Isolatie van Fidelity Varianten van RNA-virussen en Karakterisering van mutatie van de virussen Frequency

RNA-virussen maken gebruik van viraal gecodeerde RNA-polymerasen om hun genomen te repliceren. Deze polymerasen hebben een intrinsiek hogere foutmarge, waardoor het virus zich snel kan aanpassen en evolueren. Deze video presenteert een geoptimaliseerde methode om virussen te screenen en te identificeren met mutaties in hun RNA-polymerase die de foutmarge of getrouwheid tijdens replicatie beïnvloeden.

Eerst worden mutagenen toegepast op virale gastheercellen om het maximale niveau van het mutagen te bepalen dat kan worden gebruikt zonder de cellen te doden of het virus te remmen. Zodra de optimale omstandigheden zijn bepaald, wordt het virus gepassaged onder de selectieve druk van RNA-mutagenen. De mutagenenresistente populatie wordt vervolgens gesequenced om de verantwoordelijke mutatie te identificeren.

Vervolgens wordt de mutagen-resistente mutant geïsoleerd. De replicatiekinetiek wordt gemonitord en de resultaten tonen toenames of afnames in de getrouwheid van de polymerase. Dit gaat gepaard met een brede resistentie tegen RNA-mutagenen en veranderingen in de mutatiefrequentie van de viruspopulatie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals biochemische getrouwheidsmetingen met gezuiverde polymerasen, is dat deze technieken geldig zijn voor elk RNA-virus dat in kweekmedium kan worden gecultiveerd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de virologie, zoals de rol van polymerase-foutgevoeligheid bij de adaptatie en evolutie van virussen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite ondervinden omdat de door hen gehanteerde selectieve druk ofwel te sterk of te zwak is, en omdat de grootte van de geanalyseerde sequentie-regio en het aantal klonen niet zijn geoptimaliseerd voor statistische kracht.

Begin dit experiment door het bereik van mutageenconcentraties te bepalen die in de volgende experimenten kunnen worden gebruikt zonder dat dit tot celdood leidt. Aspireer het medium uit zeswellplaten met subconfluente monolagen van hilaire cellen. Voeg vervolgens twee milliliters mutageen-gesupplementeerd medium toe; hierbij worden de mutagenen ribovirine, 5-fluorouracil, 5-azacitidine, magnesiumchloride en mangaanchloride gebruikt.

Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Gebruik vervolgens elke 24 uur gedurende de volgende twee tot zeven dagen één plaat cellen om de levensvatbaarheid te controleren via trypanblauw-exclusie. Bereken met behulp van een hemocytometer het percentage levensvatbare cellen voor elke concentratie mutagen, inclusief de onbehandelde controlecondities die resulteren in minder dan 50% celsterfte aan het einde van de infectie.

Wanneer de maximale titers zijn bereikt en optimaal zijn, is de volgende stap van de procedure het bepalen van de concentratie mutagen die een optimale selectiedruk uitoefent zonder de populatie bij de juiste concentraties overmatig te muteren. Elk genoom wordt op ten minste één of twee posities gemuteerd. Het mutagen zal zo de resistentiemutatie genereren, die vervolgens tijdens de passage zal worden geselecteerd.

Als er te veel mutaties worden geïntroduceerd, zullen de mutanten die de resistentiemutatie dragen zelf letaal zijn. Het mutagen belemmert hun isolatie in zes-wellplaten gezaaid met cellen. Onze cellen in twee milliliter mutagen-gesupplementeerd medium gebruiken dezelfde concentratiebereiken als voorheen, met uitzondering van concentraties die leidden tot meer dan 50% celdood.

Incubeer gedurende twee uur om de opname van het mutagen na de incubatie mogelijk te maken. Aspireer het medium en infecteer met virus bij een lage multiplicity of infection in 200 µL; incubeer gedurende 15 tot 60 minuten om het virus de cellen te laten infecteren, waarbij de plaat met regelmatige tussenpozen wordt geschud om te garanderen dat het inoculum de cellaag bedekt. Aspireer het geïnoculeerde virus en was tweemaal met twee milliliter PBS om zoveel mogelijk van het inoculum te verwijderen.

Voeg vervolgens medium met mutagen tot elke well toe en incubeer de cellen voor het equivalent van drie tot zes replicatiecycli, gewoonlijk twee tot zeven dagen. Oogst het virus uit elke well en voer een standaard plaque-assay of limiterende verdunning uit om het antivirale effect op de virustiter te bepalen op basis van de berekende titers. Identificeer de concentratie van het mutagen die de virustiters met 0,5 tot twee logs verlaagt ten opzichte van de onbehandelde controle-infectie en die bovendien niet sterk toxisch is voor de cellen.

Bij voorkeur minder dan 50% toxiciteit om mutagen-resistente varianten te isoleren. Begin met het passeren van het virus in healer-cellen met de optimale concentratie van elk mutagen; het virus moet mogelijk tot 30 keer gepasseerd worden. Bepaal bij elke passage de virustiter en herhaal de infectie en incubatie met mutagen zoals hier getoond. De virustiters van mutagen-behandelde monsters zouden tijdens de eerste paar passages moeten dalen in vergelijking met de oorspronkelijke virustiter en de titers van het onbehandelde controlevirus. Zodra de virustiters voor een bepaalde reeks dezelfde grootte bereiken als de titers van de onbehandelde controle, duidt dit op resistentie.

Extraheer het virale RNA voor sequencing met behulp van primers die de polymerase- of replicatiegenen van het betreffende virus amplificeren. Genereer cDNA van het virale genoom via RT-PCR en sequence vervolgens het DNA. Zodra de sequentie-informatie is verkregen.

Gebruik alignmentsoftware om de resulterende sequenties uit te lijnen met de referentieconsensus en identificeer de nieuwe puntmutaties. Controleer daarnaast de chromatogrammen op minderheidspieken die mogelijk door de alignmentsoftware zijn gemist. Een mutant die 20 tot 30% van de totale populatie vertegenwoordigt, zal nog steeds als piek zichtbaar zijn, maar is te klein om bij een standaard sequentieanalyse als gemengd nucleotide te worden geïdentificeerd. Om de mutatie van belang te identificeren, moet er worden gezocht naar enkelvoudige nucleotidepolymorfismen die uitsluitend voorkomen in de met mutagenen behandelde populatie vergeleken met de onbehandelde controle van dezelfde passage, zoals hier wordt getoond. Zodra een mutatie is geïdentificeerd, moet de resistente variant worden geregenereerd vanuit infectieus cDNA of worden geïsoleerd in weefselkweek, waarna het resistentiefenotype moet worden bevestigd.

Hier passen we een plaque-assay toe om de geïdentificeerde mutanten te isoleren. Bereid een seriële verdunning van het stikstofresistente monster voor en voeg deze toe aan celmonolagen op zeswellplaten voor een plaque-assay, na een incubatie van één uur bij 37 °C en 5% CO₂. Voeg twee tot vijf dagen na infectie een agarose-overlay toe.

Plaques moeten duidelijk zichtbaar zijn. Idealiter produceert een van de platen tussen de 10 en 50 goed gescheiden plaques. Markeer de locatie van de plaques op de plaat met een stip met behulp van een marker; zorg er hierbij voor dat de overlays niet verschuiven of loskomen door voorzichtig een P 200 filtertip door de agarose-overlay te steken.

Om de plaque te bereiken, tilt u de punt voorzichtig uit de overlay en brengt u de aros-plug over naar een microcentrifugebuis met 250 µL medium. Er zal een voldoende hoeveelheid virus worden overgedragen, ongeacht of de aros-plug uit de punt wordt bevrijd; vortex de buis en neem tot tien keer per behandeling op. Bewaar een deel van het monster om het levende virus later te amplificeren.

Extraheer vervolgens het RNA uit het resterende deel van het monster en voer R-T-P-C-R uit om de plaque-sample te identificeren die de gewenste mutatie bevat. Sequence het cDNA. Controleer of er geen aanvullende mutaties aanwezig zijn.

Maak vervolgens een grotere voorraad van dit virus voor alle daaropvolgende studies. Bevestig daarna de resistentie die door de geïdentificeerde mutatie wordt verleend. Herhaal de mutagenese-assay onder verschillende mutagene condities.

Als de variant resistent is tegen meerdere mutagenen, heeft deze waarschijnlijk een verhoogde getrouwheid. Aangezien mutaties die de getrouwheid beïnvloeden in de polymerase gelokaliseerd zijn, is het belangrijk om te bevestigen dat de replicatiekinetiek niet significant is gewijzigd. Voordat de mutatiefrequenties worden bepaald, dient de replicatie te worden onderzocht via ten minste twee complementaire benaderingen.

Bijvoorbeeld kan een methode die de virusproductie onderzoekt, zoals een plaque-assay of TCID 50, worden uitgevoerd in aanvulling op een methode die de RNA-synthese onderzoekt, zoals kwantitatieve R-T-P-C-R of een northern blot. Vervolgens worden de frequenties van getrouwheidsmutaties gemeten om te bevestigen dat de geïdentificeerde polymeraseverandering die resistentie tegen mutagenen verleent, de replicatie beïnvloedt. Dit kan worden uitgevoerd op zowel de levensvatbare als de totale viruspopulatie.

Om de mutatiefrequenties van de totale viruspopulatie te bepalen, inclusief levensvatbare en niet-levensvatbare varianten, wordt het RNA geëxtraheerd en een regio van 800 tot 1.200 nucleotiden uit een coderende sequentie die bekend staat om genetische varianten, zoals die voor een structureel eiwit, via RT-PCR geamplificeerd. Vervolgens wordt het gezuiverde product voor elke te bestuderen viruspopulatie via topo TA-cloning gekloond. Selecteer 96 kolonies die door middel van blue-white screening op X-gal-gecoate platen zijn geïdentificeerd als positief voor een insert.

Voer een single colony PCR uit om de validiteit van de blauw-wit screening te bevestigen. Op basis van de fragmentgrootte en de bovenstaande condities zou ongeveer 90% van de kolonies positief moeten zijn. Gebruik voor elke positieve witte kolonie een tandenstoker om elke kolonie over te brengen naar één milliliter LB-medium in een 96-wells plaat.

Incubeer de bacteriële cultuurplaten overnacht bij 37 °C onder constant schudden. Isoleer de volgende dag het DNA door mini-preps voor te bereiden in een 96-well formaat en sequenceer elke plaat met voldoende primers om maximale dekking van het gekloonde segment te verkrijgen.

Twee primers met een dekking van 600 basen zouden voldoende moeten zijn. Voer de sequentieanalyse uit met behulp van een referentie- of consensussequentie voor elke populatie en geschikte alignment-software die hier gemakkelijk enkelnucleotide-polymorfismen kan identificeren. Raadpleeg software van DNA star laser.

Gene wordt eerst gebruikt om sequenties van slechte kwaliteit te verwijderen, zoals sequenties met foutieve base calling, te veel uiteinden of sequenties met een te korte lengte. Lijn de resterende sequenties uit. Identificeer het nucleotidebereik dat door alle sequenties in de analyse wordt gedekt.

Verwerp klonen die niet volledig gedekt zijn over deze regio. Om vergelijkingsredenen is het essentieel dat dezelfde regio volledig gedekt is. Identificeer en tel de enkelnucleotidepolymorfismen die verschillen van de referentiestam.

Bereken de mutatiefrequentie door het totaal aantal enkelvoudige nucleotidepolymorfismen te delen door het totaal aantal gesequentieerde nucleotiden. Presenteer dit getal als het gemiddelde aantal mutaties per 10.000 gesequentieerde nucleotiden. Indien hetzelfde enkelvoudige nucleotidepolymorfisme voorkomt in een groot aantal klonen, presenteer dan twee waarden: één inclusief en één exclusief deze herhaalde mutaties.

Bepaal de mutatieverdeling. Maak een gerangschikte lijst van het aantal klonen in elke populatie dat 0, 1, 2, 3 enzovoort mutaties vertoont. Mutaties in de gesequentieerde regio als optie.

Gebruik de bewerkte sequenties om alle mogelijke paarsgewijze vergelijkingen binnen een monster te berekenen om gemiddelde waarden van de populatiediversiteit te verkrijgen. Hiervoor zijn verschillende alignment-programma's beschikbaar. Het programma voor moleculaire evolutionaire genetica-analyse, ook wel mega genoemd, wordt gebruikt om de optimale condities te bepalen voor de selectie van RNA-mutageenresistentie.

Onze cellen werden behandeld met toenemende concentraties ribovirine en geïnfecteerd met wild-type Cox AKI B virus met een multipliciteit van infectie van 0,0 1 48 uur na infectie. Het nakomstvirus werd geoogst en de titers werden bepaald via TCID₅₀. Deze figuur geeft het percentage cellen aan dat de behandeling heeft overleefd, onderaan de x-as aangegeven, bepaald door trypaanblauw-kleuring 48 uur na infectie.

De resultaten laten zien dat concentraties van 100 en 200 micromolair de virustiter met één tot twee log verminderen zonder de celviabiliteit te beïnvloeden. Om mutagen-resistente populaties te selecteren, werd het CHI-gangavirus gekweekt in hilar-cellen in aanwezigheid van (grijze balken) of afwezigheid van (zwarte balken) 50 micromolair ribavirine; na elke passage werd het nakomelingenvirus gekwantificeerd via een klassieke plaque-assay op BHK-cellen, zoals hier te zien is. Het mutagene effect is duidelijk tijdens de eerste passages, waarbij de behandelde virustiter met twee log daalde.

Geleidelijk keerde de titers terug naar normale, onbehandelde niveaus. Er zijn geen significante verschillen waargenomen in vijf met mutagenen behandelde populaties vergeleken met onbehandelde populaties, wat suggereert dat resistente varianten zijn geselecteerd. Sequencing identificeerde inderdaad unieke mutaties in de viruspopulatie die een ribovirin-behandeling onderging om brede resistentie tegen RNA-mutagenen van verschillende structuren te bevestigen; de high-fidelity A 3 72 V variant van COA virus B three, die aanvankelijk bij de screening was geïsoleerd, werd getest op verminderde gevoeligheid voor verschillende concentraties van de RNA-mutagenen RIBOVIRIN, vijf-fluorouracil en vijf-azacitidine.

Hiermee werden onze cellen behandeld met de aangegeven concentraties ribavirine en geïnfecteerd met wild-type Cox AKI-virus B drie bij een multipliciteit van infectie van 0,01. 48 uur na infectie werd het nakomelingenvirus geoogst en werden de titers bepaald via TCID₅₀. Hier worden de titers van het wild-type en een A372-variant weergegeven als functie van de mutageenconcentratie. A372V vertoonde consequent hogere titers dan het wild-type.

Onder alle geteste condities om de groeikinetiek van de virusproductie in één stap te bepalen, werden onze cellen geïnfecteerd met een multipliciteit van infectie van 10 met óf het wildtype, de high-fidelity variant A 3 72 V, óf de replicatiedeficiënte variant CX 64 van het Cox AKI virus B drie. Op de aangegeven tijdstippen werd virusnageslacht geoogst uit cellen en supernatanten door middel van vries-dooi cycli en getitreerd via TCID₅₀. De toename in getrouwheid van A 3 72 V gaat niet gepaard met een waarneembaar replicatiedefect in weefselkweek. De variant CX 64 vertoont een aanzienlijke vertraging in de replicatiekinetiek en bereikt maximale titers die 1000 maal lager zijn dan die van het wildtypevirus.

Met de in deze video beschreven aanpak is elke gesequentiede kloon afkomstig van een uniek genoom binnen de totale viruspopulatie en draagt deze dus unieke mutaties. Deze figuur toont een typische alignment na het opschonen van sequenties van slechte kwaliteit en de visualisatie van enkelvoudige nucleotidepolymorfismen. De totale hoeveelheid enkelvoudige nucleotidepolymorfismen binnen een populatie is geteld en het aantal enkelvoudige nucleotidepolymorfismen dat in elke kloon voorkomt is genoteerd.

Bijvoorbeeld, de kloon die is onderstreept met een balk bevat twee unieke mutaties, terwijl acht andere klonen een enkele unieke mutatie bevatten. Deze gegevens worden gebruikt om een tabel op te stellen, zoals de hier getoonde tabel. De tabel toont de gerangschikte distributie van gesequentieerde klonen op basis van het aantal mutaties.

Een statistische vergelijking van gerangschikte waarden kan bepalen of de ene distributie significant verschilt van de andere. Voor een eenvoudigere interpretatie kunnen de numerieke gegevens uit de sequentie- en statistische analyse worden weergegeven als een grafiek of histogram. Zoals hier is te zien, genereert het A 3 72 V-virus minder mutaties dan het wildtype en vertoont het een significant lagere mutatiefrequentie met een P-waarde van minder dan 0,01.

Dezelfde populatie van het chicken ganga-virus geeft vergelijkbare mutatiefrequenties, ongeacht of de virusstock of een verdunning van 10⁵ wordt gebruikt voor RNA-extractie. Na het volgen van deze procedure kunt u in vitro biochemische assays of kristallisatieonderzoeken uitvoeren om de mechanistische en structurele basis van de getrouwheid in deze polymerasevariant beter te begrijpen.

Na deze ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers in het veld van de biologie om de correlatie tussen genetische diversiteit en de fitness van virussen in vivo te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u de kansen op het isoleren van fidelity-varianten van RNA-virussen kunt vergroten en hoe u mutatiefrequenties kunt gebruiken om deze verschillen in fidelity te identificeren.