iClip - Transcriptome-breed in kaart brengen van eiwit-RNA Interacties met Individual Nucleotide resolutie

Het algemene doel van het volgende experiment is om een transcriptoombrede kaart te verkrijgen van de bindingsplaatsen van een RNA-bindend eiwit met een resolutie op individueel nucleotide-niveau. Dit wordt bereikt door levende cellen te bestralen met UV-licht om eiwitten en RNA in vivo covalent te crosslinken als tweede stap. Het RNA-bindende eiwit wordt onder stringente condities geïmmunopurificeerd om de gecrosslinkte RNA-fragmenten terug te winnen.

De volgende reverse transcriptie genereert cDNA's die vaak worden afgebroken bij het aangehechte peptide, waardoor de informatie over de positie van de cross-link binnen het RNA behouden blijft. Er worden resultaten verkregen die alle bindingsplaatsen binnen het transcriptoom tonen op basis van high-throughput sequencing van de cDNA-bibliotheek. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de RNA-biologie, zoals hoe de interactie tussen verschillende RNA-bindende eiwitten de RNA-verwerking reguleert. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we zowel de prestaties als de resolutie van onze transcriptoombrede kaarten van eiwit-RNA-interacties verhogen. Om te beginnen met de procedure voor UV-cross-linking van weefselkweekcellen.

Verwijder het medium uit een plaat van 10 centimeter met healer-cellen. Voeg zes milliliters ijskoude PBS toe en plaats de platen op ijs. Eén plaat is voldoende voor drie experimenten.

Verwijder het deksel en bestraal de cellen. Zet de golflengte op 254 nanometers met 150 millijoules per centimeter squared en oogst de cellen door ze met een cell lifter van de platen af te schrapen. Breng twee milliliters van de cel-suspensie over naar elk van de drie microtubes om de cellen te pelletiseren. Centrifugeer ze op maximale snelheid gedurende 10 seconden bij vier graden Celsius.

Verwijder vervolgens de supernatant-snap, vries de celpellets in op droog ijs en bewaar deze bij minus 80 °C tot gebruik. Voeg 100 µL eiwit-DynaBeads per experiment toe aan een schone microcentrifugebuis. Gebruik bij het werken met muis- of geitenantilichamen Protein G DynaBeads.

Was de beads twee keer met lysisbuffer, zoals beschreven in het bijbehorende geschreven protocol. Resuspendeer de beads in 100 µL lysisbuffer met twee tot 10 µg antilichaam. Roteer de buis gedurende 30 tot 60 minuten bij kamertemperatuur.

Was de kraaltjes vervolgens drie keer met 900 µL lysisbuffer en laat ze in de laatste wasstap staan tot u klaar bent om verder te gaan. Voor immunoprecipitatie van Thor-cellen op ijs: resuspendeer in 1 mL lysisbuffer en breng dit over naar een 1,5 mL microcentrifugebuisje.

Bereid een 1:500 verdunning van RNAse one voor. Voeg vervolgens 10 µL samen met twee µL turbo DNAse toe aan het cellysaat. Incubeer de monsters precies drie minuten bij 37 °C, terwijl ze worden geschud met 1.100 rpm, en breng ze direct over naar ijs.

Centrifuge de monsters vervolgens bij vier graden Celsius en 22 000 ×g gedurende 20 minuten om het lysaat te klaren. Verzamel het supernatant zorgvuldig, waarbij ongeveer 50 µL lysaat bij het pellet wordt achtergelaten. Verwijder de wasbuffer en voeg vervolgens de voorbereide cellysaten toe. Laat de monsters twee uur roteren bij vier graden Celsius.

Verrwijder het SUP-agens en was de kraaltjes twee keer met 900 microliters high salt buffer, die in het bijbehorende geschreven protocol te vinden is. Was de kraaltjes tot slot twee keer met 900 microliters wasbuffer. Ga vervolgens over tot het defosforyleren en het toevoegen van een linker aan de RNA 3'-uiteinden.

Om de RNA-vijfprimeinde te labelen, werkend achter een plexiglas scherm. Verwijder het supernatant van de laatste wasstap van de linkerligatiereactie en resuspendeer de beads in 8 µL warme PNK-mix. Incubeer gedurende vijf minuten bij 37 °C.

Verwijder de warme PNK-mix en gebruik deze opnieuw. Suspendeer de beads in 20 µL van een eenvoudige nieuwe paginalaadbuffer. Incubeer het monster vervolgens op een thermomixer bij 70 °C gedurende 10 minuten.

Plaats het monster onmiddellijk op een magneet om de lege beads neer te slaan. Laad de monsters op een 4 tot 12% nieuwe page-biss gel volgens de instructies van de fabrikant.

Laad daarnaast vijf µL van een vooraf gekleurde eiwitmarkering. Laat de gel 50 minuten lopen bij 180 volt. Transfer de eiwit-RNA-complexen van de gel naar een nitrocellulosemembraan met behulp van het NOVA wet transfer-apparaat volgens de instructies van de fabrikant.

Spoel na de transfer het membraan af met PBS-buffer. Wikkel het vervolgens in Saranwrap en stel het bloot aan film bij minus 80 °C. Voer belichtingen uit gedurende 30 minuten, één uur en een nacht.

Isoleer vervolgens de membraanregio op basis van de eiwit-RNA-complexen uit de RNA-arme fracties. Voer het experiment uit met de autoradiografie als masker. Win het RNA uit het membraan terug middels digestie met proteinase K en fenol-chloroformextractie.

Transcriptie van het RNA terug naar cDNA met behulp van een van de AYP-primers om het cDNA via een gel te zuiveren. Meng zes µL van het cDNA-monster met zes µL van een 2x TBE-ureumlaadbuffer, vlak voordat de monsters op een gel worden geladen.

Verhit de monsters drie minuten lang tot 80 °C. Laad de monsters vervolgens op een gegoten 6%TBE urea-gel, samen met een marker voor laag molecuulgewicht. Laat de gel 40 minuten lopen bij 180 volt, zoals beschreven door de fabrikant, waarbij de bovenste kleurstof en de markeringen op de plastic gelondersteuning als leidraad voor de excisie dienen.

Snijd drie banden uit op 120 tot 200 nucleotiden, 85 tot 120 nucleotiden en 70 tot 85 nucleotiden. Let op dat de arc lip-primer en de L drie-sequentie samen verantwoordelijk zijn voor 52 nucleotiden van de clip-sequentie. Voeg 400 µL te toe en vermalen de gel-fragmenten tot kleine stukjes.

Incubeer de gelstukjes met behulp van de zuiger van een spuit van 1 mL onder schudden bij 1.100 omwentelingen per minuut gedurende twee uur bij 37 °C. Plaats twee glazen voorfilters van 1 cm in een CoStar spinx-kolom. Breng het vloeibare deel van het monster over naar de kolom en centrifugeer één minuut bij 13.000 omwentelingen per minuut in een buisje van 1,5 mL.

Voeg 0,5 µL glyco blue en 40 µL natriumacetaat pH 5,5 toe. Meng vervolgens het monster. Voeg één milliliter 100%ethanol toe.

Meng opnieuw en laat het monster gedurende de nacht neerslaan bij -20 °C. Circulariseer vervolgens de CD NA-moleculen om de adaptorregio aan het 5'-uiteinde te binden. Lineariseer daarna opnieuw en voer PCR-amplificatie uit volgens het bijgevoegde schriftelijke protocol voorafgaand aan de sequencing van de eye clip-bibliotheek; het succes van het experiment kan in twee stappen worden gemonitord.

Het autoradiogram van het eiwit-RNA-complex na membraanoverdracht en de gelafbeelding van de PCR-producten; in het autoradiogram van de monsters met een laag RNA-gehalte moet diffuse radioactiviteit zichtbaar zijn boven het molecuulgewicht van het eiwit voor monsters met een hoog RNA-gehalte. Deze radioactiviteit is meer geconcentreerd nabij het molecuulgewicht van het eiwit. Wanneer er geen antilichaam wordt gebruikt bij de immunoprecipitatie, mag er geen signaal worden gedetecteerd.

Verdere belangrijke controles voor de specificiteit van de immunoprecipitatie omvatten het weglaten van UV-bestraling of het gebruik van cellen die het eiwit van belang niet tot expressie brengen. De gelafbeelding van de PCR-producten moet een groottebereik laten zien dat overeenkomt met de cDNA-fractie. Houd er rekening mee dat de PCR-primers, P three Celexa en P five Celexa, 76 nucleotides toevoegen aan de grootte van het cDNA. Als er geen antilichaam wordt gebruikt tijdens de immunoprecipitatie, mag er geen overeenkomstig PCR-product worden gedetecteerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat elk van de 64 stappen cruciaal is en met honderd procent nauwkeurigheid moet worden uitgevoerd. ICL-gegevens kunnen computationeel worden geïntegreerd met transcriptoombrede functionele assays. Dit kan, bijvoorbeeld, inzicht bieden in de positieafhankelijke regulatie van RNA-processing.

Voor de computationele data-analyse verwijzen wij graag naar onze recente publicaties in samenwerking met het Nicholas KA European Bioinformatics Institute en bla zupan aan de University of Liana. En nu is het tijd dat u begint met uw eigen experimenten. Veel succes.