Fabricage van een microfluïdische apparaat voor de compartimentering van Neuron Soma en axonen
22 augustus 2007
In deze video laten we zien de techniek van zachte lithografie met polydimethylsiloxaan (PDMS), dat we gebruiken om een microfluïdische apparaat voor het kweken van neuronen farbricate.
Welkom in het laboratorium van Dr. Newly John. Het John Lab is gespecialiseerd in de ontwikkeling van microfluïdische platforms voor biologische toepassingen. In deze video zullen we de productie en het gebruik demonstreren van een microfluïdisch apparaat dat is ontworpen voor het compartimentaliseren en kweken van primaire neuronen.
Het neuronapparaat werd voor het eerst gepubliceerd in Nature Methods in augustus 2005. Sinds de introductie is het neuronapparaat wijd gebruikt door samenwerkingspartners over de hele wereld. Het neuronapparaat bestaat uit een stuk PDMS dat is gegoten op een siliciumwafer met een SUA-patroon van het apparaat, dat eerder is gemaakt door fotolitografie.
Het apparaat heeft drie hoofdkenmerken, vier reservoirs, acht millimeter in diameter, twee hoofdkanalen, elk 1,5 millimeter breed, zeven millimeter lang en honderd microns hoog en microgroeven, die 10 micrometer breed en drie micrometer hoog zijn en die de twee hoofdkanalen verbinden. De microgroeven kunnen variëren in lengte van 150 microns tot 900 microns, hoewel de standaard lengte van keuze 450 microns is. Als we het apparaat zo bekijken dat de hoofdkanalen en de microgroeven verticaal staan, kunnen we zien dat de reservoirs links van de groeven via de hoofdkanalen zijn verbonden, evenals de reservoirs rechts.
Deze functie maakt het mogelijk dat vloeistof door het hoofdkanaal stroomt, wat een belangrijk kenmerk is en het mogelijk maakt om cellen te laden en media te veranderen. Het neuronapparaat heeft drie grote voordelen boven traditionele weefselkweekplatforms. Ten eerste maakt het compartimentalisatie van cellichamen of soma en de axonen mogelijk. Met het neuronapparaat is het mogelijk om zuivere axonale fracties te verkrijgen.
De grootte en lengte van de microgroeven maken het mogelijk dat axonen door het andere hoofdkanaal gaan terwijl de zagdelijven niet oversteken. Nummer twee, dankzij het ontwerp van het apparaat en door gebruik te maken van hydrostatische druk, is het mogelijk om de celzijde en/of de axonzijde van het apparaat afzonderlijk te behandelen door simpelweg het volume en de reservoirs hoger te houden aan één kant van het apparaat dan de andere. En nummer drie, de zuivere axonale fractie van het apparaat kan worden afgesneden door vacuümzuiging, waardoor de onderzoeker axonale regeneratie kan bestuderen en observeren.
Onderzoeker Hina Lee zal nu demonstreren hoe de microfluïdische neuronapparaat wordt voorbereid. Een drie Ang-siliciumwafer met een patroon gemaakt van SU acht door fotolitografie wordt gebruikt om de polydimethylsiloxaan PDMS microfluïdische mal te gieten. We verwijzen naar de SUA-patroon siliciumwafer als mastermalen of gewoon masters.
PDMS wordt gemengd met hardingsmiddel in een gewichtsverhouding van 10 tot 1. Dat is bijvoorbeeld 15 gram PDMS per 1,5 gram hardingsmiddel. Het PDMS wordt vervolgens goed gemengd en op de siliciumwafer gegoten.
De siliciumwafer wordt in een 10 centimeter polystyreen petrischaal bewaard. Het duurt ongeveer 12 gram tot 15 gram PDMS om de MA's met een dikte van ongeveer vier millimeter te bedekken. De master met PDMS wordt vervolgens in een vacuümdroogkast geplaatst met de deksel van de petrischaal eraf en er wordt vacuüm toegepast.
Dit wordt gedaan om luchtbellen uit het PDMS te verwijderen die zijn geïntroduceerd tijdens het roeren van het hardingsmiddel. Het duurt ongeveer 15 minuten voordat de luchtbellen zijn verwijderd. De master met PDMS wordt na 15 minuten in de vacuümdroogkast uit de droogkast verwijderd.
Er zijn nog steeds een paar resterende luchtbellen op de PDMS-master. Er wordt een luchtpistool met een 0,45 micron filter gebruikt om eventuele resterende luchtbellen te verwijderen. De master wordt vervolgens een uur lang op een heet plaatje van 80 graden geplaatst om uit te harden.
Als een vacuümdroogkast niet beschikbaar is, kan de master op kamertemperatuur worden bewaard gedurende enkele uren. De luchtbellen zullen uiteindelijk op eigen kracht verdwijnen. Als er geen heet plaatje beschikbaar is, zal het PDMS na 24 uur uitharden op kamertemperatuur.
Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de master tijdens het uithardingsproces vlak is. Zodra het PDMS op de master is uitgehard, wordt het naar een schone kap gebracht met behulp van een chirurgisch mes. Er wordt een cirkelsnede gemaakt rond de omtrek van de apparaten.
Het is belangrijk dat wanneer men het mes in het PDMS steekt om contact te maken met de siliciumwafer, er niet te veel druk op de wafer wordt uitgeoefend, anders zal de master barsten met een cirkelsnede helemaal rond de apparaten. Er zijn vier apparaten per elke drie inch siliciummaster. Het PDMS wordt voorzichtig van de master opgetild.
Dit kan worden gestart door voorzichtig het chirurgisch mes te draaien terwijl het in de vooraf gemaakte snede wordt gestoken. Het is erg dun met de PDMS-apparaten op de mal. Reservoirs met de zijde naar boven worden in het apparaat geboord met behulp van een acht millimeter weefselbiopsie-pons.
Het puin dat in de pons achterblijft, wordt eruit geduwd met een staaf. De apparaten worden vervolgens in vieren gesneden en overtollig PDMS wordt weggesneden, zodat het apparaat netjes op een Corning-deksel past. Glas nummer één, formaat 24 millimeter bij 40 millimeter stikstofluchtlucht, wordt gebruikt om eventueel overtollig puin weg te blazen.
Kopjespui kan ook worden verwijderd met behulp van 3M Scotch Brand 4 7 1 vinyltape. De schone apparaten zijn nu klaar voor plasma-binding. Een herrickplasmareiniger wordt gebruikt om de neuronapparaten kortstondig aan de deksels te hechten.
De apparaten en de deksels worden op een bak geplaatst en de bak wordt vervolgens in de plasmareiniger geplaatst en een vacuümpomp wordt gebruikt om lucht uit de kamer te verwijderen. Het is belangrijk op te merken dat de PDMS-apparaten met de zijde naar boven worden geplaatst. Dat wil zeggen met het ontwerp naar boven, zodat ze worden blootgesteld aan het plasmagas.
Overzicht
Deze video toont de techniek van zachte litografie met behulp van polydimethylsiloxaan (PDMS) om een microfluïdisch apparaat te fabriceren voor het kweken van neuronen. Het apparaat maakt compartimentalisering van neuronale cellichamen en axonen mogelijk, wat geavanceerde studies in de neurobiologie vergemakkelijkt.
Belangrijkste Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Microfluidica
- Celkweektechnieken
Achtergrond
- Het neuronapparaat werd voor het eerst gepubliceerd in Nature Methods in augustus 2005.
- Het is wereldwijd breed toegepast door onderzoekers.
- Het apparaat is gemaakt van PDMS dat op een siliciumwafer wordt gegoten.
- Het beschikt over reservoirs en kanalen die zijn ontworpen voor neuronale kweek.
Doel van Studie
- Om de fabricage van een microfluïdisch apparaat voor neuronkweek te demonstreren.
- Om de voordelen van het gebruik van dit apparaat ten opzichte van traditionele weefselkweekplatforms te benadrukken.
- Om een gedetailleerde methodologie te bieden voor het voorbereiden van het neuronapparaat.
Gebruikte Methoden
- PDMS mengen met een uitharder in een specifieke verhouding.
- Een vacuümdroger gebruiken om luchtbellen uit de PDMS te verwijderen.
- De PDMS uits harden op een hotplate of op kamertemperatuur.
- PDMS-apparaten via plasma-binding aan cover slips binden voor verbeterde functionaliteit.
Belangrijkste Resultaten
- Het apparaat maakt compartimentalisering van cellichamen en axonen mogelijk.
- Het maakt aparte behandelingen voor verschillende compartimenten mogelijk.
- Onderzoekers kunnen zuivere axonfracties verkrijgen voor studie.
- Het ontwerp vergemakkelijkt de observatie van axonregeneratie.
Conclusies
- Het microfluïdische neuronapparaat is een waardevol hulpmiddel voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Het biedt significante voordelen voor het bestuderen van neurongedrag en regeneratie.
- Het fabricageproces is gedetailleerd en reproduceerbaar voor onderzoekers.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Compartmentalized microfluidic platforms enable precise spatial control of neuronal subpopulations, supporting target validation in neurodegenerative disease models. By isolating soma and axon compartments, these systems facilitate mechanistic de-risking of therapeutic candidates through compartment-specific treatment and readout. This approach enhances predictive confidence in early discovery by reducing biological noise and improving assay specificity for axonal regeneration and neuroprotection studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating axonal and somal compartments for independent manipulation.
- Operational Value: Supports functional target validation through compartment-specific treatment and readout of axonal integrity.
- Predictive Value: Increases confidence in lead compounds by reducing confounding signals from cell bodies in axonal assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated neuronal systems for downstream compound screening with compartmentalized readouts.
- Operational Value: Standardizes axonal isolation and culture conditions, improving reproducibility across screening campaigns.
- Scalability: Facilitates platform reuse for multiple targets and therapeutic modalities in neuroscience discovery.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease-relevant neuronal architecture from discovery through preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Allows assessment of target engagement and pathway modulation in axons without somatic interference.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions based on axonal regeneration or degeneration phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
The microfluidic neuron device integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, enabling compartment-specific analysis at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating axonal responses to therapeutic perturbations.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative axonal readouts for reliable compound evaluation in neurodegeneration programs.
- Analytics: Generates compartment-specific measurements (e.g., axonal outgrowth, degeneration) that enable objective comparison of treatment conditions.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical continuity by preserving neuronal polarity and enabling biomarker-aligned axonal assays.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform across multiple projects, reducing redevelopment costs and ensuring consistent neuronal models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in axonal vs. somal responses.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability of neuronal compartmentalization assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality, capital efficiency, and reduces late-stage biological risk in neurodegeneration portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on compartment-specific efficacy and safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic design, PDMS handling, and sterile cell culture techniques.
- Depends on access to plasma cleaners, vacuum desiccators, and precision fabrication tools for master mold preparation.
- Necessitates cross-team standardization of fabrication protocols and quality control for device-to-device consistency.
- Involves adaptation considerations when extending to human iPSC-derived neurons or disease models with altered neurite dynamics.
- Includes practical limitations such as device fouling over long-term culture and the need for media maintenance to prevent channel bubbling.
