Voorbereiden E18 Corticale Rat Neuronen voor Compartimentering in een microfluïdische apparaat
October 1st, 2007
In deze video laten we zien de voorbereiding van de E18 Corticale Rat neuronen.
Hallo en welkom in het laboratorium van Dr. Newly John. In een eerder video hebben we laten zien hoe we het neuronapparaat vervaardigen, een platform dat de onderzoeker in staat stelt om de cellichamen van de neuronen te scheiden van een pure axonale fractie. Zachte litografie is de techniek die wordt gebruikt om de apparaten te maken, die bestaat uit het gieten en uitharden van PDMS op een siliconenwafer met het apparaatsontwerp dat eerder werd vervaardigd met behulp van fotolitografie.
In deze video zullen we de voorbereiding van spro dolly E 18 corticale ratneuronen demonstreren, en hoe de neuronen in het neuronapparaat worden geladen. Ik wil je voorstellen aan Kiana Lee. Zij zal de demonstraties vandaag doen.
Voordat we beginnen, is het belangrijk om alle benodigde media en reagentia warm te hebben tot 37 graden in het waterbad. Je kunt neuro basale media 0,25% trypsine en DMEM met 10% FBS zien. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat alles wat in de kap wordt geplaatst om de cellen te repareren, gesteriliseerd is en wordt schoongemaakt met 70% ethanol.
Eerst wordt de weefselkweekkap schoongemaakt met 70% ethanol. Vervolgens worden de plastic rekken die worden gebruikt om buizen vast te houden, besproeid met ethanol. Vervolgens wordt de rubberen bal die wordt gebruikt in het tri strittingsproces, gereinigd met ethanol.
Het is belangrijk om dit vroeg te doen, zodat het voldoende tijd heeft om te drogen. Vervolgens worden de noodzakelijke reagentia schoongemaakt met ethanol en verplaatst naar de kap. Twee stukken van E 18 foetaal rattencortex die één hersenen vertegenwoordigen die eerder werden gedissecteerd, worden in een 15 ml buis geplaatst die één ml ijskoud, calciumvrij, magnesiumvrij dissectiebuffer bevat, één ml van 0,25% tripsin EDTA wordt toegevoegd aan de cortex in de dissectiebuffer, waardoor het eindvolume twee molen en de uiteindelijke tryineconcentratie 0,125% is. De 15 ml buis met de cortex waaraan nu trypsine is toegevoegd, wordt dan geplaatst in een 37 graden waterbad gedurende acht minuten, terwijl de foetale cortex wordt geïncubeerd bij 37 graden in trypsine.
Drie paste pipetten worden vuur gepolijst. De punt van de glazen pipet wordt in contact gebracht met de vlam in de buurt van het blauwe gedeelte van de vlam en langzaam geroteerd totdat alleen de opening oranje wordt. Terwijl het oranje werd.
Het is belangrijk om de glazen pipet te blijven roteren zodat deze niet instort. Merk op dat de openingen van de glazen pipetten achtereenvolgens kleiner zijn. Het is ook belangrijk om te weten dat u de openingen niet te klein wilt maken, omdat dit kan leiden tot lysis van de cellen nadat de cortex acht minuten is geïncubeerd bij 37 graden met de trypsine. 10 ml DMEM met 10% FBS wordt toegevoegd aan de cortex om de trypsinereactie te stoppen.
De 15 ml buis met de cortex en DMEM 10% FBS wordt gecentrifugeerd bij 2.500 RPM gedurende twee minuten. In de bioveiligheidskast wordt vacuümzuiging aan een glazen pipet gebruikt om het supernatant van de cortex te verwijderen. Wees voorzichtig om de pellet niet te verstoren of los te maken.
Eén ml neurale basale media met B 27 en glutamaat wordt toegevoegd aan de cortexpellet en voorzichtig op en neer gepipetteerd. Het is erg belangrijk om geen luchtbellen te creëren tijdens het op en neer pipetten, omdat de luchtbellen de cellen kunnen beschadigen door oxidatie. Vervolgens wordt de vuur gepolijste achterste pipet met de breedste opening gebruikt om de cortex te trieren door een steriele rubberen knop aan het uiteinde van de pipet te bevestigen en ongeveer vijf keer op en neer te pipetten.
Wees voorzichtig om geen luchtbellen te introduceren. Oké. Het proces is voortgezet met de andere twee glazen pipetten, elk met de verminderde openingsgrootte. Zoals eerder vermeld, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat er geen bubbels worden geïntroduceerd tijdens het tri strittingsproces.
Je zou ook moeten opmerken dat je geen zichtbare brokken meer ziet. Het is belangrijk om te blijven trieren totdat je geen brokken van de cortex meer kunt zien in de media. Na trieren worden de cellen opnieuw gecentrifugeerd bij 2.500 RPM gedurende twee minuten.
Dit is ongeveer de geschatte grootte van de pellet die men zou verwachten van twee stukken cortex. Na centrifugatie wordt de supernatant opnieuw verwijderd uit de celpellet. Nadat de supernatant is verwijderd, wordt één ml neuro basale media met B 27 en glutamaat toegevoegd aan de cortex en gebruikt om de cortex opnieuw op te schorsen.
De celpellet wordt opnieuw voorzichtig op en neer gepipetteerd om te voorkomen dat er bellen worden toegevoegd en om ervoor te zorgen dat de celpellet gelijkmatig wordt verdeeld en wordt opgebroken. Eén meer mil van neuro basale media wordt toegevoegd aan de celsuspensie, waardoor het eindvolume twee mil wordt. Vervolgens wordt de geresuspendeerde celoplossing gefilterd door een BD biosciences 40 micron celzeef naast het tellen van de cellen en het beoordelen van de levensvatbaarheid.
60 microliter verse neurale basale media wordt geplaatst in een steriele micro fugebuis. 20 microliter cellen worden vervolgens toegevoegd aan de 60 microliter neuro basale media en ten slotte worden 20 microliter trian blauw toegevoegd aan de cellen in de neuro basale media. Het trian blauw zal cellen kleuren die niet langer in leven zijn nadat de cellen zijn gekleurd met trian blauw.
We pipetten 20 microliter op een hemo cytometer en bekijken ze onder de microscoop. Levende cellen zien er helder en doorschijnend uit, terwijl cellen waarvan de membranen zijn doorboord, blauw kleuren vanwege het trian blauw. Meestal verkrijgen we ongeveer 2,5 miljoen cellen en 8 miljoen cellen per cortex.
We verkrijgen normaal gesproken twee stukken van de cortex uit één hersenen met de cellen opgeschort in een eindvolume van twee mil. Daarom is de eindconcentratie van cellen typisch tussen 2,5 miljoen cellen per mil en 8 miljoen cellen per mil. Norma
Overzicht
Deze video toont de voorbereiding van E18 corticale ratneuronen, met gedetailleerde stappen om de succesvolle isolatie en het laden van neuronen in een neuronapparaat te garanderen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Neurobiologische technieken
Achtergrond
- Isolatie van neuronen is cruciaal voor diverse onderzoekstoepassingen.
- Zachte litografie wordt gebruikt om apparaten voor neuronscheiding te maken.
- Juiste sterilisatie en voorbereiding van reagentia zijn essentieel voor cellevensvatbaarheid.
- Trypsine wordt gebruikt om corticaal weefsel te dissociëren voor neuronextractie.
Doel van het onderzoek
- Om de stapsgewijze voorbereiding van E18 corticale ratneuronen te demonstreren.
- Om ervoor te zorgen dat onderzoekers neuronen effectief in gespecialiseerde apparaten kunnen laden.
- Om de belangrijkheid van het handhaven van steriliteit gedurende het hele proces te benadrukken.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van dissectiebuffer en trypsinoplossing.
- Incubatie van corticaal weefsel in trypsine voor celdissociatie.
- Gebruik van vuurgeslepen pipetten voor zorgvuldige celbehandeling.
- Celtelling en levensvatbaarheidsbeoordeling met behulp van trypanblauwkleuring.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van ongeveer 2,5 tot 8 miljoen cellen per cortex.
- Levensvatbare cellen werden onderscheiden van niet-levensvatbare cellen met behulp van trypanblauw.
- Cellen werden effectief in apparaten geladen voor verdere experimenten.
- Het handhaven van een juiste celdichtheid is cruciaal voor experimenteel succes.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het bereiden van corticale neuronen.
- Aandacht voor detail in het voorbereidingsproces verbetert de cellevensvatbaarheid.
- Deze techniek is essentieel voor het bevorderen van neurowetenschappelijk onderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Preparing primary cortical neurons for microfluidic compartmentalization enables precise separation of somatodendritic and axonal compartments, supporting mechanistic studies of axonal transport, degeneration, and regeneration. This approach enhances predictive confidence in target validation by isolating axon-specific responses from somatic influences, reducing confounding variables in early discovery. The method supports de-risking of neurodegenerative and neurodevelopmental targets through reproducible, quantitative axonal readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of axon-autonomous mechanisms by isolating pure axonal fractions from cell bodies.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation studies through compartment-specific readouts.
- Predictive Value: Supports assessment of compound effects on axonal integrity independent of somatic toxicity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized neuronal preparations with quantifiable axonal outgrowth and degeneration metrics.
- Operational Value: Enables reproducible loading of defined cell densities into microfluidic devices for assay consistency.
- Scalability: Supports parallel device loading for medium-format screening of axonal modulators.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human axonal pathology in a disease-relevant system using primary rodent neurons.
- Operational Value: Facilitates longitudinal tracking of axonal responses over days in culture.
- Translational Continuity: Bridges in vitro mechanistic findings to in vivo axonal degeneration models.
Pipeline & Workflow Integration
The neuron preparation workflow fits within early discovery to enable axon-focused assay development prior to lead optimization, providing mechanistic de-risking for targets implicated in axonal transport or structural integrity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of axon-specific pathways by isolating axonal compartment responses.
- Screening: Delivers axon-enriched fractions for reliable compound screening with reduced somatic interference.
- Analytics: Enables quantitative axonal measurements via fluorescence or biochemical readouts in isolated compartments.
- Translational Research: Aligns with preclinical models of axonal injury through conserved degeneration readouts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable neuronal platform for iterative target interrogation across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in axon-specific target engagement and pathway modulation.
- Operational Value: Standardized neuron dissociation and loading protocols improve inter-experiment reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by de-risking axon-related mechanisms early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables prioritization of targets with strong axonal phenotypic validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary neuron culture and aseptic technique.
- Depends on access to microfluidic devices and fluorescence imaging systems.
- Necessitates standardization of trypsin dissociation and trypan blue viability assessment across teams.
- Adaptation to human iPSC-derived neurons may require protocol optimization for dissociation efficiency.
- Practical limitation: Neuronal viability declines if cortex storage exceeds 48 hours, necessitating timely processing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
7:26
Loading Cortical Neurons into the Microfluidic Device
4:14
Triturating E18 Fetal Rat Cortex
0:00
Title
0:03
Introduction
9:37
Performing Axotomy for Axonal Regeneration Studies
11:20
Conclusion
8:56
Visualizing Compartmentalized Cortical Neurons
1:46
Trypsinizing E18 Fetal Rat Cortex
0:47
Preparing Tools and Reagents
