Menselijk In Vitro Onderdrukking als Screening Tool voor de erkenning van een vroege staat van Immune Imbalance

Het algemene doel van deze procedure is om een in vitro menselijke suppressie-assay te gebruiken om de treg-functie te meten en om mogelijk toekomstig functieverlies te voorzien. Dit wordt bereikt door eerst gecodeerde beads voor te bereiden en te testen, die als celstimulatoren zullen dienen. De tweede stap is het isoleren van zuivere naïeve CD4-positieve CD25-negatieve T-cellen, in vivo geactiveerde CD4-positieve CD25-lage T-cellen en regulatoire CD4-positieve CD25-hoge T-cellen, evenals bestraalde PB-BMCs voor gebruik als antigeen-presenterende cellen of APC's.

Vervolgens worden monoculturen opgezet van naïeve of geactiveerde T-cellen als responders met P BMC's als APC's, of coculturen onder dezelfde omstandigheden, maar met de toevoeging van tregs in een ratio van 1:10. De laatste stap is het oogsten van de cellen en het meten van hun proliferatie via de incorporatie van getritieerd thymidine. De uiteindelijk verkregen resultaten kunnen verschillen aantonen in de suppressie van naïeve versus in vivo geactiveerde T-celresponsen.

Mijn naam is Jeff Woodcliff. Regulatieve T-cellen brengen geen unieke celoppervlaktemarkers tot expressie. Daarom moeten ze, om hun functie betrouwbaar te kunnen meten, worden geïsoleerd met technieken die de beste scheiding bieden.

Het belangrijkste voordeel van het gebruik van fluorescentie-geactiveerde cel-sortering ten opzichte van andere methoden, zoals magnetische isolatie, is de zuiverheid van de celpopulaties die met FACS kan worden bereikt. De celfunctie kan vervolgens betrouwbaar worden getest in in vitro suppressie-assays, zoals hier gedemonstreerd. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de Treg-functie bij gezonde personen en subjecten met type 1 diabetes, kan het ook worden toegepast op andere auto-immuunziekten, zoals humane reumatoïde artritis, systemische lupus erythematosus, multiple sclerose en andere ziekten. Om cocktail-geactiveerde beads te coaten met anti-humaan CD3.

Voeg één milliliter van de M four 50 toil geactiveerde beads uit de oorspronkelijke vial toe aan een 1,5 milliliter buis en plaats de buis in een magnetische standaard totdat alle beads tegen de wand van de buis zijn aangehecht. Verwijder vervolgens de bead-buffer door deze weg te pipetteren terwijl de buis nog in de magnetische standaard staat. Haal daarna de buis uit de magnetische standaard en voeg één milliliter buffer één toe.

Plaats de buis herhaaldelijk in de magnetische houder. Verwijder de buffer terwijl de buis in de magnetische houder staat. Resuspendeer de beads opnieuw in 1 mL buffer één.

Voeg nu ook 40 µL anti-human CD3 toe. Agiteer de beads en het antilichaam 15 minuten bij 37 °C. Voeg vervolgens 0,1% w/v BSA toe en ga nog 16 uur door met agiteren.

Was daarna de kraaltjes twee keer met buffer twee door de kraaltjes vijf minuten lang te incuberen in één milliliter buffer twee bij twee tot acht graden Celsius, waarna de buffer wordt verwijderd terwijl de buis in de magnetische houder staat. Was de kraaltjes vervolgens nog één keer onder dezelfde steriele omstandigheden.

Test nu de efficiëntie van de antilichaamcoating met één milliliter van buffer drie door een variabel aantal CD3-gecoate beads per cel toe te voegen om de optimale ratio en ALI te bepalen, waarbij 50.000 PBMC's per well in triplicaat in een 96-wellplaat worden gebruikt. Voeg na 72 uur kweek bij 37 °C één microcurie tritiumgelabelde thymidine toe en incubeer nogmaals 16 uur. Oogst de cellen in een multi-screen oogstplaat of een vergelijkbaar alternatief.

Voeg scintillatievloeistof toe en lees het aantal counts per minute of CPM per put af. Bepaal met een TopCount NXT-scintillatieteller, of een vergelijkbaar apparaat, de verhouding tussen kralen en cellen; op basis van onze ervaring geeft de verhouding die consistent een CPM boven de 5 000, maar onder de 15 000 oplevert, het beste resultaat. Een verhouding van drie kralen per cel geeft gewoonlijk de optimale stimulatie voor zowel responder- als Treg-cellen bij alle geteste menselijke proefpersonen.

Vul een conische buis van 50 milliliter met 15 milliliter fal plus. Voer vervolgens een één-op-zes verdunning uit van 50 milliliter buffy coat door 250 milliliter PBS aan de bloedbuis toe te voegen. Breng 25 milliliter van de verdunde buffy coat langzaam aan als laag bovenop de fial pack zonder de lagen te verstoren.

Centrifugeer 30 minuten bij 800 ×g bij vier graden Celsius. Verzamel voorzichtig de PBMC-laag, wat de witte tussenfase tussen de Ficoll en de buffer is, terwijl de rem is uitgeschakeld. Schraap indien nodig de cellen van de wand van de buis.

Wacht enkele minuten en verzamel ze opnieuw uit de tussenfase. Breng de cellen over naar nieuwe buizen van 50 milliliter en was ze door de buizen te vullen met PBS pellet. De PBM cs.

Herhaal de wasstap twee keer per keer. Combineer twee celpellets in één enkele buis en voeg uiteindelijk alle celpellets samen in een enkele buis van 50 milliliter. Gebruik vervolgens 20 microliters van de gesuspendeerde cellen om de cellevensvatbaarheid te bepalen via trypaanblauw-exclusie.

Genereer test-APC's door één milliliter van de levensvatbare pbmc over te brengen naar een nieuwe buis. Voeg vervolgens vier milliliter medium toe en bestraal de cellen met 5.000 rads; vul de buis met de resterende pbmc aan met PBS-buffer. Centrifugeer de cellen vervolgens 10 minuten bij 250 ×g bij vier graden Celsius, giet het supernatant af en resuspendeer de cellen in vier milliliter van hetzelfde mengsel.

Voeg vervolgens 200 µL max anti CD4 microbeads toe aan de pbmc en incubeer het mengsel van cellen en beads gedurende 20 minuten bij 4 °C. Was de cellen na de incubatie in 40 mL PBS-buffer en pellet vervolgens de cellen. Giet daarna het supernatant af en resuspendeer de cellen in 8 mL ontgast PBS-buffer bij kamertemperatuur.

Gebruik vervolgens scheidingsfilters om de celsuspensie te filteren. Verdeel daarna de PBM CS over twee buizen van 15 milliliter door vier milliliter van de P BMCs aan elke buis toe te voegen.

Bevestig twee kolommen aan een minimax-separator en plaats opvangbuisjes onder elke kolom. Voeg vervolgens drie milliliter DGAs PBS-buffer toe aan elke kolom. Wanneer er geen buffer meer over is, brengt u de volledige vier milliliter celoplossing uit elk buisje over de kolommen aan voordat de celsuspensie volledig is uitgelopen. Voeg drie milliliter DGAs PBS-buffer op kamertemperatuur toe aan elke kolom en laat de buffer doorstromen in de opvangbuisjes.

Voeg meer buffer toe totdat deze helder uitstroomt. Pipetteer nog vijf milliliter van de DGAs-buffer op de LS-kolommen en verwijder vervolgens de LS-kolommen uit de minimax-separator. Plaats de kolommen in nieuwe steriele opvangbuisjes van 50 milliliter.

Laat een halve milliliter uitlopen en druk vervolgens langzaam het resterende volume, ongeveer vier milliliter, naar buiten. Combineer nu de twee CD4-positieve fracties. Voeg vervolgens tot 50 milliliter PBS toe aan de buis en tel de cellen nadat de cellen 10 minuten lang bij 400 ×g zijn gecentrifugeerd bij vier graden Celsius.

Resuspendeer de cellen in twee milliliter PBS-buffer. Combineer de antilichamen die worden gebruikt voor fact-kleuring in één buis: anti-CD 14, CD 32, CD 16 en optioneel anti-CD 4. Neem een aliquot van het mengsel voor het kleuren van de FLUOROCHROOM-min-één buis.

Bereid de FMO-buis voor door vijf µL van de cel-suspensie per milliliter uit de buis over te brengen naar een FACS-buis en kleur de cellen met twee µL van het eerder bereide antilichaamcocktail. Voeg vervolgens ongekleurde cellen en beads gecoat met muis-IgG, die met een enkel fluorochroom gekleurd moeten worden, toe aan nieuwe individuele FACS-buizen voor gebruik als compensatiecontroles voor cel sortering. Voeg daarna 50 µL anti-humaan CD25 PE toe aan de cocktail en voeg de cocktail toe aan de rest van de celsuspensie.

Incubeer de buizen 30 minuten bij 4 °C. Nadat de cellen zijn geïncubeerd met het antilichaamcocktail, voegt u PBS-buffer toe aan de cellen en pellet u deze vervolgens. Resuspendeer het pellet in PBS-buffer tot een concentratie van 10⁷ cellen per milliliter.

Gebruik de FMO-buis om de drempelwaarde in te stellen voor het sorteren van CD 25-positieve T-cellen. Gebruik bij deze gating-strategie eerst een gate rond de fit-negatieve cellen om de fit-positieve cellen uit te sluiten, die monocyten, macrofagen en alle andere CD 4-positieve niet-T-cellen omvatten, zoals aangetoond in deze figuur. Teken in een aparte plot gates voor CD 25-negatieve en CD 25-lage T-cellen en CD 25-hoge Treg-cellen, zoals in deze figuur.

Na de flowcytometrische sortering van de celpopulaties worden de collectiebuisjes gecentrifugeerd om een pellet te vormen, waarna de T-cellen op ijs worden bewaard tot aan het uitplaten. Label een 96-well plaat met U-bodem zoals aangegeven in de tabel. Suspendeer een aliquot van 50 µL CD3-gecoate beads, berekend op een concentratie van drie beads per respondercel per well, in volledig medium met 10% gepoolde menselijk AB-serum in de 96-well plaat; verdun vervolgens de eerder bestraalde APC's in medium tot een concentratie van 5 × 10⁵ cellen per ml.

Voeg 50 µL van de cellen toe aan de 96-wells plaat, en voeg vervolgens 2,5 × 10⁴ CD4⁺ CD25⁻ of CD4⁺ CD25ˡᵒ T-cellen per well toe in triplikaat. Voeg Tregs toe aan rij B en aan de wells gemarkeerd als 'tregs only' van de co-cultuur in een verhouding van 1:10, zoals hier getoond. Incubeer de plaat vervolgens 72 uur bij 37 °C in een incubator met 5% CO2 en verzadigde luchtvochtigheid. Pulseer de cellen daarna met 1 µCi tritiëum-getagd thymidine en zet de incubatie bij 37 °C voort voor de volgende 16 uur, nadat het thymidine in de laatste uren van de co-cultuur is ingebouwd.

Gebruik een filter mate harvester om de cellen op een multi-screen oogstplaat te oogsten. Dek de oogstplaat vervolgens af met een transparante plastic kap die vooraf is gevuld met scintillatievloeistof. Lees tot slot de CPM per putje af.

Met behulp van een scintillatieteller kunnen T-cel-subsets via dit systeem met een hoge zuiverheid worden geïsoleerd, zoals te zien is in de volgende reeks dot plots; CD4-positieve CD25-negatieve T-cellen worden hier in de onderste gate weergegeven. In de volgende figuur zijn sterk gezuiverde CD4-positieve CD25-lage T-cellen te zien. Een zuivere populatie van via flowcytometrie gesorteerde CD4-positieve cellen.

CD 25 hoge treg-cellen worden getoond in de bovenste gate-controle. Enkelvoudige celtypeculturen van APC's en tregs van gezonde proefpersonen vertoonden weinig tot geen proliferatie boven de achtergrond, gemeten via thymidine-incorporatie, terwijl naïeve CD 25 negatieve en in vivo geactiveerde CD 25 lage T-cellen een duidelijke proliferatie vertoonden die wordt onderdrukt wanneer deze responder-celtypen worden gecocultiveerd met treg-cellen. Hoewel er lichte verschillen werden waargenomen in het vermogen van tregs om naïeve CD 25 negatieve en in vivo geactiveerde CD 25 lage responder T-cellen te onderdrukken.

Er was geen significante controle. Monoculturen van APC's en Treg-cellen van risicoproefpersonen vertoonden weinig tot geen proliferatie boven de achtergrondwaarde, gemeten via thymidine-incorporatie. Daarentegen vertoonden naïeve CD 25-negatieve en in vivo geactiveerde CD 25-lage T-cellen lagere proliferatieniveaus in vergelijking met gezonde controles.

De responder T-cellen werden verder onderdrukt door tregs en co-culturen, aangezien de assay betrouwbare resultaten genereert. We kunnen daarnaast concluderen dat lage CPM-waarden wijzen op potentiële defecten in de signaaltransductie, wat in een ander type studie verder onderzocht zou moeten worden. Het verschil in het vermogen van tregs om CD 25-negatieve versus CD 25-lage responder T-cellen bij risicosubjecten te onderdrukken was echter significant.

Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u alle noodzakelijke stappen vloeiend kunt verbinden voor een succesvolle en betrouwbare functionele test voor de aanwezigheid van Tregs bij gezonde proefpersonen en proefpersonen met een gecompromitteerd immuunsysteem, zoals bij proefpersonen met diabetes type 1.