbel gedestilleerd water, in een vierkante glazen schaal op een roerplaat. Zorg ervoor dat er een schone schaal wordt gebruikt.

Anders kan de oplossing achteraf troebel lijken. Was de dekglasjes door drie keer te spoelen met dubbel gedestilleerd water gedurende 10 minuten per spoelbeurt onder roering. Dek de dekglasjes vervolgens af met aluminiumfolie om stof te voorkomen en laat ze drogen bij kamertemperatuur.

Bewaar de dekglasjes na het drogen tot twee maanden op een droge, stofvrije plek. Bereid voor het maken van de polyacrylamide- of PAA-gel eerst stamoplossingen van acrylamide-bis. Maak een acrylamide-mix van 40% acrylamide en 2% bis-acrylamide, zoals beschreven in het RI-protocol.

Ontgas de acrylamide-oplossing in een vacuümkamer gedurende 20 minuten. Dit vermindert de hoeveelheid zuurstof in de gel, wat polymerisatie voorkomt. Bereid ondertussen een 10% ammoniumpersulfaat- of PS-oplossing.

Veeg vervolgens microscopiglazen van één bij drie inch af met Rain X-doekjes om het oppervlak van het glazen objectglas hydrofoob te maken. Verwijder eventueel stof met een Kimwipe om een glad geloppervlak te garanderen. Dek het objectglas af met aluminiumfolie en zet het apart.

Verwijder vervolgens de acrylamide-oplossing uit de vacuümkamer en voeg fluorescente beads toe. Om de polymerisatie van de gel te initiëren, voegt u 0,75 µL TM E en 2,5 µL 10%a PS toe. Meng de oplossing kort door herhaaldelijk met de pipet op en neer te zuigen. Breng daarna 10 tot 12 µL van de acrylamide-oplossing aan op de eerder voorbereide hydrofobe microscoopglaasje.

Plaats een geactiveerd dekglas van 22 bij 40 millimeter bovenop de druppel. De gelloplossing moet het gehele dekglas bedekken. Verwijder eventuele luchtbellen die in de oplossing verschijnen door deze uit te strijken.

Laat de gelloplossing ongeveer 10 minuten polymeriseren bij kamertemperatuur. Zodra de polymerisatie voltooid is, zal de gel loskomen van de rand van het dekglas. Verwijder met de fijne punt van een pincet voorzichtig het dekglas met de gehechte gel van het oppervlak van het microscopisch objectglas.

Dompel de gel onder in een Petrischaal met dubbel gedestilleerd water om het geloppervlak gehydrateerd te houden voor het crosslinken van het extracellulaire matrix- of ECM-eiwit aan de gel. Bereid vervolgens werkende aliquots van 40 µL sulfur san par door SULF san par-poeder op te lossen in watervrij dimethylsulfoxide of DMSO. Verwijder daarna kort het dubbel gedestilleerde water van het geloppervlak met behulp van onze coverslip-spinner.

Zorg ervoor dat de gel vlak voor gebruik niet uitdroogt. Verdun de sulfur sampa DMSO-aliquots in dubbel gedestilleerd water en breng ongeveer 200 µL aan op het midden van het geloppervlak. Stel het geloppervlak vervolgens bloot aan UV-licht in een UV-crosslinkeroven.

Dompel de dekglasjes na UV-blootstelling in een bekerglas met vers dubbel gedestilleerd water. Verwijder alle vloeistof van het geloppervlak met een dekglascentrifuge. Plaats de param vervolgens in een petrischaal en breng 50 µL koude fibronectine aan op de param.

Keer het dekglas om en plaats de gelzijde bovenop het fibronectine. Laat de dekglasjes één tot twee uur reageren bij kamertemperatuur of een nacht bij vier graden Celsius. Na incubatie in een steriele, geventileerde kweekkast.

Plaats de dekglasjes in weefselkweekschaaltjes van zes centimeter die gevuld zijn met PBS om de dekglasjes te coaten. Was de dekglasjes grondig met meerdere wisselingen van PBS onder steriele omstandigheden na het wassen. Steriliseer de dekglasjes door een UV-behandeling van 30 minuten.

Incubeer de dekglasjes vervolgens 30 tot 45 minuten in celmedium voordat de cellen worden geplaatst. Plaats daarna een dekglasje van 22 bij 30 millimeter op de bovenste dekglashouder van een Warner Instruments confocale beeldvormingskamer, waarbij vacuümvet wordt gebruikt om het dekglasje op zijn plaats te houden. Plaats een rubberen pakking voor de kamer op het dekglasje, zodat er toegang is tot zowel de inlaat- als de uitlaat van de polyethyleenslangen.

Dit maakt een tussenruimte van 150 tot 1000 microns mogelijk tussen het bovenste dekglas en het met gel gecoate dekglas van 22 bij 40 millimeter, afhankelijk van de gebruikte afdichting. Laad vervolgens spuiten met warm celmedium in de inlaatslang via de verbindingskit en controleer of het medium door de slang naar het bovenste dekglas stroomt. Breng vacuümvet aan op de basis van de kamer en plaats een met gel gecoat dekglas van 22 bij 40 millimeter met de celzijde naar boven.

Breng het warme medium aan op de cellen. Plaats de houder voor het bovenste dekglas op de basis van de kamer, waarbij de kamerpakkingen deze scheiden van het met gel gecoate dekglas. Zorg ervoor dat de positioneringspinnen in de basis van de kamer in de positioneringsgaten van het bovenste dekglas vallen.

Plaats de drukplaat op de basis van de kamer en gebruik de drukplaatsleutel om de drukplaat aan te draaien en te bevestigen. Controleer de doorstroming van het medium door de slang en de kamer om eventuele lekken in de kamer te monitoren en om zones zonder medium op het celoppervlak te elimineren.

Plaats de confocale beeldkamer op de objecttafeladapter in een microscoophouder om beelden op te nemen van fluorescent gelabelde eiwitten en fluorescerende beads die zijn ingebed in het gelsubstraat met een confocale fluorescentiemicroscoop, om zo een beeld te verkrijgen van de positie van de beads zonder spanning binnen de gelperfusie. Voer stappen uit om cellulaire adhesies van de gel los te koppelen en neem een beeld op van de fluorescerende beads in hetzelfde beeldveld waar de cellen zich bevinden. Wanneer het protocol correct wordt gevolgd, zal het geloppervlak relatief vlak en glad zijn, met fluorescerende beads die gelijkmatig overal zijn ingebed.

De ECM kan ook worden gevisualiseerd door middel van fibronectine-immunofluorescentie. Indien de gelcontractie op de locatie van focale adhesies wordt gemeten, moet de beeldvorming van de gel en de cellen plaatsvinden in het confocale optische vlak van de focale adhesies. Hier worden focale adhesies gevisualiseerd in een attractiekrachtexperiment in een menselijke osteosarcoom- of U2 OS-cel gemarkeerd met GFP pxi.

De contractie van een gel kan worden gevisualiseerd door de verplaatsing van ingebedde fluorescerende beads onderliggend aan focale adhesies. Vergelijking van onder spanning staande beads in het groen en beads in ongespannen posities in het rood maakt kwantificering van de verplaatsing van het gelsubstraat onder contractie mogelijk; hier is een representatief resultaat van een uitgespreide cel die door trypsine loskomt van het geloppervlak. Hier is een representatief resultaat bij de vergelijking tussen gespannen en ongespannen beadposities.

Het gebruik van geavanceerde computationele algoritmen kan de tractiespanningen opleveren die geassocieerd zijn met de verplaatsing van de kraaltjes en de elastische modulus van de gels. Deze spanningen worden hier gevisualiseerd met een heatmap en met vectoren, waarbij de warmere kleuren op de heatmap en grotere pijlen sterkere krachten aanduiden. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u compliant matrices maakt voor het meten van cellulaire contractie bij het uitvoeren van deze procedure.

Het is belangrijk om vooruit te plannen, zodat de tijdgevoelige stappen snel kunnen worden uitgevoerd. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.