Name: Gebruik van de Mens Perivasculaire stamcellen voor botregeneratie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Leer perivasculaire stamcelimplantatie voor botregeneratie met behulp van humane PSCs uit vetweefsel. Deze methode toont significante botvorming in vivo binnen acht weken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de CIRM Vroege Translationeel II Research Award TR2-01821, NIH / NIDCR (subsidies R21 DE0177711 en RO1 DE01607), UC Discovery Grant 07-10677, AWJ en RKS hebben T32 opleidingsbeurzen awards (5T32DE007296-14), JNZ heeft een CIRM opleiding gemeenschap (TG2-01169).

1. Perivasculaire Stem Cell Isolatie Dit wordt in detail beschreven in de aangrenzende artikel "Zuivering van perivasculaire stamcellen van menselijke vetweefsel", door M. Corselli et al.. 2. Steiger Creation <ol><li> Steigers zijn op maat gemaakt per eerder gepubliceerde protocol van poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA, Burmingham Polymer) met hydroxyapatiet coating 4-6. Apatiet gecoate PLGA steigers zijn vervaardigd uit 85/15 PLGA Met behulp van oplosmiddelen gieten en een fijn uitloging proces. Steigers zijn gemaakt in een bolvorm (2 mm) voor spierzakje implantatie een schijfvormige vorm (4 mm) voor calvarial implantatie of cilindrisch (4 mm diameter 6 mm lengte) voor femorale segmentale defecten. </li><li> In het kort, PLGA / chloroform oplossingen gemengd met sucrose (polymeer / sucrose verhouding 5/95, w / w) zijn gegoten in een 200-300-um een ​​diameter van Teflon mal om de custom-made cons makentruct. Na het vriesdrogen 's nachts, zijn steigers verwijderd uit de Teflon mal en ondergedompeld in DDH 2 O om de sucrose te ontbinden. Steigers worden gedesinfecteerd door onderdompeling in 70% ethanol gedurende 30 min, gevolgd door drie spoelingen van DDH 2 O. </li><li> Voor apatiet coating, wordt een gesimuleerde lichaamsvloeistof (SBF) oplossing bereid door achtereenvolgens het oplossen van CaCl2, MgCl2 • 6H 2 O, NaHCO 3 en K 2 HPO 4 • 3H 2 O in DDH 2 O. PH wordt verlaagd tot 6 door toevoeging van 1 M zoutzuur om de oplosbaarheid te verbeteren. Na 2 SO 4, KCl, NaCl en toegevoegd en de uiteindelijke pH op 6,5 (SBF 1). </li><li> Mg2 + en HCO 3 - vrije SBF (SBF 2) wordt bereid door toevoeging CaCl2 en K2 HPO 4 • 3H 2 O 2 O in DDH en pH verlaagd wordt tot 6. KCl en NaCl toegevoegd en de uiteindelijke pH op 6,8. Alle oplossingen zijn steriel gefiltreerd door een 0,22 pm PES membrane (Nalgene). Direct voorafgaand aan de coating proces worden de gedroogde PLGA steigers onderworpen aan glimontlading argon plasma-etsen (Harrick Scientific) te bevochtigen en coaten uniformiteit te verbeteren. </li><li> Geëtst steigers vervolgens geïncubeerd in SBF 1 voor 12 uur en veranderd Mg2 + en HCO 3 - vrij SBF 2 met 12 uur bij 37 ° C onder voorzichtig roeren. Coated steigers worden gewassen met DDH 2 O om het overtollige ionen te verwijderen en voorafgaand aan verdere studies gevriesdroogd. </li></ol> 3. De Muscle Pouch Model Implantatie <ol><li> 100 ul van een PVC suspensie in PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) worden voorzichtig vallen op het bolvormige PLGA gebaseerde implantaat onmiddellijk voorafgaand aan implantatie. Cellen werden gelabelde door lentivirus inbrengen van vuurvlieg luciferase, om mogelijk in vivo volgen na implantatie. Cel dichtheid is 2,5 x 10 5 per implantaat. </li><li> SCID (ernstige gecombineerde immunodeficiëntie) muizen worden gebruikt op 6 weken oud. Dieren zijn Anesthetized door isofluraan inademing en premedicatie met buprenorfine (Bedford Labs). Na standaard Betadine bereiding worden bilaterale insnijdingen in de achterpoten gemaakt (lengte en 2 mm lengte). </li><li> Zakken worden gesneden in de biceps femoris spieren door stompe dissectie parallel aan de spiervezels lange as. Voor elke muis, wordt de PLGA-gebaseerde implantaat met PSC's geplaatst en de fascia bovenop de spier wordt gehecht met 5-0 Vicryl (Ethicon). </li><li> De huid wordt volgende gesloten met 5-0 Vicryl in een subcutane patroon. De dieren worden na de operatie behandeld met buprenorfine voor 48 uur en TMP / SMX (trimethoprim / sulfamethoxazol, Qualitest) gedurende 10 dagen. </li></ol> 4. De Calvarial Defect Model Implantatie <ol><li> Na isofluraananesthesie van SCID muizen (12-14 weken oud), wordt het haar geknipt en de huid ontsmet met betadine per protocol. </li><li> Een 8-mm incisie in de huid gebeurt langs het midden van de pijlnaad van de muis calvarium. Vervolgens wordt de Calvarial periost wordt voorzichtig verwijderd door Q-tip applicatie. </li><li> Vervolgens wordt met behulp gediamanteerd trephine bits in een snelle tandartsboor wordt een 4 mm wandbeen defect gemaakt. Het defect is de volledige dikte - hoe zorg wordt genomen niet aan de onderliggende dura mater verwonden. </li><li> De op maat gemaakte PLGA-gebaseerde implantaat met geënt PSC's wordt vervolgens voorzichtig geplaatst in het defect site. Cel dichtheid is 2,5 x 10 5 per implantaat. Ten slotte wordt de huid gehecht met 6-0 Vicryl. De dieren worden na de operatie behandeld met buprenorfine voor 48 uur en TMP / SMX gedurende 10 dagen. </li></ol> 5. De Femorale segmentaal defect Model Implantatie <ol><li> Athymische ratten (12-14 weken oud) zijn verdoofd onder isofluraan inademing. Het dijbeen is geschrobd en bereide per standaard protocol met betadine (figuur 1). </li><li> Een 27-30-mm longitudinale incisie wordt gemaakt over de anterolaterale aspect van het dijbeen. De femurschacht wordt vervolgens blootgesteld door het scheiden van de vastus lateralis en biceps femoris spieren (figuur 2). </li><li> Om de consistentie van botregeneratie te maximaliseren, wordt het periost bovenop de femorale defect volledig verwijderd met de verwijderde femorale segment. </li><li> Een polyetheen plaat (lengte 23 mm, breedte, 4 mm, hoogte, 4 mm) wordt op de anterolaterale oppervlak van de femur. De plaat bevat zes voorgeboorde gaten om tegemoet 0,9 mm diameter schroefdraad Kirschner draden (Zimmer). Inname van de plaat als een sjabloon, worden zes schroefdraad Kirschner draden geboord door de plaat en beide cortex (Figuur 3). </li><li> Vervolgens een kleine oscillerende zaagblad (Stryker, MI), wordt een 6 mm midden diaphyseal defect gemaakt. Gesegmenteerde defecten worden behandeld door het inbrengen van PLGA gebaseerde implantaten die zijn beladen met cellen volgens het protocol (figuur 4). </li><li> De bovenliggende spier-en fascia zijn gesloten met 4-0 Vicryl resorbeerbare hechtingen om het implantaat vast te zetten, en de huid wordt gehecht. </li> 6. In vivo beoordelingen <ol><li> Radiografische evaluaties worden uitgevoerd in een longitudinale manier door zowel een hoge resolutie XR en een hoge resolutie μCT (micro CT) analyse. Voor μCT analyse (Skyscan 1172F), worden de beelden gescand met een resolutie van 19,73 urn (100 kV en 100 mA stralingsbron met een 0,5 mm aluminium filter). Afbeeldingen worden geanalyseerd met behulp van Dataviewer, Recon, CTAN en CTVol software. </li><li> Bioluminescentie beeldvorming gebeurt ook in een seriële manier naar cel engraftment, levensvatbaarheid, de proliferatie te beoordelen en uit te sluiten uit de migratie van het implantaat site. Bioluminescentie beeldvorming wordt uitgevoerd met behulp van een IVIS Lumina II apparaat (Remklauw Life Sciences). Licht uitgangen worden gekwantificeerd met behulp van Living Image software (Xenogen). Totaal lichtopbrengst is opgenomen in fotonen / seconde / cm ² / steradiaal. </li><li> Histologische en histomorfometrische analyse wordt uitgevoerd postmortem. Werkzaam Routine vlekken zijn Masson trichroom, aniline blauw, pentachrome en Picrosirius rood. Histomorfometrische analyse is eenvoudig uitgevoerd met ofwel aniline blauw of pentachrome vlekken, waarin osteoid er donker blauw en geel, respectievelijk. Pixels per high powered veld worden berekend met behulp van de toverstaf in Adobe Photoshop. </li></ol> 7. Representatieve resultaten Omdat zowel de calvarial en femorale gebreken zijn kritische grootte, geen grote genezing worden verwacht zonder behandeling met groeifactoren of exogene stamcellen. Op het gebied van chirurgische manoeuvres, moet het spierzakje dissectie zijn langs de fascia vliegtuigen en dus een minimale bloeding moet worden aangetroffen. Hoewel het spierzakje model wordt bilateraal uitgevoerd, moet de muis te lopen met gemak op postoperatieve dag 1. Voor de calvarial gebrek, wordt bloedingen aangetroffen, maar kan worden geweekt met een Q-tip. Uiterst voorzichtig moeten worden genomen niet aan de onderliggende dura mater verwonden - want dit zal interfererenmet normale heling. Voor de FSD-model, wordt erop toegezien dat niet te verwonden van de grote bloedvaten geen te zware bloedingen of de femorale zenuw veroorzaken neurologische schade te voorkomen. Kirschner draden worden geboord met een lichte druk om niet het corticale bot in het te beschadigen. <img alt="Figuur 1." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1."> Figuur 1. Preoperatieve voorbereiding op Femorale segmentaal defect (FSD) in athymische ratten. Mannelijke ratten (12-14 weken oud) zijn verdoofd onder isofluraan inademing. Het dijbeen is geschrobd en voorbereid per standaard protocol met betadine. <img alt="Figuur 2." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2."> Figuur 2. Chirurgische blootstelling voor Femorale segmentaal defect (FSD) creatie. Een 27-30 mm longitudinale incisie wordt gemaakt over de anterolaterale aspect van het dijbeen. De buitenzijde van de femurschacht wordt vervolgens belicht door het scheiden van vastus lateralisen biceps femoris spieren. <img alt="Figuur 3." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3."> Figuur 3. Fixatie voor Femorale segmentaal defect (FSD) creatie. Een polyetheen plaat (lengte 23 mm, breedte, 4 mm, hoogte, 4 mm) wordt op de anterolaterale oppervlak van de femur. De plaat bevat zes voorgeboorde gaten tot 0,9 mm diameter schroefdraad Kirschner draden tegemoet te komen. Inname van de plaat als een sjabloon, worden zes schroefdraad Kirschner draden geboord door de plaat en beide cortex. Vervolgens wordt een 6 mm midden diaphyseal defect gemaakt. Als dit eenmaal is uitgevoerd, wordt een op maat gemaakte steiger direct geplaatst en dat is precies het defect website past (niet afgebeeld). <img alt="Figuur 4." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4."> Figuur 4. Voorbeeld van Calvarial Defect na de operatie. Een 4 mm, cirkelvormige calvarial defect wordt in de juiste wandbeen in muizen zonder thymus. Afgebeeld is hier een defectlocatie geïmplanteerdPSC's na 8 weken na de operatie. Let op de aanwezigheid van nieuw bot in het defect. </ol>

<ol><li>Crisan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3, 01-13 (2008).</li>
<li>Chen, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+multi-lineage+progenitor+cells+in+human+organs%3A+regenerative+units%2C+cytokine+sources+or+both%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: regenerative units, cytokine sources or both.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 20, 429-434 (2009).</li>
<li>Corselli, M., Chen, C. W., Crisan, M., Lazzari, L., Peault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+ancestors+of+adult+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells.</a> Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 30, 1104-1104 (2010).</li>
<li>Zara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nell-1+enhances+bone+regeneration+in+a+rat+critical+sized+femoral+segmental+defect+model%5BTitle%5D)+AND+%22Plast.+Reconstr.+Surg%22%5BJournal%5D)">Nell-1 enhances bone regeneration in a rat critical sized femoral segmental defect model.</a> Plast. Reconstr. Surg. , Forthcoming (2010).</li>
<li>James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleterious+Effects+of+Freezing+on+Osteogenic+Differentiation+of+Human+Adipose-Derived+Stromal+Cells+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Deleterious Effects of Freezing on Osteogenic Differentiation of Human Adipose-Derived Stromal Cells In Vitro and In Vivo.</a> Stem Cells Dev. 20, 427-439 (2011).</li>
<li>Lee, M., Chen, T. T., Iruela-Arispeb, M. L., Wu, B. M., Dunn, J. C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+protein+delivery+from+modular+polymer+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modulation of protein delivery from modular polymer scaffolds.</a> Biomaterials. 28, 1862-1870 (2007).</li>
<li>Aghaloo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+role+of+nell-1+gene+modified+goat+bone+marrow+stromal+cells+in+promoting+new+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">A study of the role of nell-1 gene modified goat bone marrow stromal cells in promoting new bone formation.</a> Mol. Ther. 15, 1872-1880 (2007).</li>
<li>Levi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Adipose-Derived+Stromal+Cells+Stimulate+Autogenous+Skeletal+Repair+via+Paracrine+Hedgehog+Signaling+with+Calvarial+Osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Human Adipose-Derived Stromal Cells Stimulate Autogenous Skeletal Repair via Paracrine Hedgehog Signaling with Calvarial Osteoblasts.</a> Stem Cells Dev. 20, 243-257 (2011).</li>
<li>Leucht, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origin+and+Hox+status+determine+progenitor+cell+fate+during+adult+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic origin and Hox status determine progenitor cell fate during adult bone regeneration.</a> Development. 135, 2845-2854 (2008).</li>
<li>Rajashekhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFATS+collection%3A+Adipose+stromal+cell+differentiation+is+reduced+by+endothelial+cell+contact+and+paracrine+communication%3A+role+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">IFATS collection: Adipose stromal cell differentiation is reduced by endothelial cell contact and paracrine communication: role of canonical Wnt signaling.</a> Stem Cells. 26, 2674-2681 (2008).</li>
<li>Zuk, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+tissue+is+a+source+of+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.</a> Mol Biol Cell. 13, 4279-4295 (2002).</li>
</ol>

KT, BP, en CS zijn uitvinders van perivasculaire stamcel-gerelateerde octrooien van de UCLA. Drs. KT, en CS zijn oprichters van Scarless Laboratories Inc, die perivasculaire stamcel-gerelateerde patenten sublicenties van de UC Regenten. Dr Chia Soo is ook een officier van Scarless Laboratories, Inc

De isolatie van PSC wordt goed beschreven elders 1-3, met inbegrip van een afzonderlijke indiening van Jove publicatie die specifiek gericht zijn PVC isolatie protocollen en methoden. Het specifieke doel van dit artikel is het beschrijven en 3 protocollen voor de PSC aan te tonen in vivo toepassing voor de botvorming / regeneratie. De SCID muis spier zakje is een veel beschreven model voor de menselijke ectopische botvorming 7. Belangrijke verschillen tussen ectopische en orthotope (defect) modellen voor het bot, met inbegrip van paracriene interactie met bot van de gastheer-vormende cellen 8, alsmede een overvloed aan osteogene signalering factoren aanwezig zijn in het skelet defect micro-omgeving. Twee defecten worden hier gepresenteerd, een calvarial defect8 en femorale segmentaal defect 4. Beide zijn goed gedocumenteerd om kritisch te zijn grootte (dat wil zeggen niet genezen op hun eigen). Interessante verschillen bestaan ​​tussen calvarial en femorale gebreken. Ten eerste, decel: cel interactie tussen xenografted PSC&#39;s en endogene cellen is heel anders. In termen van een calvarial defect ODC interactie met de onderliggende dura mater (de buitenste laag van de vliezen), evenals de Osteoblasten en periosteale cellen die om het defect. Belangrijk is dat de interactie tussen geïmplanteerde cellen omringende osteoblasten 8 of geïmplanteerde cellen en de onderliggende duur (Levi et al.., In druk) zijn van cruciaal belang voor de normale stamcellen gemedieerd osteogenesis te gaan. In termen van de femorale segmentaal defect (FSD), worden xenografted PSC&#39;s blootgesteld aan een heel andere cel en cytokine omgeving. Zo is het FSD plaats uit het beenmerg en bijbehorende mesenchymale stamcellen en de endosteum, periosteum en lange been Osteoblasten. Theoretisch, elke cel heeft zijn eigen reactie op de verwonding, en ieder mag zijn cel: cel interacties met PSC xenotransplantaten. Andere duidelijke verschillen bestaan ​​tussen calvarialen femorale gebreken. De calvarial botten in eerste instantie te vormen door middel van intramembraneuze ossificatie, terwijl de lange botten te vormen door middel van een kraakbeen tussenproduct (endochondrale ossificatie). Bovendien is de herstellende proces na het letsel ook bootst deze ontwikkeling ontstaan. Post-FSD, wordt het kraakbeen eeltvorming waargenomen, terwijl er geen kraakbeen intermediair wordt gevormd binnen een pariëtale botdefect. Tenslotte kan de embryonale oorsprong van de schedel verschillen van die van de lange botten. De meeste van de schedel (inclusief perivasculaire cellen - pericyten - in de gehele kop gebied) is afgeleid van het neurale (mesectoderm), terwijl de appendiculair skelet van paraxiale mesoderm afleiding 9. Al deze verschillen kunnen leiden tot significante verschillen in termen van PSC-gemedieerde botherstel. Het gebruik van PSC&#39;s heeft een aantal voordelen ten opzichte van traditionele vet-afgeleide stromale cellen (ASC). PSC&#39;s hebben geen cultuur en zijn een gezuiverde celpopulatie which omvat geen andere stromale cellen die niet deelnemen aan - en kan zelfs negatief te reguleren - osteogene differentiatie, zoals endotheelcellen 10. In tegenstelling tot bijvoorbeeld, klonale analyses van ASC dat slechts een subpopulatie kunnen ondergaan osteogene differentiatie in vitro 11. Uiteindelijk zal skeletweefsel engineering inspanningen waarschijnlijk ook voorzien zijn van een osteocompetent stamcel (zoals PSC) met exogene groeifactoren en osteoconductief steiger (zoals HA-PLGA in de onderhavige werkwijzen) als de beste botdefecten genezen.

gebruik van de mens perivasculaire stamcellen voor botregeneratie

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Menselijke perivasculaire stamcellen (PSC&#39;s) kunnen worden geïsoleerd in voldoende aantallen van verschillende weefsels ten behoeve van skeletale tissue engineering 1-3. PSC een FACS gesorteerd populatie &quot;pericyten (CD146 + CD34-CD45-) en &#39;adventitia cellen (CD146 CD34 +-CD45-), die elk wij eerder gemeld eigenschappen van mesenchymale stamcellen. PSC zoals MSC&#39;s kunnen osteogene differentiatie, als pro-scheiden osteogene cytokines 1,2 ondergaan. In het huidige protocol, tonen we de osteogenicity van de PSC&#39;s in verschillende diermodellen, inclusief een spier zakje implantatie bij SCID (ernstige gecombineerde immunodeficiëntie) muizen, een SCID muis calvarial defect en een femorale segmentaal defect (FSD) in athymische ratten. De dijspier zakje model wordt gebruikt om ectopische botvorming te beoordelen. Calvarial defecten zijn gericht op de pariëtale bot en zijn standaard 4 mm in diameter (kritische grootte) 8. FSDs zijn bicortical en worden gestabiliseerd meteen polyethyleen bar en K-draden 4. De beschreven FSD is een kritische omvang gebrek, dat niet significant geneest 4. Als daarentegen stamcellen of groeifactoren toegevoegd aan het defect kunnen aanzienlijke botherstel gewaardeerd. De algemene doelstelling van PSC xenografting is om de osteogene mogelijkheden van dit type cel aan te tonen in zowel ectopische en orthotope botregeneratie modellen.

Menselijke perivasculaire stamcellen (PSC&#39;s) zijn een nieuwe stamcel klasse voor het skelet weefselregeneratie vergelijkbaar met mesenchymale stamcellen (MSC&#39;s). PSC&#39;s kunnen worden geïsoleerd door FACS (fluorescentie geactiveerde cel sortering) uit vetweefsel verkregen tijdens standaard liposuctie procedures, dan gecombineerd met een osteoinductief steiger om botvorming te bereiken<em&gt; In vivo</em&gt;.

Gebruik van de Mens Perivasculaire stamcellen voor botregeneratie

Menselijke perivasculaire stamcellen (PSCs) kunnen in voldoende aantallen uit meerdere weefsels worden geïsoleerd voor doeleinden van skeletweefselengineering1-3. PSCs zijn ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het observeren van de effecten van perivasculaire stamcelimplantatie in ectopische en orthotopische botdifferentiatiemodellen. Dit wordt bereikt door eerst stamcellen uit adipose weefsel te isoleren met behulp van fax-technologie. Vervolgens worden op maat gemaakte scaffolds gefabriceerd om een oppervlak te bieden voor celdifferentiatie in een ofwel ectopische of orthotopische omgeving.Om de door PSC's gemedieerde botvorming te testen, worden skeletdefecten gecreëerd met behulp van een skid-muis spierzakmodel, een skid-muis schedeldakmodel of een athyme rat femurale segmentale defectmodel, waarna het getransplanteerde scaffold in het defect wordt geplaatst. Radiografische, histologische en biochemische analyses tonen aan dat de differentiatie van perivasculaire stamcellen leidt tot significante botvorming in vivo. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van paravasculaire stamcellen ten opzichte van andere meer traditionele stamcelbronnen is dat PSC's of paravasculaire stamcellen een homogenere populatie vormen, wat de zuiverheid van de stamcellen verhoogt, de productie van trofische factoren verbetert en potentieel de botvorming versterkt.Begin met het creëren van een steiger zoals beschreven in het bijbehorende manuscript. Bereid de steiger voor op implantatie door er een cel-suspensie aan toe te voegen. Gebruik voor de muisspierzak- of schedeldefectmodellen een dichtheid van 250 000 cellen per honderd µL na het toedienen van anesthesie.Zes weken oude skid-muizen met isofluraan en buprenorfine. Maak een standaard Betadine-preparatie op het achterste ledemaat. Maak vervolgens een longitudinale bilaterale incisie van twee millimeter en gebruik botte dissectie om pockets van vier millimeter diep in de musculi biceps femoris te maken.Parallel aan de spiervezel mag slechts minimale bloeding optreden. Plaats het implantaat dat is geënt met PSCs. Hecht nu de fascia over de spier met een eenvoudige doorlopende hechting met 5-0 Vicryl.Sluit vervolgens de huid met 5-0 Vicryl in een subcuticulair hechtpatroon. Behandel de dieren postoperatief gedurende 48 uur met buprenorfine en 10 dagen met T-M-P-S-M-X. De muis moet op de eerste postoperatieve dag gemakkelijk kunnen lopen.Na isofluraan-anesthesie van een 12 tot 14 weken oude skid-muis, wordt de calvariale regio standaard voorbereid met Betadine. Begin met een huidincisie van acht millimeter lengte op de mid-sagittale sutuur van het schedeldak van de muis.Verwijder vervolgens voorzichtig het periost van het schedeldak met een wattenstaafje en gebruik een applicator om het bloed op te zuigen. Maak nu met een met diamant gecoate trepanboor, bevestigd aan een hogesnelheids tandheelkundige boor, een defect van vier millimeter in het pariëtaal bot. Zorg dat het defect de volledige dikte heeft, dus geheel door het bot heen, maar wees uiterst voorzichtig om de onderliggende dura mater niet te beschadigen, aangezien dit het genezingsproces zal belemmeren.Plaats nu voorzichtig het implantaat met de gegrafted PSC's in de defectplaats. Hecht tot slot de huid postoperatief met 6-0 Vicryl. Behandel de dieren gedurende 48 uur met buprenorfine en gedurende 10 dagen met T-M-P-S-M-X.Begin met het scrubben en voorbereiden van het dijbeen van een 12 tot 14 weken oude amic-rat, die is geanestheseerd met isofluraan. Gebruik het standaard Betadine-protocol. Maak een longitudinale incisie van 27 tot 30 millimeter over het anterolaterale aspect van het dijbeen.Leg vervolgens de femur schacht vrij door de musculus vastus lateralis en de musculus biceps femoris te scheiden om overmatig bloeden te voorkomen. Wees voorzichtig in de nabijheid van de grote bloedvaten. Om de consistentie van de botregeneratie te maximaliseren, volledig.Verwijder het periost over het femurodefect, samen met het geresecteerde femurosegment. Vermijd beschadiging van de nervus femoralis om neurologische schade te voorkomen. Plaats nu een polyethyleenplaat op het anterolaterale oppervlak van het femur.Zes voorgeboorde gaten in de plaat zijn geschikt voor draad wound kirschner-draden met een diameter van 0,9 millimeter. Gebruik de plaat als mal om zes draad kirschner-draden door de plaat en beide corticales te boren. Maak met een klein oscillerend zaagblad een defect van zes millimeter in het midden.Implanteer vervolgens de PSC en het gegraftte steigerwerk in het defect. Sluit de bovenliggende spier en fascia met 4-0 Vicryl absorbeerbare hechtingen. Om het implantaat op zijn plaats te houden, krijgt de rat gedurende twee dagen postoperatief analgesie en wordt deze gedurende vier weken na de implantatie in de spierzak gemonitord op wonddehiscentie.Er was een geleidelijke toename in botvolume en botmineraaldichtheid waarneembaar bij PSC-integratie via micro-CT en röntgenanalyse gedurende acht weken na het aanbrengen van een calvariale defect; zonder steiger werd geen botgenezing waargenomen vanwege de kritieke omvang van het defect. Met een steiger maar zonder cellen werd een geringe genezing geschat op ongeveer 20%, zoals verwacht. Een geleidelijke toename van de ossificatie van het defect werd waargenomen bij een gezaaide steiger.Belangrijke ossificatie trad op binnen twee weken. Volledige ossificatie was bereikt acht weken na het aanbrengen van een femuraal defect. Een geleidelijke toename in ossificatie trad op wanneer het defect met BMP 2 werd behandeld; bij sommige dieren was al na vier weken een vereniging waarneembaar, en na acht weken waren alle dieren genezen.In tegenstelling hiermee werd geen botfusie waargenomen zonder steiger of met een steiger zonder cellen of recombinant eiwit. Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u paravasculaire stamcellen kunt isoleren, hoe u deze paravasculaire stamcellen vervolgens kunt gebruiken in combinatie met PLGA-osteoinductieve steigers, en tenslotte hoe u deze gecombineerde steiger- en celproducten kunt gebruiken voor drie verschillende methoden van tissue engineering. Bij het uitvoeren van elke procedure zoals hier gepresenteerd, zijn er een paar belangrijke zaken om rekening mee te houden. Ten eerste: bij het calvariale defectmodel zorgt een nauwkeurige preservering van de dura mater ervoor dat een goede genezing zal volgen.Ten tweede is het bij het model van het femorale segmentale defect bij ratten belangrijk om trauma aan de omliggende zenuwen en bloedvaten te minimaliseren. Zodra iemand een bepaalde chirurgische techniek beheerst zoals hier gepresenteerd, kan men ervan uitgaan dat elke implantatie van een spierzak ongeveer 20 minuten in beslag neemt, en elk calvaria-defect en femorale segmentale defect tot 30 minuten kan duren om correct uit te voeren.

use-of-human-perivascular-stem-cells-for-bone-regeneration

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit protocol beschrijft de isolatie van vet-afgeleide stromale cellen van lipoaspirate en de oprichting van een 4 mm kritische grootte calvarial defect aan het skelet regeneratie te evalueren.

Reparatie van een kritische grootte Calvarial Defect Model Met behulp van Adipose-afgeleide stromale cellen geoogst uit Lipoaspirate

Mesenchymale stamcellen (MSC's) hebben een differentiatiepotentieel naar de osteoblastische lijn wanneer ze worden gestimuleerd met oplosbare factoren of specifieke biomaterialen. Dit werk presenteert een nieuwe optie voor de aflevering van MSC's uit menselijk amnionmembraan (AM-hMSC's) die de boviene botmatrix Nukbone (NKB) gebruikt als een scaffold.

Isolatie van menselijke mesenchymale stamcellen en hun kweek op de poreuze botmatrix

Menselijk hartweefsel herbergt multipotente perivasculaire precursor celpopulaties die geschikt zijn voor myocard regeneratie kunnen zijn. De hier beschreven techniek maakt de gelijktijdige isolatie en zuivering van twee multipotente stromale cel populaties geassocieerd met natieve bloedvat, dat wil zeggen CD146 + CD34 - pericyten en CD34 + CD146 - adventitia-cellen van de menselijke hartspier.

Isolatie van Perivasculaire Multipotent Precursor Cell Populaties van de Mens Cardiac Tissue

Het kweken van menselijke mesenchymale stromale cellen (hMSCs) met autologe serum, vermindert het risico op afwijzing door xenogene materiaal en andere negatieve effecten. Het staat ook voor het herstel van een subset van mesodermale voorlopercellen, die een frisse hMSCs kan leveren. Inbedding hMSCs in een autoloog fibrinestolsel maakt een eenvoudige bediening en effectieve chirurgische implantatie.

Mesenchymale stromale Cell Cultuur en Levering in autologe Voorwaarden: een slimme aanpak voor orthopedische toepassingen

Adipositas-afgeleide stromale cellen kunnen nuttig zijn voor het ontwerpen van nieuw weefsel uit de eigen cellen van een patiënt. We presenteren een protocol voor de isolatie van een subpopulatie van humane adipositas-afgeleide stromale cellen (ASC's) met een verhoogd osteogeen potentieel, gevolgd door toepassing van de cellen in een in vivo calvariaal genezingsassay.

Rapid Isolatie van BMPR-IB + Adipose-afgeleide stromacellen voor gebruik in een calvarial Defect Healing Model

Hier presenteren we een protocol om te visualiseren bloedvat vorming in vivo en in real-time in 3D steigers door multiphoton microscopie. Angiogenese in genetisch gemodificeerde steigers werd bestudeerd in een lymfkliertest calvarial kritische bot defect model. Meer nieuwe bloedvaten werden ontdekt in de behandelde groep dan in besturingselementen.

Visualiseren van angiogenese door Multiphoton microscopie In Vivo in genetisch gemodificeerde 3D-PLGA/nHAp steiger voor Calvarial kritische bot Defect reparatie

Een methode om verschillende gehumaniseerde beenmergnissen in muizen te creëren en te leven, wordt gepresenteerd. Op basis van de ondersteunende niche die door menselijke mesenchymale cellen is gecreëerd, induceert de toevoeging van menselijke endotheelcellen de vorming van menselijke vaten, terwijl de toevoeging van rhBMP-2 de vorming van chimerisch volwassen weefsel van humane muizen veroorzaakt.

Bioengineering van Humanized Botmarg Microenvironments in Mouse en hun visualisatie door Live Imaging

We presenteren een protocol om te onderzoeken het mRNA uitdrukking biomarkers voor beenvlies-afgeleide cellen (PDC's) geïnduceerd door vitamine C (vitamine C) en 1,25-dihydroxy vitamine D [1,25-(OH)2D3]. Daarnaast evalueren we het vermogen van PDC's te differentiëren in osteocytes, chondrocyten en adipocytes.

Isolatie van mesenchymale stamcellen uit menselijke alveolaire beenvlies en effecten van vitamine D op Osteogenic activiteit van beenvlies-afgeleide cellen

Bottherapie via endochondrale ossificatie door het implanteren van kunstmatig kraakbeenweefsel geproduceerd uit mesenchymale stamcellen heeft het potentieel om de nadelen van conventionele therapieën te omzeilen. Hyaluronzuurhydrogels zijn effectief bij het opschalen van uniform gedifferentieerde kraakbeentransplantaten en bij het creëren van geïntegreerd bot met vascularisatie tussen gefuseerde transplantaten in vivo.

Geïntegreerde botvorming door in vivo endochondrale ossificatie met behulp van mesenchymale stamcellen

Hier hebben we in vivo osteo-organoïden ontwikkeld die worden getriggerd door botmorfogenetische eiwit-2-geladen gelatineschars om therapeutische hematopoëtische stam-/voorlopercellen te oogsten voor de reconstructie van een beschadigd hematopoëtisch en immuunsysteem. Over het algemeen kan deze aanpak een veelbelovende celbron zijn voor celtherapieën.

In vivo osteo-organoïde benadering voor het oogsten van therapeutische hematopoëtische stam-/voorlopercellen

Leer perivasculaire stamcelimplantatie voor botregeneratie met behulp van humane PSCs uit vetweefsel. Deze methode toont significante botvorming in vivo binnen acht weken.

Gebruik van de Mens Perivasculaire stamcellen voor botregeneratie

Meer video's verkennen