Name: iClip - Transcriptome-breed in kaart brengen van eiwit-RNA Interacties met Individual Nucleotide resolutie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Leer iCLIP voor transcriptoom-brede mapping van eiwit-RNA-interacties met individuele nucleotide-resolutie. Deze methode combineert UV-crosslinking met immunoprecipitatie en high-throughput sequencing.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken alle leden van de Ule, Luscombe en Zupan laboratoria voor discussie en experimentele ondersteuning. Wij danken James Hadfield en Nik Matthews voor high-throughput sequencing. Wij willen er graag op wijzen dat de iClip hier beschreven methode deelt een aantal stappen met de originele CLIP protocol, ontwikkeld door Kirk Jensen en JU in het laboratorium van Robert Darnell. Dit werk werd ondersteund door de European Research Council subsidie ​​206.726-CLIP om JU en een lange-termijn Human Frontiers Science Program fellowship aan JK

1. UV verknoping van weefselcultuurcellen <ol><li> Verwijder de media en voeg 6 ml ijskoude PBS aan cellen gekweekt in een 10 cm plaat (genoeg voor drie experimenten). </li><li> Verwijder het deksel en plaats op ijs. Bestralen een keer met 150 mJ / cm 2 bij 254 nm. </li><li> Oogst de cellen door schrapen met een cel lifter. </li><li> Breng 2 ml celsuspensie aan elk van de drie microbuisjes. Draaien op topsnelheid voor 10 sec bij 4 ° C tot pellet cellen, verwijder supernatant. </li><li> Snap-vries de cel pellets op droog ijs en bewaar bij -80 ° C tot gebruik. </li></ol> 2. Bead voorbereiding <ol><li> Voeg 100 ul van proteïne A Dynabeads (Dynal, 100,02) per experiment een nieuwe microbuisjes (Gebruik proteïne G Dynabeads voor een muis of een geit antilichamen). </li><li> Was kralen 2x met lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS; 0,5% natriumdeoxycholaat; honderdste proteaseremmer cocktail III, Calbiochem). </li><li> Resuspendeer kralen in 100 ul lysisbuffer met 2-10 ug antilichaam. </li><li> Draai buizen bij kamertemperatuur gedurende 30-60 minuten. </li><li> Was 3x met 900 ul lysis buffer en laat in de laatste wasbeurt tot klaar om verder te gaan 4,1 stap. </li></ol> 3. Cellysis en gedeeltelijke RNA spijsvertering <ol><li> Resuspendeer de celpellet in 1 ml lysis buffer en transfer naar 1,5 ml microbuisjes. </li><li> Bereid een 1 / 500 verdunning van RNase I (Ambion, AM2295). Voeg 10 pi RNase ik verwatering evenals 2 pi Turbo DNase de cel lysaat (1 / 500 RNase ik verdunningen [lage RNase] worden gebruikt voor bibliotheken voorbereiding; 1 / 50 verdunning [hoge RNase] nodig zijn om de controle voor de antilichaamspecificiteit) . </li><li> Incubeer de monsters voor exact 3 min bij 37 ° C, schudden bij 1.100 tpm. Onmiddellijk over te dragen aan ijs. </li><li> Spin bij 4 ° C en 22.000 g gedurende 20 minuten aan het lysaat te wissen. Zorgvuldig verzamelen supernatant (laat ongeveer 50 ui lysaat met de pellet). </li></ol> 4. Immunoprecipitatie <ol><li> Verwijder de wasbuffer van de kralen (uit stap 2.5) en voeg vervolgens de cel lysaat (vanaf stap 3.4). </li><li> Draai de monsters gedurende 2 uur bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant en was de kralen 2x met 900 ul high-zout-buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS; 0,5% natriumdeoxycholaat). </li><li> Was 2x met 900 ul wasbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl2, 0,2% Tween-20). </li></ol> 5. Defosforylatie van RNA 3'ends <ol><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de parels in 20 pl PNK mix (15 ul water; 4 il 5x PNK pH 6,5 buffer [350mMTris-HCl, pH 6,5; 50mMMgCl 2 25mMdithiothreitol]; 0,5 ul PNK enzym; 0,5 ul RNasin [Promega]). </li><li> Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C. </li><li> Voeg 500 ul wasbuffer en was 1x met een hoge-zout buffer. </li><li> Was 2x met wasbuffer. </li></ol> 6. Linker ligatie naar 3 'uiteinden RNA <ol><li> Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer de parels in 20 pl ligatie mix (9 ul water; 4 pi 4x ligatiebuffer [200 mMTris-HCl; 40m MM GCL 2, 40 mM dithiothreitol]; een ul RNA-ligase [NEB]; 0,5 ul RNasin [Promega]; 1,5 ul pre-adenylated linker L3 [20 uM]; 4 ul PEG400 [81170, Sigma]). </li><li> Incubeer overnacht bij 16 ° C. </li><li> Voeg 500 ul wasbuffer en dan 2x wassen met 1 ml high-zout buffer. </li><li> Was 2x met 1 ml wasbuffer en laat in 1 ml van het tweede wassen. </li></ol> 7. RNA 5 'uiteinde etikettering <ol><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de kralen in 8 pl van hot PNK mix (0,4 ul PNK [NEB]; 0,8 ul 32 P-γ-ATP; 0,8 pl 10x PNK buffer [NEB]; 6 ul water). </li><li> Incubeer 5 minuten bij 37 ° C. </li><li> Verwijder de hete PNK mix en resuspendeer de parels in 20 pl 1x Nupage laadbuffer (Invitrogen). </li><li> Incubeer op een Thermomixer bij 70 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Direct plaats op een magneet voor het neerslaan van de lege kralen en het supernatant belasting op de gel (zie stap 8). </li></ol> 8. SDS-PAGE en membraan overdracht <ol><li> Laad de monsters op een 4-12% NuPAGE Bis-Tris Gel (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik 0,5 l 1x MOPS lopen buffer (Invitrogen). Ook laden 5 ul van een pre-gekleurde eiwit size marker (bijvoorbeeld PAGE heerser plus, Fermentas, SM1811). </li><li> Laat de gel gedurende 50 minuten op 180 V. </li><li> Verwijder de gel voor-en gooi als vast afval (bevat gratis radioactief ATP). </li><li> Breng de eiwit-RNA-complexen van de gel tot een nitrocellulose membraan met behulp van de Novex natte overdracht inrichting volgens de instructies van de fabrikant (Invitrogen, overdracht 1 uur bij 30 V). </li><li> Na de overdracht, het membraan in PBS-buffer spoelen, dan wikkel het in Saran Wrap en blootstellen aan een Fuji film bij -80 ° C (plaats een fluorescerende sticker naast het membraan om later af te stemmen thij film en het membraan, uit te voeren blootstelling gedurende 30 minuten, 1 uur en 's nachts). </li></ol> 9. RNA-isolatie <ol><li> Isoleer de eiwit-RNA-complexen van de lage-RNase experiment met de autoradiogram uit stap 8.5 als een masker. Snijd dit stukje membraan in verschillende dunne plakjes en leg ze in een 1,5 ml microbuisjes. </li><li> Voeg 200 ul PK buffer (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA) en 10 ul proteinase K (Roche, 03115828001) om het membraan stukken. Incubeer schudden bij 1100 rpm gedurende 20 min bij 37 ° C. </li><li> Voeg 200 ul van PKurea buffer (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA; 7 M ureum) en voor 20 min bij 37 ° C. incubeer </li><li> Verzamel de oplossing en voeg deze samen met 400 ul van RNA fenol / chloroform (Ambion, 9722) om een ​​2 ml Phase Lock Gel Heavy buis (713 tot 2536, VWR). </li><li> Incubeer 5 min bij 30 ° C, schudden bij 1.100 tpm. Scheid de fasen door het draaien gedurende 5 minuten bij 13.000 rpm bij kamertemperatuur. </li><li> Breng de waterlaag in een nieuwe buis (pas op voor de gel contact met de pipet). Voeg 0,5 ul glycoblue (Ambion, 9510) en 40 pi 3 M natriumacetaat pH 5,5 en meng. Voeg vervolgens 1 ml 100% ethanol, meng opnieuw en neerslag gedurende de nacht bij -20 ° C. </li></ol> 10. Reverse transcriptie <ol><li> Spin gedurende 20 min bij 15000 rpm en 4 ° C. Verwijder het supernatant en was de pellet met 0,5 ml 80% ethanol. </li><li> Resuspendeer de pellet in 7,25 ul RNA / primer mix (6,25 ul water; 0,5 ul Rclip primer [0.5pmol/μl]; 0,5 ul dNTP mix [10 mM]). Voor elk experiment of te repliceren, gebruik een andere Rclip primer met individuele barcode sequenties (zie 14). </li><li> Incubeer 5 minuten bij 70 ° C te koelen tot 25 ° C. </li><li> Voeg 2,75 ul RT mix (2 pi 5x RT buffer; 0,5 ul 0,1 M DTT, 0,25 ul Superscript III reverse transcriptase [Invitrogen]). </li><li> Incubeer 5 min bij 25 ° C, 20 min bij 42 ° C, 40 min bij 50 ° C en 5 minuten bij 80 ° C te koelen tot 4 ° C. </li><li> Voeg 90 ul TE-buffer, 0,5 ul glycoblue en 10 pl natriumacetaat pH 5,5 en meng. Voeg vervolgens 250 ul 100% ethanol, meng opnieuw en neerslag gedurende de nacht bij -20 ° C. </li></ol> 11. Gel zuivering van cDNA <ol><li> Spin down en was de monsters (zie 10.1), dan resuspendeer de pellets in 6 pi van water. </li><li> Voeg 6 pl 2x TBE-ureum laadbuffer (Invitrogen). Warmte monsters tot 80 ° C gedurende 3 minuten direct voor het laden. </li><li> Laad de monsters op een prefab 6% TBE-ureum gel (Invitrogen) en een looptijd van 40 minuten op 180 V, zoals beschreven door de fabrikant. Ook laden een laag moleculair gewicht marker voor latere snijden (zie hieronder). </li><li> Snijd drie bands op 120 tot 200 nt (hoog), 85-120 nt (medium) en 70-85 nt (laag). Gebruik theupper kleurstof en de markeringen op de plastic gel steun aan excisie gids (zie figuur 3). Merk op dat de Rclip primer en de L3 volgorde zijn samen goed voor 52 nt van de CLIP-reeks. </li><li> Voeg 400 ul TE en plet de gel plak in kleine stukjes met behulp van een 1 ml spuit zuiger. Incubeer schudden bij 1100 rpm gedurende 2 uur bij 37 ° C. </li><li> Plaats twee 1 cm glas pre-filters (Whatman, 1.823.010) in een Costar Sphinx kolom (Corning Incorporated, 8161). Breng de vloeibare deel van het monster op de kolom. Spin voor een min bij 13000 rpm in een 1.5 ml buis. </li><li> Voeg 0,5 il glycoblue en 40 pi natriumacetaat pH 5,5, en meng het monster. Voeg 1 ml 100% ethanol, meng opnieuw en neerslag gedurende de nacht bij -20 ° C. </li></ol> 12. Ligatie van primer aan het 5'-uiteinde van het cDNA <ol><li> Spin down en was de monsters (zie 10.1), dan resuspendeer de pellets in 8 pi ligatie mix (6,5 ul water; 0,8 pl 10x CircLigase Buffer II; 0,4 ul 50 mM MnCl 2, 0,3 ui, Circligase II [Epicentre]) en incubeer gedurende 1 uur bij 60 ° C. </li><li> Voeg 30 ul oligo gloeien mix (26 ul water; 3 pl FastDigest Buffer [Fermentas]; 1 pi cut_oligo [10 uM]). Incubeer gedurende 1 min op 95 ° C. Vervolgens de temperatuur te verlagen om de 20 seconden met 1 ° C tot 25 ° C worden bereikt. </li><li> Voeg 2 pl BamHI (Fast Fermentas) en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C. </li><li> Voeg 50 ul TE en 0,5 pl glycoblue en meng. Voeg 10 ul natriumacetaat pH 5,5 en mix, voeg 250 ul 100% ethanol. Meng opnieuw en neerslag gedurende de nacht bij -20 ° C. </li></ol> 13. PCR-amplificatie <ol><li> Spin down en was de monsters (zie 10.1), dan resuspendeer de pellet in 19 ul water. </li><li> Bereid de PCR-mix (19 ul cDNA, 1 ui primer mix P5/P3 Solexa, 10 pM elk; 20 ul Accuprime Supermix een enzym [Invitrogen]). </li><li> Voer de volgende PCR-programma: 94 ° C gedurende 2 minuten, [94 ° C gedurende 15 sec, 65 ° C gedurende 30 sec, 68 ° C gedurende 30 sec] 25-35 cycli, 68 ° C gedurende 3 min, 4 ° C voor altijd. </li><li> Mix 8 ul PCR-product met 2 pi van 5x TBE laadbuffer en de belasting op een prefab 6% TBE gel (InvitRogen). Vlekken op de gel met Sybrgreen I (Invitrogen) en te analyseren met een gel imager. </li><li> De barcode op de Rclip primers laten multiplex verschillende monsters vóór het indienen van voor high throughput sequencing. Submit 15 ul van de bibliotheek voor sequencing en sla de rest. </li></ol> 14. Linker en primer sequenties Pre-adenylated 3 'linker DNA: [We bestellen het DNA-adapter van IDT en vervolgens fracties van 20μM.] <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig0.jpg" alt="DNA" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="DNA"> 15. Representatieve resultaten: Voorafgaand aan de opeenvolging van de iClip bibliotheek, kan het succes van het experiment te worden gecontroleerd op twee stappen: het autoradiogram van het eiwit-RNA-complex na het membraan transfer (stap 8.5) en de gel imago van de PCR-producten (stap 13.4). In de autoradiogram van de lage-RNase monsters moeten diffuse radioactiviteit te zien boven het molecuulgewicht van het eiwit (figuur 2, monster 4). Voor high-RNase samples, is deze radioactiviteit dichter bij het molecuulgewicht van het eiwit (figuur 2, voorbeeld 3) gericht. Als er geen antilichaam wordt gebruikt in de immunoprecipitatie, zou er geen signaal worden gedetecteerd (Figuur 2, monsters 1 en 2). Andere belangrijke controles voor de specificiteit van de immunoprecipitatie of weglaten UV-straling of gebruik cellen die niet uitdrukken het eiwit van belang 14. De gel beeld van de PCR-producten (stap 13.4) moet tonen een groot bereik dat overeenkomt met het cDNA fractie (hoog, gemiddeld of laag) gezuiverd in stap 11.4 (figuur 4, lanen 4-6). Merk op dat de PCR-primers P3Solexa en P5Solexa een extra 76 nt kennis maken met de grootte van de cDNA. Als er geen antilichaam wordt gebruikt tijdens de immunoprecipitatie, mag geen overeenkomstige PCR-producten worden gedetecteerd (Figuur 4, lanen 1-3). Primer dimeer product kan verschijnen op ongeveer 140 nt. Voor representatieve resultaten van high-throughput sequencing en de daarop volgende bioinformatica analyses zie 14. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Schematische weergave van de iClip protocol. Eiwit-RNA complexen covalent verknoopt in vivo met behulp van UV-bestraling (stap 1). Het eiwit van belang is samen gezuiverd met het gebonden RNA (stappen 2-5). Te zorgen voor sequentie-specifieke priming van de reverse transcriptie, is een RNA-adapter geligeerd aan het 3 'uiteinde van het RNA, terwijl het 5' einde is radioactief gelabeld (stappen 6 en 7). Cross-linked eiwit-RNA-complexen zijn gezuiverd van de gratis RNA met behulp van SDS-PAGE en membraan transfer (stap 8). Het RNA wordt teruggewonnen uit het membraan door het verteren van het eiwit met proteinase K het verlaten van een polypeptide blijven bij de cross-link nucleotide (stap 9). Reverse transcriptie (RT) afgekapt bij de resterende polypeptide en introduceert twee splitsbaar adapter regio's en barcode sequenties (stap 10). Maat selectie verwijdert gratis RT-primer voor circularization. De volgende linearisatie genereert geschikt voor de PCR-amplificatie (stap 11-15). Tot slot, high-throughput sequencing genereert leest waarin de barcode sequenties onmiddellijk gevolgd door de laatste nucleotide van het cDNA (stap 16). Aangezien dit nucleotide lokaliseert een positie stroomopwaarts van de cross-linked nucleotide, kan de bindingsplaats worden afgeleid met een hoge resolutie. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Autoradiogram van cross-linked hnRNP C-RNA complexen met behulp van denaturerende gelelektroforese en membraan overdracht. hnRNP C-RNA complexen werden immuno-gezuiverd van cel extracten met behulp van een antilichaam tegen hnRNP C (α hnRNP C, monsters 3 en 4). RNA werd gedeeltelijk verteerd met behulp van een laag (+) of hoge (+ +) concentratie van RNase. Complexen verschuiving naar boven van de grootte van het eiwit (40 kDa) kan worden waargenomen (voorbeeld 4). De verschuiving is minder uitgesproken bij hoge concentraties van RNase werden gebruikt (voorbeeld 3). Het radioactieve signaal verdwijnt wanneer er geen antilichaam werd gebruikt in de immunoprecipitatie (monsters 1 en 2). <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Schematische 6% TBE-ureum gel (Invitrogen) om de excisie van iClip cDNA-producten gids. De gel wordt gerund gedurende 40 minuten op 180 V leidt tot een reproduceerbare migratiepatroon van cDNA's en kleurstoffen (licht en donker blauw) in de gel. Gebruik een scheermesje te snijden (rode lijn) de hoge (H), medium (M) en laag (L) cDNA fracties. Begin met het snijden in het midden van de licht blauwe kleurstof en vlak boven de markering op de plastic gel cassette. Verdeel het medium en de lage fracties en trim de hoge fractie ongeveer 1 cm boven de licht blauwe kleurstof. Gebruik verticaal snijdt laten leiden door de zakken en de kleurstof om de verschillende rijstroken (in dit voorbeeld 1-4) te scheiden. De marker baan (m) kan worden gekleurd en afgebeeld onder controlematen na het snijden. Fragment maten zijn aangegeven op de rechterkant. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Analyse van PCR-geamplificeerd iClip cDNA-bibliotheken met behulp van gelelektroforese. RNA hersteld van het membraan (figuur 1) was omgekeerd getranscribeerd en de grootte-gezuiverd met behulp van denaturerende gelelektroforese (figuur 2). Drie grootte fracties van cDNA (hoge [H]: 120 tot 200 nt, medium [M]: 85 tot 120 nt en lage [L]: 70-85 nt) teruggevonden, circularized, re-gelineariseerde en PCR-geamplificeerd. PCR-producten van verschillende grootte distributie kan worden waargenomen als gevolg van de verschillende maten van de input fracties. Omdat de PCR-primer introduceert 76 nt aan het cDNA, moeten grootte variëren tussen de 196 tot 276 nt voor hoge, 161-196 nt voor middelgrote en 146-161 nt voor de geringe omvang fracties. PCR-producten afwezig zijn wanneer er geen antilichaam werd gebruikt voor de immunoprecipitatie (lanen 1-3).

<ol><li>Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+regulons%3A+coordination+of+post-transcriptional+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA regulons: coordination of post-transcriptional events.</a> Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).</li>
<li>Wang, Z., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+regulation%3A+from+a+parts+list+of+regulatory+elements+to+an+integrated+splicing+code%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code.</a> RNA. 14, 802-813 (2008).</li>
<li>Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+right+RNA%3A+identification+of+cellular+mRNA+substrates+for+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins.</a> RNA. 5, 1071-1082 (1999).</li>
<li>Brooks, S. A., Rigby, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+mRNA+ligands+bound+by+the+RNA+binding+protein+hnRNP+A2+utilizing+a+novel+in+vivo+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of the mRNA ligands bound by the RNA binding protein hnRNP A2 utilizing a novel in vivo technique.</a> Nucleic Acids Res. 28, E49-E49 (2000).</li>
<li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proc Natl Acad Sci. 97, 14085-14090 (2000).</li>
<li>Mili, S., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+reassociation+of+RNA-binding+proteins+after+cell+lysis%3A+implications+for+the+interpretation+of+immunoprecipitation+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses.</a> RNA. 10, 1692-1694 (2004).</li>
<li>Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302, 1212-1215 (2003).</li>
<li>Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP%3A+A+method+for+identifying+protein-RNA+interaction+sites+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">CLIP: A method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells.</a> Methods. 37, 376-386 (2005).</li>
<li>Licatalosi, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456, 464-469 (2008).</li>
<li>Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA+code+for+the+FOX2+splicing+regulator+revealed+by+mapping+RNA-protein+interactions+in+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 130-137 (2009).</li>
<li>Urlaub, H., Hartmuth, K., Lührmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-tracked+approach+to+analyze+RNA-protein+crosslinking+sites+in+native%2C+nonlabeled+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A two-tracked approach to analyze RNA-protein crosslinking sites in native, nonlabeled small nuclear ribonucleoprotein particles.</a> Methods. 26, 170-181 (2002).</li>
<li>König, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP+reveals+the+function+of+hnRNP+particles+in+splicing+at+individual+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution.</a> Nat Struct Mol Biol. 17, 909-915 (2010).</li>
</ol>

Sinds de iClip protocol bevat een breed scala van enzymatische reacties en zuivering stappen, is het niet altijd gemakkelijk te identificeren een probleem wanneer een experiment mislukt. Met het oog op controle voor de specificiteit van geïdentificeerde RNA cross-link plaatsen, moeten een of meer negatieve controles worden gehandhaafd gedurende de gehele experiment en de daaropvolgende computationele analyses. Deze controles kunnen de no-antilichaam monster, de niet-cross-linked cellen, of immunoprecipitatie van knockout cellen of weefsel. Idealiter moeten deze controle-experimenten niet zuiveren geen eiwit-RNA-complexen, en daarom moet er geen signaal op de SDS-PAGE gel, en geen waarneembare producten na PCR-amplificatie te geven. High-throughput sequencing van deze controle bibliotheken moeten terugkeren weinig unieke sequenties. Knockdown cellen worden niet aanbevolen als een sequencing controle, omdat de resulterende sequenties nog overeen om cross-link plaatsen van hetzelfde eiwit, dat is gezuiverd van knockdown cellen in kleinere hoeveelheden. Voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om besmetting met PCR-producten uit eerdere experimenten te vermijden. De beste manier om dit probleem te minimaliseren is het ruimtelijk scheiden pre-en post-PCR stappen. Idealiter zou de analyse van de PCR-producten en alle volgende stappen worden uitgevoerd in een aparte ruimte. Bovendien moet elk lid van het laboratorium gebruik maken van hun eigen set van buffers en andere reagentia. Op deze manier kunnen bronnen van besmetting gemakkelijker geïdentificeerd worden.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2638">iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution</a>. There was an error in part 2 of step 3. One of the characters had the incorrect symbol and was corrected to: "...as well as 2 &#x03BC;l Turbo DNase..." instead of: "...as well as 2 ml Turbo DNase..."

A correction to the article iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution was made.

Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

Voor gelelektroforese en membraan overdracht adviseren wij t hij gebruik van XCell SureLock ® Mini-Cell en XCell II ™ Blot Module Kit CE-markering (Invitrogen, EI0002), die compatibel is met het gebruik van de verschillende prefab minigels die zijn opgegeven door het protocol . Het merk en het ordernummer van alle gebruikte materialen is genoemd tijdens het protocol. De lijst van de enzymen die worden gebruikt in het protocol is weergegeven in onderstaande tabel. <table border="1"><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus # </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Proteïne A Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 10001D </td><td> gebruik van proteïne G voor muis of geit antilichaam </td></tr><tr><td> RNase I </td><td> Ambion </td><td> AM2295 </td><td> activiteit kan veranderen van partij tot partij </td></tr><tr><td> T4 RNA-ligase I </td><td> NEB </td><td> M0204S </td><td> </td></tr><tr><td> PNK </td><td> NEB </td><td> M0201S </td><td> </td></tr><tr><td> proteinase K </td><td> Roche </td><td> 03115828001 </td><td> </td></tr><tr><td> Superscript III reverse transcriptase </td><td> Invitrogen </td><td> 18080044 </td><td> </td></tr><tr><td> Circligase II </td><td> Epicentrum </td><td> CL9021K </td><td> </td></tr><tr><td> FastDigest ® BamHI </td><td> Fermentas </td><td> FD0054 </td><td> </td></tr><tr><td> AccuPrime ™ SuperMix I </td><td> Invitrogen </td><td> 12342010 </td><td> deze PCR-mix geeft de beste resultaten in onze handen </td></tr></table>

iclip - transcriptome-breed in kaart brengen van eiwit-rna interacties met individual nucleotide resolutie

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

De unieke samenstelling en ruimtelijke ordening van RNA-bindende eiwitten (RBPs) op een transcript gids de diverse aspecten van de post-transcriptionele regulatie 1. Daarom is een essentiële stap om het transcript regelgeving op het moleculaire niveau is het positionele informatie te verkrijgen over de bindingsplaatsen van RBPs 2. Eiwit-RNA interacties kunnen bestudeerd worden met behulp van biochemische methoden, maar deze benaderingen niet te pakken RNA verbindend in al haar oorspronkelijke cellulaire context. De eerste pogingen om eiwit-RNA complexen studie in hun cellulaire omgeving werkzaam affiniteitszuivering of immunoprecipitatie gecombineerd met differentieel display of microarray analyse (RIP-CHIP) 3-5. Deze benaderingen waren gevoelig voor het identificeren van indirecte of niet-fysiologische interacties 6. Om de specificiteit en positionele resolutie te verhogen, een strategie om als CLIP (UV cross-linking en immunoprecipitatie) werd geïntroduceerd 7,8 verwezen. CLIP combineert UV-cross-linking van eiwitten en RNA-moleculen met strenge zuivering&#39;s waaronder denaturerende polyacrylamidegelelektroforese. In combinatie met een high-throughput sequencing technologieën, is CLIP bewezen als een krachtig instrument om eiwit-RNA-interacties op een genoom-brede schaal (aangeduid als HITS-CLIP of CLIP-seq) 9,10 te bestuderen. Onlangs werd PAR-CLIP geïntroduceerd die fotoreactief ribonucleoside analogen gebruikt voor cross-linking 11,12. Ondanks de hoge specificiteit van de verkregen gegevens, CLIP experimenten genereren vaak cDNA-bibliotheken van de beperkte reeks complexiteit. Dit is deels te wijten aan de beperkte hoeveelheid co-gezuiverd RNA en de twee inefficiënte RNA ligatiereacties die nodig is voor bibliotheek voorbereiding. Daarnaast, primer extensie assays aangegeven dat veel cDNA&#39;s voortijdig kappen op de verknoopte nucleotide 13. Dergelijke afgekapt cDNA&#39;s zijn verloren tijdens de standaard CLIP bibliotheek voorbereiding protocol. We hebben recent ontwikkelde iClip (individuele-nucleotide resolutie CLIP), die de afgeknotte cDNA&#39;s vangt door het vervangen van een van de inefficiënte intermoleculaire RNA ligatie stappen met een meer efficiënte intramoleculaire cDNA circularization (figuur 1) 14. Belangrijk is dat sequencing de afgeknotte cDNA&#39;s geeft inzicht in de positie van de cross-link site op nucleotide resolutie. Wij hebben met succes toegepast iClip op hnRNP C deeltje organisatie op een genoom-brede schaal onderzoek en de rol ervan te beoordelen in splicing voorschrift 14.

De ruimtelijke ordening van RNA-bindende eiwitten op een transcript is een belangrijke determinant van post-transcriptionele regulatie. Daarom ontwikkelden we de individuele-nucleotide resolutie van UV-crosslinking en immunoprecipitatie (iClip) dat precieze genoom-brede kartering van de bindingsplaatsen van een RNA-bindend eiwit maakt.

iClip - Transcriptome-breed in kaart brengen van eiwit-RNA Interacties met Individual Nucleotide resolutie

De unieke samenstelling en ruimtelijke ordening van RNA-bindende eiwitten (RBP's) op een transcript sturen de diverse aspecten van post-transcriptionele ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om een transcriptoombrede kaart van de bindingsplaatsen van een RNA-bindend eiwit te verkrijgen met een resolutie op individueel nucleotide-niveau. Dit wordt bereikt door in een tweede stap levende cellen te bestralen met UV-licht om eiwitten en RNA in vivo covalent aan elkaar te crosslinken. Het RNA-bindende eiwit wordt onder stringente omstandigheden immunogezuiverd om de gecrosslinkte RNA-fragmenten terug te winnen.Vervolgende reverse transcriptie genereert cDNA's die vaak worden afgekapt bij het gebonden peptide, waardoor de informatie over de positie van de cross-link binnen het RNA behouden blijft. Er worden resultaten verkregen die alle bindingsplaatsen binnen het transcriptoom tonen op basis van high-throughput sequencing van de cDNA-bibliotheek. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de RNA-biologie, zoals hoe de interactie van verschillende RNA-bindende eiwitten de RNA-verwerking reguleert. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we zowel de prestaties als de resolutie van onze transcriptoombrede kaarten van eiwit-RNA-interacties verhogen. Om te beginnen met de procedure van UV-cross-linking van weefselkweekcellen.Verwijder het medium uit een plaat van 10 centimeter met healer-cellen. Voeg zes milliliters ijskoud PBS toe en plaats de platen op ijs. Eén plaat is voldoende voor drie experimenten.Verwijder het deksel en bestraal de cellen. Zet de golflengte op 254 nanometers met 150 millijoules per centimeter squared en oogst de cellen door ze met een cell lifter van de platen af te schrapen. Breng twee milliliters cellensuspensie over naar elk van de drie microbuisjes om de cellen te pelletteren. Centrifugeer deze op maximale snelheid gedurende 10 seconden bij vier graden Celsius.Verwijder vervolgens de supernatant-snap, vries de celpellets in op droogijs en bewaar deze bij min 80 graden Celsius tot gebruik. Voeg 100 µL proteïne-DynaBeads per experiment toe aan een schone microcentrifugebuis. Gebruik proteïne G DynaBeads indien er gewerkt wordt met muizen- of geitenantilichamen.Was de kraaltjes twee keer met lysisbuffer, die te vinden is in het bijbehorende schriftelijke protocol. Resuspendeer de kraaltjes in 100 µL lysisbuffer met twee tot 10 µg antilichaam. Rotateer de buis bij kamertemperatuur gedurende 30 tot 60 minuten.Was de beads vervolgens drie keer met 900 µL lysisbuffer en laat ze in de laatste wasbeurt staan totdat u klaar bent om verder te gaan. Voor immunoprecipitatie van Thor-cellen op ijs: resuspendeer in 1 mL lysisbuffer en breng dit over naar een 1,5 mL microcentrifugebuis.Bereid een verdunning van 1:500 van RNAs one voor. Voeg vervolgens 10 µL samen met 2 µL turbo DNAs toe aan het cellulysaat. Incubeer de monsters precies drie minuten bij 37 °C, terwijl ze worden geschud met 1.100 omwentelingen per minuut, en breng ze onmiddellijk over naar ijs.Centrifuge de monsters vervolgens bij 4 °C en 22 000 ×g gedurende 20 minuten om het lysaat te klaren. Verzamel het supernatant zorgvuldig, waarbij ongeveer 50 µL lysaat bij het pellet wordt achtergelaten. Verwijder de wasbuffer en voeg vervolgens de voorbereide cellysaten toe. Laat de monsters twee uur roteren bij 4 °C.Verwijder het SUP-agens en was de beads twee keer met 900 µL high salt buffer, zoals beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol. Was de beads tot slot twee keer met 900 µL wasbuffer. Ga vervolgens over tot het defosforyleren en het toevoegen van een linker aan de 3'-uiteinden van het RNA.Om de 5'-uiteinden van het RNA te labelen, werkend achter een plexiglas scherm. Verwijder het supernatant van de laatste wasstap van de linkerligatiereactie en resuspendeer de beads in 8 µL warme PNK-mix. Incubeer gedurende vijf minuten bij 37 °C.Verwijder het warme PNK-mengsel en gebruik het opnieuw. Suspendeer de beads in 20 µL van een éénvoudig nieuw paginalaadbuffer. Incubeer het monster vervolgens op een thermomixer bij 70 °C gedurende 10 minuten.Plaats het monster onmiddellijk op een magneet om de lege beads neer te slaan. Laad de monsters op een 4 tot 12% nieuwe SDS-PAGE gel volgens de instructies van de fabrikant.Laad daarnaast vijf µL van een vooraf gekleurde eiwitlengtemarker. Laat de gel 50 minuten lopen bij 180 volt. Transfer de eiwit-RNA-complexen van de gel naar een nitrocellulosemembraan met behulp van het NOVA natte transferapparaat volgens de instructies van de fabrikant.Spoel na de overdracht het membraan met PBS-buffer. Wikkel het membraan vervolgens in Saranwrap en stel het bloot aan film bij minus 80 graden Celsius. Voer belichtingen uit gedurende 30 minuten, één uur en een nacht.Isoleer vervolgens de membraanregio volgens de eiwit-RNA-complexen uit de lage RNA-concentraties. Voer het experiment uit met de autoradiografie als masker. Win het RNA uit het membraan terug door middel van digestie met proteinase K en fenol-chloroformextractie.Screvaer het RNA om met een van de AYP-primers om het cDNA te zuiveren via een gel. Meng zes µL cDNA-monster met zes µL twee keer TBE-urealadbuffer, vlak voordat de monsters op een gel worden geladen.Verwarm de monsters drie minuten lang tot 80 °C. Laad de monsters vervolgens, samen met een marker voor laag moleculair gewicht, op een prefab 6% TBE-ureumgel. Laat de gel 40 minuten lopen bij 180 volt, zoals beschreven door de fabrikant, waarbij de bovenste kleurstof en de markeringen op de plastic gelondersteuning als leidraad voor de excisie worden gebruikt.Snijd drie banden uit op 120 tot 200 nucleotiden, 85 tot 120 nucleotiden en 70 tot 85 nucleotiden. Houd er rekening mee dat de arc lip-primer en de L drie-sequentie samen 52 nucleotiden van de clip-sequentie beslaan. Voeg 400 µL TE toe en verbrijzel het gelstukje in kleine stukjes.Incubeer de gelstukjes met behulp van de zuiger van een spuit van 1 ml gedurende twee uur bij 37 °C met schudden op 1.100 toeren per minuut. Plaats twee glazen voorfilters van 1 cm in een CoStar spinx-kolom. Draag het vloeibare deel van het monster over naar de kolom en centrifugeer dit één minuut op 13.000 toeren per minuut in een buisje van 1,5 ml.Voeg 0,5 µL glyco blue en 40 µL natriumacetaat pH 5,5 toe. Meng vervolgens het monster. Voeg 1 mL 100% ethanol toe.Meng opnieuw en laat het monster een nacht neerslaan bij -20 °C. Circulariseer vervolgens de CD NA-moleculen om de adaptorregio aan het 5'-uiteinde te koppelen. Lineariseer daarna opnieuw en voer een PCR-amplificatie uit volgens het bijbehorende schriftelijke protocol voorafgaand aan de sequencing van de eye clip-library; het succes van het experiment kan in twee stappen worden gemonitord.De autoradiografie van het eiwit-RNA-complex na membraanoverdracht en het gelbeeld van de PCR-producten; in de autoradiografie van de monsters met een lage RNA-concentratie moet diffuse radioactiviteit zichtbaar zijn boven het molecuulgewicht van het eiwit. Voor monsters met een hoge RNA-concentratie is deze radioactiviteit sterker geconcentreerd nabij het molecuulgewicht van het eiwit. Wanneer er geen antilichaam wordt gebruikt bij de immunoprecipitatie, mag er geen signaal worden gedetecteerd.Verdere belangrijke controles voor de specificiteit van de immunoprecipitatie omvatten het weglaten van UV-bestraling of het gebruik van cellen die het eiwit van belang niet tot expressie brengen. De gelafbeelding van de PCR-producten moet een groottebereik vertonen dat overeenkomt met de cDNA-fractie. Let op dat de PCR-primers, P3Celexa en P5Celexa, 76 extra nucleotiden toevoegen aan de grootte van het cDNA. Indien er geen antilichaam wordt gebruikt tijdens de immunoprecipitatie, mag er geen overeenkomstig PCR-product worden gedetecteerd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat elk van de 64 stappen kritisch is en met honderd procent nauwkeurigheid moet worden uitgevoerd. ICL-gegevens kunnen computationeel worden geïntegreerd met functionele assays op transcriptoombreed niveau. Dit kan bijvoorbeeld inzicht verschaffen in de positieafhankelijke regulatie van RNA-verwerking.Voor de computationele data-analyse verwijzen wij graag naar onze recente publicaties in samenwerking met Nicholas KA van het European Bioinformatics Institute en bla zupan van de University of Liana. En nu is het tijd om met uw eigen experimenten te beginnen. Veel succes.

iclip-transcriptome-wide-mapping-protein-rna-interactions-with

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Vanwege het tijdelijke karakter van de pre-mRNA, kan het moeilijk zijn te isoleren en te...

Een snelle High-throughput Methode voor Mapping Ribonucleoproteins (RNP&#39;s) op de menselijke pre-mRNA

RNA transcripten zijn onderworpen aan een uitgebreide posttranscriptionele regulering die wordt bemiddeld door een veelheid van trans-werkende RNA-bindende eiwitten (RBPs). Hier presenteren wij een generaliseerbaar methode om te identificeren precies en op een transcriptoom schaal van de RNA-bindingsplaatsen van RBPs.

PAR-Clip - een methode om Transcriptome-breed de bindingsplaatsen van RNA-bindende eiwitten te identificeren

Hier worden we gedetailleerd beschreven over de methode van S- vergelijking van P- soralen verknoopt, L igated en S gekozen H ybrids (SPLASH), die genoom-wide mapping van intramoleculaire en intermoleculaire RNA-RNA interacties in vivo mogelijk maakt . SPLASH kan toegepast worden om RNA-interacties van organismen te bestuderen, waaronder gist, bacteriën en mensen.

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

We beschrijven een protocol te identificeren van RNA-bindende proteÃ¯nen en kaart van de regio's hun RNA-bindende in levende cellen met behulp van UV-gemedieerde photocrosslinking en massaspectrometrie.

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Hier presenteren wij een interactief capture protocol toegepast op Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasten. Deze methode berust op in vivo UV-verknoping en staat voor isolatie en identificatie van plantaardige mRNA-bindende eiwitten uit een fysiologische omgeving.

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

Wij presenteren experimentele benaderingen voor studeren RNA-interactors van double-stranded RNA bindend proteïne kinase RNA-geactiveerd (PKR) tijdens de zoogdieren celcyclus met behulp van HeLa cellen. Deze methode maakt gebruik van formaldehyde dwarslijn RNA-PKR complexen en immunoprecipitation te verrijken van PKR-gebonden RNAs. Deze RNAs kunnen verder worden geanalyseerd door middel van high-throughput sequencing of qRT-PCR.

Bestuderen van RNA Interactors van proteïne Kinase RNA-geactiveerd tijdens de zoogdieren celcyclus

Hier presenteren we een eCLIP protocol om de belangrijkste RNA doelen van RBP kandidaten in testis te bepalen.

Verbeterde crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) methode voor efficiënte identificatie van proteïne-verbindend RNA in muis testis

Hier presenteren we een protocol om endogene RNA binding sites of "Footprints" van RNA: proteïne (RNP) complexen uit zoogdiercellen te verrijken. Deze aanpak omvat twee immunoprecipitaties van RNP-subeenheden en wordt daarom nagesynchroniseerde RNA-immunoprecipitatie in tandem (RIPiT).

Identificatie van voetafdrukken van RNA: eiwitcomplexen via RNA-immunoprecipitatie in tandem gevolgd door sequencing (RIPiT-SEQ)

Hier presenteren we een gewijzigd CLIP-seq protocol genaamd FbioCLIP-seq met FLAG-biotine tandem zuivering om de RNA doelen van RNA-bindende eiwitten (RBPs) in zoogdiercellen te bepalen.

Transcriptome-Wide Profilering van Protein-RNA Interacties door Cross-Linking en Immunoprecipitatie Gemedieerd door FLAG-Biotine Tandem Purification

Kinetische cross-linking en analyse van cDNA is een methode die onderzoek mogelijk maakt naar de dynamiek van eiwit-RNA interacties in levende cellen met een hoge temporele resolutie. Hier wordt het protocol in detail beschreven, inclusief de groei van gistcellen, UV-crosslinking, oogsten, eiwitzuivering en voorbereidingsstappen voor de volgende generatie sequencingbibliotheek.

Monitoring van eiwit-RNA interactiedynamica in vivo bij hoge temporele resolutie met behulp van χCRAC

Een UV-gebaseerde ChIRP-methode om directe interacties tussen lncRNA en eiwitten te identificeren.

Een UV-gebaseerde ChIRP-methode voor de verifieerbare identificatie van eiwitten die direct interageren met LncRNA: van gekweekte cellen tot muistestikels

Leer iCLIP voor transcriptoom-brede mapping van eiwit-RNA-interacties met individuele nucleotide-resolutie. Deze methode combineert UV-crosslinking met immunoprecipitatie en high-throughput sequencing.

iClip - Transcriptome-breed in kaart brengen van eiwit-RNA Interacties met Individual Nucleotide resolutie

Meer video's verkennen