Name: Productie van Chick Embryo Extract voor de teelt van Muizen neurale lijst Stem Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Leer hoe je kippenembryo-extract produceert voor de kweek van neurale lijst stamcellen bij muizen. Dit protocol omvat isolatie, masticatie, centrifugatie en filtratie van 11 dagen oude embryo's.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De ondersteuning en advies van Markus Pajtler en Robert Bohrer waren van onschatbare waarde voor de visualisatie van dit protocol.

De auteurs stellen dat experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese Gemeenschappen richtlijn (86/609/EEG), volgens de richtlijnen van de NIH ten aanzien van de zorg en het gebruik van dieren voor experimentele procedures en de regels uiteengezet door de Institutional Animal set zorg en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van Duisburg-Essen (Duitsland). Deel 1: instellen (niet getoond op video) VOORBEREIDEN materialen en oplossingen (voorafgaand aan het nemen van de eieren uit de broedmachine) <ul><li> Eieren moeten worden geïncubeerd in een bevochtigde incubator gedurende 11 dagen bij 37 ° C (100 ° F). </li><li> 70% ethanol spray, schone borden, precies schone tang, 4 ° C (40 ° F) koud steriel DMEM op ijs en 60 ml steriele spuiten </li><li> 50 ml steriele Corning buizen moeten worden half gevuld met 4 ° C koude DMEM aan de gemacereerd embryo&#39;s mix met een verhouding van 1:1 (geweekt massa: DMEM). Zodra de eitjes worden uit de incubator dissectie van de kippenembryo&#39;s moet worden gestart. </li><li> Steriliseer dissectie-instrumenten in de autoclaaf of op de dag van de dissectie, dompel de tools in 70% ethanol gedurende 20 minuten. </li></ul> Deel 2: Dissectie van de kippenembryo&#39;s (gedemonstreerd op Video) <ol><li> Wet van de bebroede eieren met een 70% ethanol spray voor minstens 30 seconden en zorgvuldig droog ze af met een schone zachte papieren zakdoekjes, terwijl niet schudden van de eieren overdreven. Opmerking: We raden niet ontleden van meer dan 60 kippenembryo&#39;s tegelijk. </li><li> Voorzichtig open de eieren door de onstuimige tegen een scherpe rand en nemen het embryo met de nodige voorzichtigheid niet het vernietigen van de dooier zak of het kippenembryo zelf. </li><li> Zoek naar het begin van de navelstreng snel en open de duidelijke verpakking, zonder het vernietigen van de dooier zak of een kleine schepen. Vervolgens ontleden de navelstreng met nauwkeurige schoon pincet. </li><li> Neem het embryo uit de dooierzak. Let op: Embryo&#39;s moeten snel worden onthoofd (niet getoond in de video). </li><li> Het verzamelen van de embryo&#39;s minimaal essentieel medium bij 4 ° C. </li></ol> Deel 3: maceratie van de kippenembryo&#39;s <ol><li> Haal de zuiger van een 60 ml steriele spuit. </li><li> Breng circa 10 embryo&#39;s in een 60 ml spuit. </li><li> Zet de zuiger voorzichtig terug in de spuit om niet het risico te verliezen gemacereerde materiaal. </li><li> Maceraat door erop te drukken de zuiger. </li><li> Verzamel de geweekt massa in de voorbereide Corning buizen half-gevuld met DMEM in een verhouding van 1:1 (geweekt massa: DMEM). Met behulp van 10 embryo&#39;s een volume van ongeveer 25 ml is geproduceerd. </li><li> Leg het mengsel op een shaker voor 45 min bij 4 ° C. </li></ol> Deel 4: Centrifugeren van het kippenembryo - DMEM Suspension <ol><li> Breng de kippenembryo - DMEM suspensie in het centrifugeren buizen. </li><li> Voeg steriele hyaluronidase bij een concentratie van 1 mg per 25 mg embryo. </li><li> Tare het centrifugeren buisjes zeer nauwkeurig. Opmerking: Deze stap moet worden uitgevoerd met de nodige voorzichtigheid centrifugeren draait op zeer hoge g-kracht en beschadiging van materiaal of centrifuge kan optreden bij gebruik van onevenwichtige buizen. Met een hoge nauwkeurigheid weegmachine overeenstemming ten aanzien van de drie posities na de decimale punt voor alle buizen te zijn ontvangen door het aanpassen van het ontbrekende bedrag met DMEM. </li><li> Verlaag de temperatuur van de centrifuge tot 4 ° C. Let op: Ook het centrifugeren rotor moeten worden opgeslagen in een koelkamer of een koelkast gedurende een nacht. </li><li> Centrifugeer zes uur op zijn minst voor 180.000 xgx uur Opmerking: Voor superieure resultaten met betrekking tot de scheiding van de interne fasen gebruik 266.000 xgx h. Indien mogelijk, gebruik maken van de vacuum aanpassing. </li></ol> Deel 5: Filtratie van de Chick Embryo Extract Na het centrifugeren, kunnen drie fasen worden opgemerkt: De bovenste smoezelig vloeibare fase met vette fragmenten, de heldere vloeistof fase in het midden en de pellet op de bodem van de centrifugebuis. Opmerking: schudden of stevige verplaatsen van het mengsel gecentrifugeerd worden om strikt vermeden, omdat dit zou het resultaat van het centrifugeren stap te vernietigen door het verlies van de heldere centrale vloeibare fase. Opmerking: Alle volgende stappen dienen te worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden gebruik van een laminaire luchtstroom bank: <ol><li> Pipetteer de heldere vloeistof fase in een filter systeem met poriën van 0,45 micrometer. Schakel dan de aangesloten vacuumpomp. Opmerking: Raak de pellet aan de onderkant. Dit zou leiden tot een besmetting van het extract en een verstopping van het filter systeem. </li><li> Breng het pre-extract in een filter systeem met poriën van 0,22 urn en schakel de aangesloten vacuumpomp opnieuw. </li><li> Aliquot de bereikte kuiken embryo extractin een steriele 15 ml Corning buizen. </li><li> Snel de monsters op te slaan bij -80 ° C (-62 ° F). Opmerking: De CEE duren maximaal twee jaar indien bewaard bij -80 ° C. </li></ol>

<ol><li>Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+analysis+reveals+multipotency+of+some+avian+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells.</a> Nature. 335, 161-164 (1988).</li>
<li>Stemple, D. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+stem+cell+for+neurons+and+glia+from+the+mammalian+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest.</a> Cell. 71, 973-985 (1992).</li>
<li>Rao, M. S., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+and+controlled+in+vitro+differentiation+of+murine+multipotent+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Immortalization and controlled in vitro differentiation of murine multipotent neural crest stem cells.</a> J Neurobiol. 32, 722-746 (1997).</li>
<li>Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+glial+fate+acquisition+of+neural+crest+cells+are+regulated+by+an+interplay+between+the+transcription+factor+Sox10+and+extrinsic+combinatorial+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling.</a> Cell. 128, 3949-3961 (2001).</li>
<li>Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX10+maintains+multipotency+and+inhibits+neuronal+differentiation+of+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells.</a> Neuron. 38, 17-31 (2003).</li>
<li>Anderson, D. J., Groves, A., Lo, L., Ma, Q., Rao, M., Shah, N. M., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+determination+and+the+control+of+neuronal+identity+in+the+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Review+Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell lineage determination and the control of neuronal identity in the neural crest.</a> Review Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 493-504 (1997).</li>
<li>Dorsky, R. I., Moon, R. T., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+signals+and+cell+fate+specification+in+premigratory+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Review+Bioessays%22%5BJournal%5D)">Environmental signals and cell fate specification in premigratory neural crest.</a> Review Bioessays. 22, 708-716 (2000).</li>
<li>Sieber-Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+controlling+lineage+specification+in+the+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Factors controlling lineage specification in the neural crest.</a> Int Rev Cytol. 197, 1-33 (2000).</li>
<li>Dupin, E., Real, C., Ledouarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+crest+stem+cells%3A+control+of+neural+crest+cell+fate+and+plasticity+by+endothelin-3%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">The neural crest stem cells: control of neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3.</a> Int Rev Cytol. 73, 533-545 (2001).</li>
<li>Maurer, J., Fuchs, S., Jäger, R., Kurz, B., Sommer, L., Schorle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+controlled+differentiation+of+neural+crest+stem+cell+lines+using+conditional+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Establishment and controlled differentiation of neural crest stem cell lines using conditional transgenesis.</a> Differentiation. 75, 890-891 (2007).</li>
<li>Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+stem+and+precursor+cells+from+fetal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue.</a> Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).</li>
</ol>

Dit protocol is gebaseerd op de wijzigingen van de procedures die zijn beschreven in het verleden 10,11. Naast de voormalige publicaties we hier laten zien van de individuele verschillende stappen van het proces meer uitgebreid. Dit ondersteunt de onderzoeker met belangrijke gegevens te verzekeren de juiste procedures en betrouwbare resultaten. Verder, als de dissectie proces is een essentieel onderdeel van CEE extractie beschrijven we de procedure voor het nemen van de embryo&#39;s uit de dooierzak in elk de...

<table><tbody><tr><td>11 dagen geincubeerde kippeneieren</td><td>Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcoholische desinfectiespray</td><td>Sch&amp;#252;lke Mayr GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEMGlutamax</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriele spuit (60 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriele buizen (50; 15 ml)</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriele pipetpunten</td><td>Starlab GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase typeIV-S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milipore stericups steriel (0,45; 0,22 &amp;mu;l)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriele pipetten (25; 10; 5 ml)</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge L5-50</td><td>Rotor type Ti-45</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

productie van chick embryo extract voor de teelt van muizen neurale lijst stem cells

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

De neurale lijst komt voort uit het neuro-ectoderm tijdens de embryogenese en blijft slechts tijdelijk. Vroege experimenten al ondoorlaatbaar pluripotente voorlopercellen naar een integraal onderdeel van de neurale lijst 1. Fenotypisch, zijn neurale stamcellen (NCSC) gedefinieerd door gelijktijdig te drukken p75 (low-affiene zenuw groeifactor receptor, LNGFR) en SOX10 tijdens hun migratie van de neurale lijst 2,3,4,5. Deze stamcellen kunnen differentiëren in gladde spiercellen, chroomaffiene cellen, neuronen en gliacellen, evenals melanocyten, kraakbeen en bot 6,7,8,9. Te cultiveren NCSC in vitro, een speciale neurale stamcellen medium (NCSCM) is vereist 10. Het meest complexe deel van de NCSCM is de voorbereiding van de kippenembryo extract (CEE) die een essentiële bron van groei factoren voor de NCSC als voor andere vormen van neurale explantaten. Andere NCSCM ingrediënten naast CEE zijn commercieel verkrijgbaar. Het produceren van CCE met behulp van laboratorium-standaard uitrusting is het van groot belang om te weten over de uitdagende details zoals de isolatie, maceratie, centrifugeren en filtratie processen. In dit protocol beschrijven we accurate technieken om een ​​maximale hoeveelheid van pure en hoge kwaliteit CEE te produceren.

Om neurale lijst stamcellen (NCSC) kweken in vitro, is een speciaal medium (NCSCM) vereist. Essentieel onderdeel van NCSCM is kippenembryo extract (CEE). We beschrijven hier accurate technieken om een ​​maximale hoeveelheid van pure en hoge kwaliteit CEE, inclusief details zoals de isolatie, maceratie, centrifugeren en filtratie processen te produceren.

Productie van Chick Embryo Extract voor de teelt van Muizen neurale lijst Stem Cells

De neurale lijst ontstaat uit het neuro-ectoderm tijdens de embryogenese en is slechts tijdelijk aanwezig. Vroege experimenten hebben reeds aangetoond dat pluripotentie ...

Hallo, mijn naam is Annaa van het laboratorium van Professor Ika Egar van de Afdeling Pediatrische Oncologie aan het Universitair Kinderziekenhuis in Essen, Duitsland. Vandaag laten we u een procedure zien voor het bereiden van extracten van 11 dagen oude prenatale embryonale kiers. Plaats DMEM op ijs om het af te koelen tot ten minste vier graden Celsius.We gebruiken DMEM-glutamaat uit steriele buizen van GIB co door deze voor de helft te vullen. Was de eieren met 70% ethanol met behulp van het MEM; gebruik eieren die 11 dagen lang bij 100 °F zijn geïncubeerd in een bevochtigde incubator. Zorg ervoor dat de ethanol gedurende ten minste 30 seconden wordt ingebreken.Droog de eieren na toepassing voorzichtig af met zachte papieren handdoeken. Reinig een plastic of glazen plaat met ethanol. Open de eieren.Plaats het embryo zorgvuldig in de plaat. Vernietig het EC of kleine bloedvaten niet. Gebruik scherpe, schone precisiepincetten om de embryo's vrij te prepareren.Zoek eerst naar de navelstreng. Zorg er tijdens het zoeken naar de navelstreng voor dat het dooierzakje of kleine bloedvaten niet worden beschadigd. Zodra u de navelstreng heeft gevonden, volgt u deze terug naar het begin en

production-chick-embryo-extract-for-cultivation-murine-neural-crest

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video beschrijft de methode die wordt gebruikt voor het isoleren van neuroprecursors uit de ontwikkelingslanden cortex van embryonale muizen. De procedure voor het verwijderen van embryo's uit de baarmoeder, het ontleden van de corticale weefsel, en verteren de geïsoleerde cerebrale cortex wordt weergegeven.

Cultuur van Mouse Neurale Stem Cell Voorlopers

Neurale inductie is de eerste stap in de vorming van de hersenen. Het is een mechanisme waarmee Hensen's node (organisator), instrueert aangrenzend weefsel aan te nemen een neurale lot, dat wil zeggen om aanleiding te geven aan het zenuwstelsel. Deze video toont een test voor neurale inductie bij kippenembryo.

Test voor Neurale Inductie in het kippenembryo

Isolatie van embryonale neurale lijst van de neurale buis vergemakkelijkt het gebruik...

Isolatie en Cultuur van neurale lijst cellen van embryonale Murine Neural Tube

This video demonstrates a method for the in vitro generation of neural progenitor cells (NPCs) from mouse embryonic stem cells (mESCs). The mESCs are cultured in suspension to form embryoid bodies (EBs), which are then guided to differentiate into NPCs via retinoic acid treatment in an adherent culture.

A Technique for Generating Neural Progenitor Cells from Mouse Embryonic Stem Cells

This video illustrates a technique for isolating cranial neural folds from the midbrain region of chick embryos. It presents a detailed dissection process of the neural folds, their placement, and attachment on fibronectin-coated coverslips, followed by the observation of neural crest cell migration from the neural folds.

Isolating Cranial Neural Folds From a Chick Embryo for a Neural Crest Cell Culture

Dit protocol beschrijft in detail de methode voor het genereren van neurale progenitoren uit embryonale stamcellen met behulp van een serumvrije monolaagmethode. Deze progenitoren kunnen worden gebruikt om rijpe neurale celtypen te verkrijgen of om het proces van neurale specificatie te bestuderen en is geschikt voor schaalvergroting in multiwell-formaat voor compound screening.

Neurale differentiatie van muis embryonale stamcellen in serum-vrije monolaagkweek

Epitheliële naar mesenchymale overgang (EMT) maakt het mogelijk dat kankers invasief worden. Om EMT te onderzoeken, wordt een op neurale stamcellen (NSC) gebaseerd in vitro model beschreven dat vrij is van serum en enzymen. Dit gestandaardiseerde systeem maakt een kwantitatieve en kwalitatieve beoordeling van celmigratie, gen- en eiwitexpressie mogelijk. Het model is geschikt voor geneesmiddelontdekking.

Een enzym en Serum-free neurale stamcel Cultuur Model voor EMT Investigation Geschikt voor Drug Discovery

Dit artikel beschrijft een protocol om efficiënt ontlenen en cultuur pluripotente stamcellijnen uit muis embryo's in het blastocyst stadium.

Afleiding van stamcellijnen uit muis voor inplanting embryo 's

Hier introduceren wij een nieuwe microchirurgische techniek voor de isolatie van neurale stamcellen uit de E13 muis embryo ganglionaire eminentie.

Isolatie en cultuur van muis embryonale neurale stamcellen

Dit protocol beschrijft de dissectie en de cultuur van craniale neurale Crest cellen van muismodellen, voornamelijk voor de studie van de Celmigratie. We beschrijven de gebruikte technieken voor Live Imaging en de analyse van veranderingen in snelheid en celvorm.

Dissectie, cultuur en analyse van primaire Cranial neurale Crest cellen van de muis voor de studie van neurale Crest Celdelaminatie en migratie

Dit veelzijdige protocol beschrijft de isolatie van premigratory neural crest cells (NCC's) door de excisie van craniale neurale plooien van kuikenembryo's. Bij plating en incubatie komen migrerende NCC's tevoorschijn uit neurale vouwexplantaten, waardoor celmorfologie en migratie in een vereenvoudigde 2D-omgeving kunnen worden beoordeeld.

Voorbereiding en morfologische analyse van Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

Leer hoe je kippenembryo-extract produceert voor de kweek van neurale lijst stamcellen bij muizen. Dit protocol omvat isolatie, masticatie, centrifugatie en filtratie van 11 dagen oude embryo's.

Productie van Chick Embryo Extract voor de teelt van Muizen neurale lijst Stem Cells

Meer video's verkennen