iClip - Transcriptome-breed in kaart brengen van eiwit-RNA Interacties met Individual Nucleotide resolutie
30 april 2011
De ruimtelijke ordening van RNA-bindende eiwitten op een transcript is een belangrijke determinant van post-transcriptionele regulatie. Daarom ontwikkelden we de individuele-nucleotide resolutie van UV-crosslinking en immunoprecipitatie (iClip) dat precieze genoom-brede kartering van de bindingsplaatsen van een RNA-bindend eiwit maakt.
Het algemene doel van het volgende experiment is om een transcriptoom brede kaart te verkrijgen van de bindingsplaatsen van een RNA-bindend eiwit met individuele nucleotideresolutie. Dit wordt bereikt door UV-bestraling van levende cellen om eiwitten en RNA in vivo covalent te cross-linken als een tweede stap. Het RNA-bindend eiwit wordt onder strenge omstandigheden immuno gezuiverd om de cross-linked RNA-fragmenten te herstellen.
Vervolgens genereert reverse transcriptie cDNA's die vaak truncateren op het bevestigde peptide, wat de informatie over de cross-link-positie binnen het RNA behoudt. Er worden resultaten verkregen die alle bindingsplaatsen binnen het transcriptoom laten zien op basis van high-throughput sequencing van de cDNA-bibliotheek. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in RNA-biologie, zoals hoe de interactie van verschillende RNA-bindende eiwitten de RNA-verwerking reguleert. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we zowel de prestaties als de resolutie van onze transcriptoom brede kaarten van eiwit-RNA-interacties verbeteren Om te beginnen met de procedure van UV cross-linking weefselkweekcellen.
Verwijder het medium van een 10 centimeter plaat van healercellen. Voeg zes milliliter ijskoud PBS toe en plaats de platen op ijs. Eén plaat is voldoende voor drie experimenten.
Verwijder het deksel en bestraal de cellen. Eenmaal op 254 nanometer met 150 millijoule per centimeter vierkant, oogst de cellen door ze met een cell lifter van de platen te schrapen. Breng twee milliliter celsuspensie over in elk van de drie microbuisjes om de cellen te pelleten. Draai ze 10 seconden op topsnelheid bij vier graden Celsius.
Verwijder vervolgens de supinate snap, bevries de celpellets op droogijs en bewaar ze tot gebruik op minus 80 graden Celsius. Voeg 100 microliter eiwit toe, een dynabead per experiment, aan een verse microbuis. Als u met muis- of geitenantilichamen werkt, gebruik dan eiwit G dynabeads.
Was de beadjes twee keer met lysisbuffer, die in het bijbehorende geschreven protocol te vinden is. Resuspendeer de beadjes in 100 microliter lysisbuffer met twee tot 10 microgram antilichaam. Draai de buis bij kamertemperatuur gedurende 30 tot 60 minuten.
Was vervolgens de beadjes drie keer met 900 microliter lysisbuffer en laat ze in de laatste was tot u klaar bent om door te gaan. Voor immunoprecipitatie Thor cel paleis op ijs. Resuspendeer in één milliliter lysisbuffer en breng het over naar een 1,5 milliliter microbuis.
Bereid een een op 500 verdunning van RNAs een voor. Voeg vervolgens 10 microliter samen met twee microliter turbo DNAs toe aan het cellysaat. Incubeer de monsters gedurende exact drie minuten bij 37 graden Celsius, schudden bij 1.100 rotaties per minuut, verplaats onmiddellijk naar ijs.
Spin vervolgens de monsters bij vier graden Celsius en 22.000 maal zwaartekracht gedurende 20 minuten om het lysaat te klaren. Verzamel voorzichtig de supernatant, waarbij ongeveer 50 microliter lysaat met het pellet wordt achtergelaten om de beadjes te immunoprecipiteren. Verwijder de wasbuffer en voeg vervolgens de bereide cellysaten toe. Draai de monsters twee uur bij vier graden Celsius.
Gooi de SUP-agent weg en was de beadjes twee keer met 900 microliter hoge zoutbuffer, die in het bijbehorende geschreven protocol te vinden is. Was vervolgens de beadjes twee keer met 900 microliter wasbuffer. Ga vervolgens verder met defosforylering en voeg een linker toe aan de RNA drie prime-uiteinden.
Om de RNA vijf prime-uiteinden te labelen, werk achter een plexiglas schild. Verwijder de supinate van de laatste was van de linkerligatiereactie en resuspendeer de beadjes in acht microliter hete PNK-mix. Incubeer gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius.
Verwijder de hete PNK-mix en reus. Suspendeer de beadjes in 20 microliter eenmaal nieuwe pagina laadbuffer. Incubeer vervolgens het monster op een thermomixer gedurende 10 minuten bij 70 graden Celsius.
Plaats het monster onmiddellijk op een magneet om de lege beadjes te precipiteren. Laad de monsters op een vier tot 12%nieuwe pagina. Biss-gel volgens de instructies van de fabrikant.
Laad ook vijf microliter van een voorgekleurde eiwitgroottemarkering. Laat de gel 50 minuten bij 180 volt lopen. Breng de eiwit-RNA-complexen over van de gel naar een nitrocellulosemembraan met behulp van de NOVA-natte overdrachtsapparatuur volgens de instructies van de fabrikant.
Na de overdracht, spoel het membraan in PBS-buffer. Wikkel het vervolgens in Saran-folie en stel het bloot aan film bij minus 80 graden Celsius. Voer belichtingen uit gedurende 30 minuten, een uur en een nacht.
Isoleer vervolgens het membraangebied volgens de eiwit-RNA-complexen van de lage RNA's. Experimenteer met de autoröntgenfoto als een masker. Herstel het RNA van het membraan met proteïnase K-digestie en fenol chloroform-extractie.
Reverse transcribeer het RNA met behulp van een van de AYP-primers om het cDNA te gel zuiveren. Meng zes microliter cDNA-monster met zes microliter twee keer TBE ureum-ladingbuffer. Vlak voor het laden van de monsters op een gel.
Verwarm de monsters gedurende drie minuten tot 80 graden Celsius. Laad vervolgens de monsters op een voorgevormde 6%TBE ureum-gel samen met een lage molecuulgewicht marker. Laat de gel gedurende 40 minuten bij 180 volt lopen zoals beschreven door de fabrikant, met behulp van de bovenste kleurstof en de markeringen op de plastic gelondersteuning om de uitsparing te begeleiden.
Snij drie banden bij 120 tot 200 nucleotiden, 85 tot 120 nucleotiden en 70 tot 85 nucleotiden. Merk op dat de arc lip-primer en de L drie-sequentie samen goed zijn voor 52 nucleotiden van de clipsequentie. Voeg 400 microliter te toe en breek de gelslice in kleine stukken.
Gebruik een spuitplunger van een milliliter en incubeer de gelstukken met schudden bij 1.100 rotaties per minuut gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Plaats twee een centimeter glazen voorfilters in een CoStar spinx-kolom. Breng de vloeibare portie van het monster over naar de kolom, dra
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het in kaart brengen van bindingsplaatsen van RNA-bindende eiwitten met een resolutie op individuele nucleotide, gebruikmakend van UV-crosslinking en immunoprecipitatie met resolutie op individuele nucleotide (iCLIP). De techniek verbetert het begrip van post-transcriptionele regulatie door nauwkeurige genomewijde gegevens te verschaffen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- RNA-biologie
- Post-transcriptionele regulatie
- Genomische mappingtechnieken
Achtergrond
- RNA-bindende eiwitten spelen een cruciale rol bij het reguleren van de RNA-verwerking.
- Het begrijpen van hun bindingsplaatsen is essentieel voor het ontrafelen van hun functies.
- Traditionele methoden missen de resolutie die nodig is voor nauwkeurige mapping.
- iCLIP biedt een oplossing door UV-crosslinking te combineren met high-throughput sequencing.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode om een transcriptoombrede kaart van interacties tussen RNA-bindende eiwitten te verkrijgen.
- Het verbeteren van de resolutie bij de identificatie van bindingsplaatsen.
- Het faciliteren van de studie naar mechanismen van RNA-processing.
Gebruikte methoden
- UV-bestraling van levende cellen om eiwitten en RNA te crosslinken.
- Immunoprecipitatie van gecrosslinkte RNA-fragmenten.
- Reverse transcriptie voor het genereren van cDNA's.
- High-throughput sequencing van cDNA-bibliotheken om bindingsplaatsen te identificeren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle mapping van bindingsplaatsen van RNA-bindende eiwitten over het hele transcriptoom.
- Demonstratie van de hoge resolutie en prestaties van de methode.
- Inzichten in de interactie van RNA-bindende eiwitten bij de RNA-verwerking.
Conclusies
- De iCLIP-methode verbetert het begrip van RNA-eiwitinteracties aanzienlijk.
- Deze techniek kan worden toegepast op diverse studies naar RNA-biologie.
- Toekomstig onderzoek kan deze methode benutten om complexe RNA-regulerende netwerken te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Precieze mapping van interacties van RNA-bindende eiwitten op nucleotide-resolutie maakt mechanische risicoanalyse van post-transcriptionele regulatoire targets mogelijk tijdens de vroege ontdekkingsfase. iCLIP levert kwantitatieve, transcriptome-brede bindingsgegevens die targetvalidatie en assay-ontwikkeling ondersteunen door functionele RNA-eiwit-interfaces met hoge specificiteit te definiëren. Deze mogelijkheid verbetert het voorspellend vertrouwen bij de identificatie van lead-verbindingen en vermindert biologische ambiguïteit in RNA-gecentreerde therapeutische programma's.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door het definiëren van nauwkeurige interactieplaatsen van RNA-bindende eiwitten over het gehele transcriptoom.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door directe meting van target-engagement in native cellulaire contexten.
- Voorspellende waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van het target door bindingsplaatsen op resolutie van individuele nucleotiden te bepalen, waardoor vals-positieven door indirecte associaties worden verminderd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde, kwantitatieve bindingsprofielen die geschikt zijn voor assay-benchmarking en compound-screening readiness.
- Operationele waarde: Produceert reproduceerbare cDNA-bibliotheken met gedefinieerde cross-linklocaties, wat schaalbare hergebruik van het platform mogelijk maakt voor verschillende RNA-bindende eiwit-targets.
- Assay-gereedheid: Faciliteert de voorbereiding van gevalideerde biologische systemen voor downstream evaluatie van modulatoren die RNA-proteïne-interacties beïnvloeden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt ziekterelateerde systeemmodellering door de dynamiek van RNA-bindende eiwitten in pathofysiologische contexten in kaart te brengen.
- Operationele waarde: Maakt translationele biomarker-afstemming mogelijk door de bezettingsgraad van bindingsplaatsen te correleren met functionele uitkomsten van RNA-verwerking.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Informeert preklinische continuïteit door mechanistische inzichten te verschaffen in RNA-regulatieve netwerken die worden beïnvloed door lead-verbindingen.
Integratie van pipeline en workflow
iCLIP integreert in het continuüm van ontdekkingen, van het testen van doelhypothesen via lead-identificatie tot preklinische validatie, door hoogresolutie bindingskaarten te leveren die elke fase informeren.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en padverduidelijking door directe RNA-bindende eiwitinteracties met nucleotideprecisie op te lossen.
- Screening: Levert assay-klare, kwantitatieve bindingsgegevens die betrouwbare evaluatie van verbindingen en modellering van structuur-activiteitsrelaties mogelijk maken.
- Analytica: Biedt meetbare outputs, waaronder cross-site frequentie, verrijking van bindingsmotieven en positionele resolutie voor comparatieve conditieanalyse.
- Translationeel onderzoek: Verbindt ontdekkingsbevindingen met preklinische continuïteit via biomarker-afgestemde bindingssite-dynamiek in ziektemodellen.
- Bedrijfsbrede hergebruikbaarheid: Fungeert als een herbruikbare capaciteit voor het profileren van diverse RNA-bindende eiwitdoelen over verschillende therapeutische gebieden en doelwitklassen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit in RNA-regulatier mechanisms.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van transcriptome-wide bindingassays over verschillende laboratoria heen.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go beslissingen, kapitaalefficiëntie bij de prioritering van targets en verminderd biologisch risico in een laat stadium bij RNA-gerichte programma's.
- Impact op portfolio: Risicogecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van directe, hoge-resolutie gegevens over target-engagement.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in RNA-biologie, immunoprecipitatie en de preparatie van libraries voor next-generation sequencing.
- Is afhankelijk van UV-crosslinking-infrastructuur, mogelijkheden voor stringente wasstappen en sequencingplatformen met een hoge gevoeligheid.
- Maakt cross-team standaardisatie van crosslinking-condities, antilichaamvalidatie en bio-informatica-pipelines voor cross-site detectie noodzakelijk.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij variërende abundanties van RNA-bindende eiwitten, crosslinking-efficiënties en contexten van subcellulaire lokalisatie.
- Bevat praktische beperkingen zoals vereisten voor de RNA-input, variabiliteit in crosslinking-efficiëntie en bio-informatica-complexiteit bij cross-site identificatie.
Veelgestelde vragen over Biofarma
Chapters in this video
0:05
Title
1:19
UV Cross-linking of Tissue Culture Cells
2:10
Bead Preparation
2:53
Cell Lysis and Partial RNA Digestion
3:47
Immunoprecipitation
4:26
RNA 5' End Labelling
5:08
SDS-PAGE and Membrane Transfer
6:27
Gel Purification of cDNA
8:44
Representative Results
10:00
Conclusion
