Voorbereiden E18 Corticale Rat Neuronen voor Compartimentering in een microfluïdische apparaat

Hallo en welkom in het laboratorium van Dr. Newly John. In een eerdere video hebben we aangetoond hoe we het neuron-apparaat vervaardigen, een platform waarmee de onderzoeker de cellichamen van de neuronen kan scheiden van een zuivere axonale fractie. Soft-lithografie is de gebruikte techniek om de apparaten te maken, welke bestaat uit het gieten en uitharden van PDMS op een siliciumwafer met het ontwerp van het apparaat dat eerder met fotolithografie is vervaardigd.

In deze video demonstreren we de preparatie van spro dolly E 18 corticale ratneuronen en hoe u de neuronen in het neuronapparaat kunt laden. Ik stel u graag voor aan Kiana Lee. Zij zal de demonstraties vandaag uitvoeren.

Voordat u begint, is het belangrijk dat alle benodigde media en reagentia op 37 °C zijn gebracht in het waterbad. U ziet neurobasale media, 0,25% trypsine en DMEM met 10% FBS. Het is essentieel om ervoor te zorgen dat alles wat in de laminaire flowkast wordt geplaatst voor het herstellen van de cellen, gesteriliseerd is en is afgeveegd met 70% ethanol.

Eerst wordt de weefkweekkap afgeveegd met 70% ethanol. Vervolgens worden de plastic rekken die worden gebruikt om buizen vast te houden, besproeid met ethanol. Daarna wordt de rubberen bal die wordt gebruikt bij het tri-streakproces gereinigd met ethanol.

Het is belangrijk om dit vroegtijdig te doen, zodat er voldoende tijd is om te drogen. Vervolgens worden de benodigde reagentia afgeveegd met ethanol en naar de zuurkast verplaatst. Twee stukken E 18 foetale ratcortex, afkomstig van één eerder gedissecteerd brein, worden geplaatst in een 15 ml buis met 1 ml ijskoude, calcium- en magnesiumvrije dissectiebuffer. Er wordt 1 ml 0,25% trypsin EDTA toegevoegd aan de cortex in de dissectiebuffer, waardoor het eindvolume 2 ml wordt en de uiteindelijke trypsineconcentratie 0,125%. De 15 ml buis met de cortex en de toegevoegde trypsine wordt vervolgens gedurende acht minuten in een waterbad van 37 °C geplaatst, terwijl de foetale cortex in de trypsine bij 37 °C incubeert.

Drie pasteipetten worden vuurgepolijst. De punt van de glazen pipet wordt in contact gebracht met de vlam, nabij het blauwe gedeelte, en langzaam gedraaid totdat alleen de opening oranje wordt. Terwijl deze oranje kleur kreeg.

Het is belangrijk om de glazen pipet te blijven draaien zodat deze niet inklapt. Let op dat de openingen van de glazen pipetten opeenvolgend kleiner worden. Het is ook belangrijk om erop te merken dat de openingen niet te klein mogen worden gemaakt, omdat dit kan leiden tot lysis van de cellen nadat de cortex gedurende acht minuten bij 37 °C met trypsine is geïncubeerd. Er worden 10 mL DMEM met 10% FBS toegevoegd aan de cortex om de trypsinereactie te helpen stoppen.

De 15 ml buis met de cortex en DMEM 10%FBS wordt gedecentrifugeerd bij 2.500 RPM gedurende twee minuten. In de veiligheidskast wordt een vacuümsysteem met een glaspipet gebruikt om het supernatant van de cortex te verwijderen, waarbij zorgvuldig wordt gewaakt over het niet verstoren of verschuiven van het pellet.

Eén ml neuraal basaal medium met B 27 en glutamaat wordt toegevoegd aan het cortexpellet en voorzichtig op en neer gepipetteerd. Het is zeer belangrijk om tijdens het pipetteren geen luchtbellen te creëren, aangezien luchtbellen de cellen door oxidatie kunnen beschadigen. Vervolgens wordt de vuurgepolijste posterieure pipette met de breedste opening gebruikt om de cortex te tritureren door een steriele rubberen peer aan het uiteinde van de pipette te bevestigen en ongeveer vijf keer op en neer te pipetteren.

Wees voorzichtig om geen luchtbellen te introduceren. Oké. Het proces is voortgezet met de andere twee glazen pipetten, elk met een kleinere opening. Zoals eerder vermeld, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat er geen bellen worden geïntroduceerd tijdens het striatproces.

U zult ook merken dat er geen zichtbare brokken meer te zien zijn. Het is belangrijk om door te gaan met het tritureren totdat er geen brokken van de cortex meer zichtbaar zijn in het medium. Na agitatie worden de cellen opnieuw gecentrifugeerd bij 2.500 RPM gedurende twee minuten.

Dit is de geschatte grootte van het pellet dat men van twee stukken cortex kan verwachten. Na centrifugatie wordt het supernatant opnieuw verwijderd van het celpellet. Nadat het supernatant is verwijderd, wordt één ml neurobasaal medium met B 27 en glutamaat aan de cortex toegevoegd om de cortex te resuspenderen.

Het celpellet wordt opnieuw voorzichtig gepipetteerd om luchtbellen te vermijden en om ervoor te zorgen dat het celpellet gelijkmatig is verdeeld en is opgebroken. Er wordt nog 1 ml neurobasaal medium aan de celsuspensie toegevoegd, waardoor het uiteindelijke volume 2 ml bedraagt. Vervolgens wordt de resuspendeerde celoplossing gefiltreerd door een BD biosciences 40 micron celzeef om de cellen te tellen en de levensvatbaarheid te beoordelen.

60 µL vers neuraal basaal medium wordt in een steriele microcentrifugebuis geplaatst. Vervolgens worden 20 µL cellen toegevoegd aan de 60 µL neuraal basaal medium, en tot slot worden 20 µL trypaanblauw toegevoegd aan de cellen in het neuraal basaal medium. Het trypaanblauw zal de cellen kleuren die niet meer in leven zijn nadat de cellen met trypaanblauw zijn gekleurd.

We pipetteren 20 µL op een hemocytometer en bekijken deze onder de microscoop. Levensvatbare cellen zien er helder en doorschijnend uit, terwijl cellen met geperforeerde membranen blauw kleuren door het trypaanblauw. Typisch verkrijgen we ongeveer 2,5 miljoen cellen en 8 miljoen cellen per cortex.

Normaal gesproken verkrijgen we twee stukken cortex uit één brein, waarbij de cellen worden resuspendeerd in een eindvolume van 2 ml. Hierdoor ligt de uiteindelijke celconcentratie doorgaans tussen 2,5 miljoen cellen per ml en 8 miljoen cellen per ml. Gewoonlijk laden we ongeveer 20 µL cellen per device.

Dit geeft ons een bereik van 50 000 cellen tot 160 000 cellen per device. De celdichtheden kunnen worden gevarieerd afhankelijk van de toepassing. Het zaaien van primaire neuronen bij een te lage dichtheid leidt echter doorgaans tot celdood. Voorheen bereide devices die neurale basale media bevatten, worden in de biologische veiligheidskabinet geplaatst om de steriliteit te waarborgen.

Overtollig medium uit de wells wordt verwijderd met een vacuümsectie. Let er echter op dat niet al het medium wordt verwijderd. Er moet wat medium in het hoofdkanaal achterblijven; aspireer alleen medium uit de reservoirs.

Slechts 20 µL cellen wordt aangebracht in het linkerbovenreservoir van het apparaat. De cellen stromen het apparaat binnen en hechten zich aan het met PLL behandelde oppervlak. Hier ziet u de cellen terwijl ze door het hoofdkanaal stromen, en u zult zien dat sommige van hen zich daadwerkelijk aan het glas hechten.

Na het laden worden de apparaten met de cellen gedurende ongeveer 10 minuten teruggeplaatst in een incubator om de cellen de gelegenheid te geven zich te hechten. Na 10 minuten in de incubator worden de apparaten opnieuw in de veiligheidskast geplaatst, worden de reservoirs gevuld met medium en worden de apparaten vervolgens teruggeplaatst in de incubator. Een belangrijk punt om op te merken is dat het medium in de apparaten elke twee tot drie dagen vervangen moet worden, afhankelijk van de incubator en de benodigde luchtvochtigheid.

Het is goede praktijk om vers medium in de bovenste putjes te plaatsen en een deel van het verse medium door het apparaat en in de hoofdkanalen te laten stromen voordat alle reservoirs worden gevuld. De neuronen worden hier gevisualiseerd met calcium am, een celpermeabele kleurstof die levende cellen kleurt. Hier ziet u het zo-compartiment of de celzijde van het apparaat, waarin de cellichamen, axonen en dendrieten zich bevinden.

Terwijl we over het apparaat bewegen, zijn de microgroeven te zien waar de axonen doorheen groeien om de andere kant van het apparaat te bereiken, de axonzijde, die een zuivere axonale fractie bevat. Ter illustratie zullen deze fluorescentie-gelabelde cellen worden gebruikt om de axotomieprocedure weer te geven.

Een van de eigenschappen van het neuron-apparaat is dat het de onderzoeker in staat stelt om axotomie uit te voeren, wat het doorsnijden van de axonen uit de zuivere axonale fractie van het apparaat inhoudt. Dit is nodig om onderzoek uit te voeren, zoals het bestuderen van axonale regeneratie. Keano zal nu demonstreren hoe axotomie in het neuron-apparaat wordt uitgevoerd; axotomie wordt gerealiseerd door middel van een vacuüm.

Een steriele glazen pipet wordt geplaatst bij de onderste opening van de well aan de axonale zijde, waarna het medium met een vacuüm wordt afgezogen. Al het medium wordt volledig verwijderd van de axonale zijde van het apparaat, inclusief het medium in het hoofdkanaal. Om het proces te herhalen nadat het medium is verwijderd, worden 150 µL medium in het hoofdkanaal geperst door de punt van de pipet bij de opening van het hoofdkanaal te plaatsen en de pipet met kracht in te drukken.

Vervolgens wordt er vacuüm aangelegd op de opening van het hoofdkanaal en de bovenste put van de axonale zijde van het apparaat. Vacuüm wordt opnieuw gebruikt om al het medium van de axonale zijde te verwijderen, inclusief uit het hoofdkanaal. Opnieuw worden 150 µL medium in het hoofdkanaal geperst door de pipetpunt op de opening van het hoofdkanaal te plaatsen en de pipet met kracht in te drukken.

Op dit punt kan de onderzoeker het apparaat onder een microscoop bekijken om de efficiëntie van het doorsnijden van de axonen te controleren. Als de axonen onvoldoende zijn doorgesneden, kan het proces naar behoefte opnieuw worden herhaald. In deze video hebben we u laten zien hoe u corticale neuronen van een foetaal rattenembryo van E 18 prepareert en deze in het neuron-apparaat laadt.

Het belangrijkste voordeel van deze apparaten is de mogelijkheid om de kweek van de neuronale cellichamen aan één zijde van het apparaat te scheiden en te compartimenteren van een zuivere axonale fractie aan de andere zijde van het apparaat. We hopen dat u deze video informatief en nuttig heeft gevonden. Dat was alles vanuit het John Lab.

Bedankt voor het kijken.