Menselijk In Vitro Onderdrukking als Screening Tool voor de erkenning van een vroege staat van Immune Imbalance

Het algemene doel van deze procedure is het gebruik van een in vitro menselijke suppressie-assay om de treg-functie te meten en om mogelijk een toekomstig verlies van deze functie te voorspellen. Dit wordt bereikt door eerst gecodeerde beads voor te bereiden en te testen, die zullen dienen als celstimulatoren. De tweede stap is het isoleren van zuivere naive CD4+ CD25- T-cellen, in vivo geactiveerde CD4+ CD25-low T-cellen en regulatoire CD4+ CD25-high T-cellen, evenals bestraalde PP BMC's voor gebruik als antigeenpresenterende cellen of APC's.

Vervolgens worden monoculturen opgezet van naïeve of geactiveerde T-cellen als responders met P BMCs als APCs, of cocultures onder dezelfde omstandigheden, maar met de toevoeging van tregs in een ratio van 1:10. De laatste stap is het oogsten van de cellen en het meten van hun proliferatie via incorporatie van tritiërend thymidine. De uiteindelijke resultaten kunnen verschillen aantonen in de suppressie van naïeve versus in vivo geactiveerde T-celresponsen.

Mijn naam is Jeff Woodcliff. Regulatoire T-cellen brengen geen unieke markers op het celoppervlak tot expressie. Daarom moeten ze, om hun functie betrouwbaar te kunnen meten, worden geïsoleerd met technieken die de beste scheiding bieden.

Het belangrijkste voordeel van het gebruik van fluorescence-geactiveerde cel sortering ten opzichte van andere methoden zoals max-isolatie, is dat FACS de zuivere celpopulaties biedt die bereikt kunnen worden. De celfunctie kan vervolgens betrouwbaar worden getest in in vitro suppressie-assays, zoals hier wordt aangetoond. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de Treg-functie bij gezonde personen en proefpersonen met type 1 diabetes, kan deze ook worden toegepast op andere auto-immuunziekten, zoals reumatoïde artritis bij mensen, systemische lupus erythematosus, multiple sclerose en andere ziekten. Om de geactiveerde beads te coaten met anti-humaan CD3.

Voeg één milliliter van de M four 50 toil geactiveerde beads uit het oorspronkelijke vials toe aan een 1,5 milliliter buisje en plaats het buisje in een magnetische standaard totdat alle beads aan de zijkant van het buisje zijn gehecht. Verwijder vervolgens de bead-buffer door deze weg te pipetteren terwijl het buisje nog in de magnetische standaard staat. Haal daarna het buisje uit de magnetische standaard en voeg één milliliter buffer één toe.

Plaats de buis herhaaldelijk in de magnetische standaard. Verwijder de buffer terwijl de buis in de magnetische standaard staat. Resuspendeer de beads opnieuw in één milliliter buffer één.

Voeg nu ook 40 µL anti-human CD3 toe. Agiteer de beads en het antilichaam 15 minuten bij 37 °C. Voeg vervolgens 0,1% w/v BSA toe en agiteer gedurende de volgende 16 uur.

Was vervolgens de beads twee keer met buffer twee door de beads vijf minuten lang te incuberen in één milliliter buffer twee bij 2 tot 8 °C, waarna de buffer wordt verwijderd terwijl de buis in het magnetische rek staat. Was de beads daarna nogmaals onder dezelfde steriele omstandigheden.

Test deze keer met gebruik van één milliliter buffer drie de efficiëntie van de antilichaamcoating door een variabel aantal CD3-gecoate beads per cel toe te voegen, om de optimale ratio te bepalen; gebruik hiervoor 50.000 PBMC's per well in triplikaat in een 96-wells plaat. Voeg na 72 uur incubatie in kweek bij 37 °C één microcurie tritiومgetagd thymidine toe en laat dit nog 16 uur incuberen. Oogst de cellen in een multi-screen oogstplaat of een soortgelijk alternatief.

Voeg scintillatievloeistof toe en lees de counts per minute of CPM per well af. Bepaal met een top count N XT scintillatieteller, of een vergelijkbaar apparaat, de bead-celverhouding; op basis van onze ervaring geeft de verhouding die consistent een CPM boven de 5.000, maar onder de 15.000 oplevert, het gewenste resultaat. Een verhouding van drie beads per cel geeft gewoonlijk de optimale stimulatie voor zowel responder- als treg-cellen bij alle geteste menselijke proefpersonen.

Vul een conische buis van 50 milliliter met 15 milliliter fal plus. Voer vervolgens een verdunning van één op zes uit van 50 milliliter buffy coat door 250 milliliter PBS aan de buis met bloed toe te voegen. Breng 25 milliliter van de verdunde buffy coat voorzichtig in lagen aan bovenop de fial pack zonder de lagen te verstoren.

Centrifugeer 30 minuten bij 800 ×g bij vier graden Celsius. Verzamel voorzichtig, met de rem uitgeschakeld, de PBMC-laag, wat de witte tussenfase tussen de Ficoll en de buffer is. Schraap indien nodig de cellen van de wand van de buis.

Wacht enkele minuten en verzamel ze opnieuw uit de tussenfase. Draai de cellen over naar nieuwe buisjes van 50 milliliter en was ze door de buisjes te vullen met PBS pellet. De PBM cs.

Herhaal de wasstap telkens twee keer. Voeg twee celpellets samen in één buis, om uiteindelijk alle celpellets te combineren in één buis van 50 milliliter. Gebruik vervolgens 20 microliters van de gesuspendeerde cellen om de celviabiliteit te bepalen via trypan blue exclusie.

Genereer test-APC's door één milliliter van de levensvatbare pbmc over te brengen naar een nieuwe buis. Voeg vervolgens vier milliliter medium toe en bestraal de cellen met 5.000 rads; vul de buis die de rest van de P BMC's bevat aan met PBS-buffer. Centrifugeer de cellen vervolgens 10 minuten bij 250 ×g bij vier graden Celsius, giet het supernatant af en resuspendeer de cellen in vier milliliter van hetzelfde mengsel.

Voeg vervolgens 200 µL max anti CD4 microbeads toe aan de pbmc en incubeer het mengsel van cellen en beads gedurende 20 minuten bij 4 °C. Was na de incubatie de cellen in 40 mL PBS-buffer en pellet vervolgens de cellen. Giet daarna het supernatant af en resuspendeer de cellen in 8 mL ontgaste PBS-buffer bij kamertemperatuur.

Gebruik vervolgens separatiefilters om de cel-suspensie te filteren en te scheiden. Verdeel daarna de PBM CS over twee buisjes van 15 milliliter, waarbij vier milliliter P BMCs aan elk buisje wordt toegevoegd.

Bevestig twee kolommen aan een minimax-separator en plaats opvangbuisjes onder elke kolom. Voeg vervolgens drie milliliter DGAs PBS-buffer toe aan elke kolom. Wanneer er geen buffer meer over is, brengt u de volledige vier milliliter celoplossing uit elk buisje over de kolommen aan voordat de celsuspensie volledig is uitgelopen. Voeg drie milliliter DGAs PBS-buffer op kamertemperatuur toe aan elke kolom en laat de buffer doorstromen in de opvangbuisjes.

Voeg meer buffer toe totdat deze helder uitloopt. Pipetteer nog eens vijf milliliter van de DGAs-buffer op de LS-kolommen en verwijder vervolgens de LS-kolommen uit de minimax-separator. Plaats de kolommen in nieuwe steriele opvangbuisjes van 50 milliliter.

Laat een halve milliliter uitlopen en duw vervolgens langzaam de rest van het volume uit, wat ongeveer vier milliliter is. Combineer nu de twee CD4-positieve fracties. Voeg daarna tot 50 milliliter PBS toe aan de buis en tel de cellen na het centrifugeren van de cellen bij 400 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C.

Resuspendeer de cellen in twee milliliters PBS-buffer. Combineer de antilichamen die worden gebruikt voor de kleuring in één buis: anti-CD 14, CD 32, CD 16 en optioneel anti-CD 4. Neem een aliquot van het mengsel voor het kleuren van de FLUOROCHROOM-min één-buis.

Bereid de FMO-buis voor door vijf microliters van de cel-suspensie per milliliter uit de buis over te brengen naar een fax-buis en kleur de cellen met twee microliters van het eerder bereide antilichaamcocktail. Voeg vervolgens ongekleurde cellen en beads gecoat met muis-IgG, die met een enkele fluorochroom gekleurd moeten worden, toe aan nieuwe individuele fax-buizen voor gebruik als compensatiecontroles voor cel-sortering. Voeg daarna 50 microliters anti-human CD 25 PE toe aan de cocktail en voeg de cocktail toe aan de rest van de celsuspensie.

Incubeer de buisjes 30 minuten bij 4 °C. Nadat de cellen zijn geïncubeerd met de antilichaamcocktail, voegt u PBS-buffer toe aan de cellen en pellet u deze vervolgens. Resuspendeer het pellet in PBS-buffer tot een concentratie van 10⁷ cellen per ml.

Gebruik de FMO-buis om de drempelwaarde in te stellen voor het sorteren van CD 25-positieve T-cellen. Gebruik bij deze gating-strategie eerst een gate rond de fite-negatieve cellen om de fitz-positieve cellen uit te sluiten, welke bestaan uit monocyten, macrofagen en alle overige CD four-positieve niet-T-cellen, zoals gedemonstreerd in deze figuur. Trek in een aparte plot gates voor CD 25-negatieve en CD 25-lage T-cellen en CD 25-hoge treg-cellen, zoals in deze figuur.

Pellet na de flowcytometrische sortering van de cel-subsets de opvangbuisjes en bewaar de T-cellen op ijs tot aan het uitplaten. Label een 96-wells plaat met U-bodem zoals aangegeven in de tabel. Suspendeer een aliquot van 50 µL CD3-gecoate beads, berekend op een concentratie van drie beads per respondercel per well, in volledig medium met 10% gepoold menselijk AB-serum in de 96-wells plaat en verdun vervolgens de eerder bestraalde APC's in medium tot een concentratie van 5 × 10⁵ cellen per ml.

Voeg 50 µL van de cellen toe aan de 96-wells plaat en voeg vervolgens 2,5 × 10⁴ CD4-positieve CD25-negatieve of CD4-positieve CD25-lage T-cellen per well toe in triplikaat. Voeg Tregs toe aan rij B en aan de wells die zijn gelabeld als Tregs only van de co-cultuur in een verhouding van 1:10, zoals hier getoond. Incubeer de plaat vervolgens 72 uur bij 37 °C in een incubator met 5% CO2 en verzadigde vochtigheid. Pulseer daarna de cellen met 1 µCi tritiumgelabelde thymidine en zet de incubatie bij 37 °C voort voor de volgende 16 uur, nadat de thymidine in de laatste uren van de co-cultuur is ingebouwd.

Gebruik een filter mate harvester om de cellen op een multi-screen oogstplaat te oogsten. Bedek de oogstplaat vervolgens met een transparante plastic kap die vooraf is gevuld met een scintillatievloeistof. Lees tot slot de CPM per put uit.

Met behulp van een scintillatieteller kunnen T-cel-subsets met een hoge zuiverheid worden geïsoleerd via dit systeem, zoals te zien is in de volgende reeks dotplots. CD4-positieve CD25-negatieve T-cellen worden hier in de onderste gate weergegeven. In de volgende figuur zijn hooggezuiverde CD4-positieve CD25-lage T-cellen te zien. Een zuivere populatie van via flowcytometrie gesorteerde CD4-positieve cellen.

CD 25 high treg-cellen worden getoond in de bovenste gate-controle. Monoculturen van APC's en treg-cellen van gezonde proefpersonen vertoonden weinig tot geen proliferatie boven de achtergrond, gemeten via thymidine-incorporatie, terwijl naïeve CD 25 negatieve en in vivo geactiveerde CD 25 low T-cellen een uitgesproken proliferatie vertoonden die wordt onderdrukt wanneer deze responder-celtypen worden gecocultiveerd met treg-cellen. Er werden echter lichte verschillen waargenomen in het vermogen van treg-cellen om responder naïeve CD 25 negatieve en in vivo geactiveerde CD 25 low T-cellen te onderdrukken.

Er was geen significante controle. Monocellenkweken van APC's en Tregs van risico-onderwerpen vertoonden weinig tot geen proliferatie boven de achtergrond, gemeten aan de hand van thymidine-incorporatie. Daarentegen vertoonden naïeve CD 25-negatieve en InVivo-geactiveerde CD 25-lage T-cellen lagere niveaus van proliferatie in vergelijking met gezonde controles.

De responder T-cellen werden verder onderdrukt door tregs en coculturen, aangezien de assay betrouwbare resultaten genereert. We kunnen daarnaast concluderen dat lage CPM-waarden wijzen op potentiële defecten in de signaaltransductie, wat in een ander type studie verder onderzocht dient te worden. Het verschil in het vermogen van tregs om CD 25-negatieve versus CD 25-lage responder T-cellen bij risicopersonen te onderdrukken was echter significant.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u alle noodzakelijke stappen vlot kunt verbinden voor een succesvolle en betrouwbare functionele test voor de aanwezigheid van Tregs bij gezonde proefpersonen en proefpersonen met een gecompromitteerd immuunsysteem. Bijvoorbeeld bij proefpersonen met diabetes type 1.