Name: Een muis model van het hoornvlies Pocket Assay voor Angiogenese Study (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Leer de hoornvlies pocket assay bij muizen om angiogenese te bestuderen met basic FGF. Deze methode induceert robuuste bloedvatgroei vanuit limbusvaten en biedt een reproduceerbaar model voor vasculaire biologie onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ons onderzoek wordt ondersteund door de Intramurale Research Program van de NIH, National Eye Institute.

Alle apparatuur en reagentia die worden gebruikt zijn steriel. Het protocol werd goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite (ACUC) op het NEI / NIH (dierlijke studie protocol NEI-553), en werd uitgevoerd volgens de NIH richtlijnen en regelgeving. 1. De productie van de angiogene factor-bevattende pellets In dit deel worden de pellets met de angiogene factor van belang voorbereid. <ol><li> Maak 10% (w / v) sucralfaat oplossing met PBS. Bewaar bij kamertemperatuur. </li><li> Maak 12% (w / v) poly-HEMA met absolute ethanol. Bewaar bij kamertemperatuur. </li><li> Maak 1 ug / ul bFGF oplossing. Bewaren in -80 ° C. </li><li> Om 50 pellets, mix 5 ul van poly-HEMA, 1μl van sucralfaat en 4 pl van bFGF voorraadoplossing, vortex grondig. </li><li> Leg een stukje schone parafilm in een petrischaal, bloot onder UV-licht gedurende 15 minuten in een weefselkweek kap. Druppel 0,2 ul van de oplossing mengsel op de parafilm voor een pellet. Zo zou 10 ul van de oplossing mengsel opbrengst 50 pellets. Laat de korrels drogen bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur. De gedroogde pellets kan worden opgeslagen in 4 oC gedurende meerdere dagen, of -80 ° C voor enkele maanden. </li><li> Bij het gebruik, wrik en pak de pellets met de uiteinden van een pincet. Wees uiterst voorzichtig om hen niet te breken of maken ze het voorjaar weg. </li></ol> 2. Het uitvoeren van de muis hoornvlies pocket-test In dit deel zullen we laten zien hoe je een zak in de muis hoornvlies te maken, en hoe je een pellet in te voegen in de zak. De angiogene factor in de pellet zal geleidelijk worden vrijgegeven aan de omgeving van het hoornvlies (afb. 1). In deze demonstratie maken we gebruik van 8-week vrouwelijke C57/Bl6 muizen. <ol><li> De muis is zeer systematisch verdoofd met het mengsel van ketamine (75 mg / kg) en xylazine (5mg/kg, ip injectie). Dit zorgt ervoor dat de muis onder een verdoving staat gedurende 30-60 minuten. Plaatselijke verdoving (0,5% proparacaine HCl) wordt toegepast op het hoornvlies. Na 5 min, fix een oog onder een dissectie microscoop. </li><li> Een zeer zachte snede is gemaakt in het midden van het hoornvlies 1,2 -1,4 mm van de corneale limbus (zoals geïllustreerd in figuur 1) met een von Graefe cataract mes. Wees uiterst voorzichtig te snijden door het hoornvlies. </li><li> Een pocket is gemaakt onder het epitheel laagje van het hoornvlies door horizontaal plaatsen van het mes in het midden van het hoornvlies en de uitbreiding van het mes in de richting van de limbus voorzichtig (Fig.1). De grootte van de zak moet groot genoeg zijn om een ​​angiogene factor-bevattende pellet tegemoet te komen. Wees uiterst voorzichtig niet te doorboren door de cornea. </li><li> Plaats een pellet met een pincet in de zak langzaam. Probeer de pellet zo plat mogelijk maken. </li><li> Na implantatie van de pellet, is een oogdruppel antibiotische zalf toegepast op het oog. Instrumenten worden afgeveegd met 70% alcohol pads tussen de dieren. </li><li> Beweeg de muis naar een warme en droge gebied en bewaken, totdat het in staat is om een ​​rechte houding vervolgens te behouden en terug te sturen naar haar kooi. Systemische analgetica (bijv. buprenorfine, 2 mg / kg, ip injectie) en actueel antibiotische zalf (bijv. gentamicine) worden twee keer per dag gegeven gedurende 2 dagen na de operatie en de muis is nauwlettend gevolgd gedurende 3 dagen. Genezing zal naar verwachting volledig binnen de eerste 48 uur na de operatie. Het oog met de pocket zal worden onderzocht onder een spleetlamp biomicro ruimte tussen de 40-10 dagen na de pellet implantatie. </li></ol> 3. Representatieve resultaten <ol><li> Zeven dagen na de pellet implantatie, de muis is verdoofd systemisch en topicaal zoals beschreven in 2.1. </li><li> Let op de bloedvaten in het hoornvlies veroorzaakt door de angiogene factor die een dissectie microscoop. In het hoornvlies worden behandeld met het voertuig, kan er geen groei van bloedvaten worden waargenomen (Fig. 2A, voertuig-behandelde hoornvlies). In het hoornvlies behandeld met bFGF, kan robuuste angiogenese te zien (Fig. 2B). De groei van bloedvaten kan worden beoordeeld aan de hand van de maximale lengte van de bloedvaten (van de normale limbale schepen naar de top van de nieuwe schepen), en de totale bloedvat gebieden (Fig. 2B, afgebakend met een rode stippellijn in de bFGF hoornvlies behandeld). Andere kwantificeringsmethoden zijn ook beschreven 2,5. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3077/3077fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Een. Normale hoornvlies met H &amp; E kleuring. Geen bloedvat bestaat in een normale hoornvlies. B. Maak een zak onder het epitheel laagje van het hoornvlies. C. Voeg een pellet in de zak. D. Het angiogene factor is vrijgelaten uit de korrel, en de nieuwe bloedvaten groeien van de normale limbale schepen. <img src="/files/ftp_upload/3077/3077fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Vertegenwoordiger resultaat vijf dagen na implantage van de pellet. A. Hoornvlies met een pellet met de auto alleen. Geen vorming van nieuwe bloedvaten in het hoornvlies. Alleen de reeds bestaande normale limbale schepen zijn zichtbaar. B. Hoornvlies met een pellet met bFGF. Robuuste nieuwe bloedvaten (dot-lined) steeg van de reeds bestaande normale limbale schepen.

<ol><li>Cao, Y., Linden, P., Shima, D., Browne, F., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+angiogenic+activity+and+hypoxia+induction+of+heterodimers+of+placenta+growth+factor%2Fvascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">In vivo angiogenic activity and hypoxia induction of heterodimers of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor.</a> The Journal of clinical investigation. 98, 2507-2511 (1996).</li>
<li>Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cornea+micropocket+angiogenesis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mouse cornea micropocket angiogenesis assay.</a> Nature. 2, 2545-2550 (2007).</li>
<li>Poche, R. A., Saik, J. E., West, J. L., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cornea+as+a+transplantation+site+for+live+imaging+of+engineered+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">The mouse cornea as a transplantation site for live imaging of engineered tissue constructs.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 5416-54 (2010).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-B+is+dispensable+for+blood+vessel+growth+but+critical+for+their+survival%2C+and+VEGF-B+targeting+inhibits+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">VEGF-B is dispensable for blood vessel growth but critical for their survival, and VEGF-B targeting inhibits pathological angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 106-6152 (2009).</li>
<li>Tong, S., Yuan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+response+of+angiogenesis+to+basic+fibroblast+growth+factor+in+rat+corneal+pocket+assay%3A+I.+Experimental+characterizations%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">Dose response of angiogenesis to basic fibroblast growth factor in rat corneal pocket assay: I. Experimental characterizations.</a> Microvascular research. 75, 10-15 (2008).</li>
<li>Muthukkaruppan, V., Auerbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+the+mouse+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in the mouse cornea.</a> Science. 205, 1416-1418 (1979).</li>
<li>Ziche, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+assay+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Corneal assay for angiogenesis.</a> Methods in molecular medicine. 46, 131-142 (2001).</li>
<li>Ziche, M., Morbidelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corneal+pocket+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">The corneal pocket assay.</a> Methods in molecular biology. 467, 319-329 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De muis hoornvlies pocket test model werd voor het eerst beschreven in 1979 door Muthukkaruppan VR en Auerbach R 6. Gedetailleerde protocollen zijn gepubliceerd door de verschillende laboratoria 2,3,7,8. Ons laboratorium heeft gewijzigd en gebruikt deze methode in ons onderzoek al vele jaren 4. De muis hoornvlies pocket-test is een relatief eenvoudig model met grote reproduceerbaarheid. Een ander voordeel van dit model is dat sinds het hoornvlies normaal ontbreekt bloedvaten, is er minim...

<table border="1"><tbody><tr><th> Uitrusting </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogusnummer </th></tr><tr><td> Dissectiemicroscoop </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> PZMIV-BS </td></tr><tr><td> Von Graefe cataract mes (1.5x25mm mes, flat) </td><td> Ambler Chirurgische </td><td> 3401E </td></tr><tr><td> Dumont # 5 pincetten </td><td> Fijn Science Tools </td><td> 11252-50 </td></tr><tr><td> Spleetlamp </td><td> Zeiss </td><td> 30 SL-M </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Uitrustingen <table border="1"><tbody><tr><th> Reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalog # </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> bFGF (basic fibroblast growth factor) </td><td> Peprotech INC </td><td> 100-18B </td><td></td></tr><tr><td> Sucralfaat (Sucrose octasulfate-aluminium complex) </td><td> Sigma </td><td> S0652 </td><td> 10% in PBS </td></tr><tr><td> poly-HEMA (Poly (2-hydroxyethyl methacrylaat)) </td><td> Sigma </td><td> P3932 </td><td> 12% in ethanol </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Reagentia en materialen

een muis model van het hoornvlies pocket assay voor angiogenese study

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

Een normale hoornvlies is duidelijk van vasculaire weefsels. Echter, de bloedvaten worden geïnduceerd om te groeien en te overleven in het hoornvlies bij de potente angiogene factoren zijn een toegediend. Deze uniciteit heeft het hoornvlies zak test een van de meest gebruikte modellen voor angiogenese studies. Het hoornvlies componeert meerdere lagen van cellen. Het is dus mogelijk om in te sluiten een pellet met de angiogene factor van belang in het hoornvlies om de angiogene effect 2,3 onderzoeken. Hier bieden wij een stap voor stap demonstratie van hoe (I) te produceren van de angiogene factor-bevattende pellet (II) inbedden van de pellet in het hoornvlies (III) het analyseren van de angiogenese geïnduceerd door de angiogene factor van belang. Omdat de basis-fibroblast groeifactor (bFGF) is bekend als een van de meest potente angiogene factoren 4, wordt het hier gebruikt om angiogenese te induceren in het hoornvlies.

Het hoornvlies is uniek omdat het ontbreekt vaatweefsel. Echter, robuuste groei van bloedvaten en overleving worden geïnduceerd in het hoornvlies door de krachtige angiogene factoren. Daarom kan het hoornvlies te voorzien van ons een waardevol hulpmiddel voor angiogene studies. Dit protocol laat zien hoe u de muis-model van het hoornvlies pocket test en hoe de angiogenese veroorzaakt door angiogene factoren het gebruik van dit model te beoordelen.

Een muis model van het hoornvlies Pocket Assay voor Angiogenese Study

Een normaal hoornvlies is vrij van vasculair weefsel. Bloedvaten kunnen echter worden geïnduceerd om te groeien en te overleven in het hoornvlies wanneer potente angiogene factoren ...

Het algemene doel van deze procedure is om het model van de cornea-pocket assay te gebruiken om het angiogene effect van basis FGF te testen. Dit wordt bereikt door een pocket in de cornea te maken en een basis FGF-pellet in de pocket in te brengen. Basis FGF komt vervolgens vrij uit de pellet en stimuleert de groei van nieuwe bloedvaten vanuit de limbaalse vaten.Uiteindelijk kan dit protocol zorgen voor een robuuste groei van nieuwe bloedvaten vanuit de limbaire vaten richting het basis FGF-pellet. Hallo, ik ben Shuan van het laboratorium van Dr. Shiley bij het National Institute INIH. Het belangrijkste voordeel van dit model is dat het een relatief eenvoudig model is met een hoge reproduceerbaarheid.Een ander voordeel is dat het normale hoornvlies geen bloedvaten bevat, waardoor de achtergrond zeer helder is. Nu we een algemeen beeld hebben van het model, zal ik u stap voor stap laten zien hoe u de hoornvliesziekte modelleert.Laten we beginnen. Ter voorbereiding op deze procedure maakt u de volgende oplossingen: 10% w/v sate en PBS 12% w/v polyhema en ethanol, en 1 g/µL basic FGF. De basic FGF moet worden bewaard bij -80 °C, maar de andere twee oplossingen kunnen bij kamertemperatuur worden bewaard.Om 50 pellets van angiogene factoren te maken, combineert u vijf µL polyhema-oplossing, één µL sate-oplossing en vier µL basis FGF-oplossing in een 200 µL PCR-buis en vortexet u vervolgens. Meng het mengsel grondig. Plaats nu een sectie Parafilm in een petrischaal en breng druppels van 0,2 µL van het mengsel aan op de Parafilm.Elke druppel zal opdrogen tot één pellet. Laat de pellets één tot twee uur drogen bij kamertemperatuur. De gedroogde pellets kunnen enkele dagen worden bewaard bij 4 °C, of enkele maanden bij -80 °C.Om de pellets te gebruiken, wipt u deze met een pincet uit de houder; wees uiterst voorzichtig om te voorkomen dat ze breken of wegspringen. Nadat een muis is geanestheseerd met een mengsel van ketamine en xylazine, gebruikt u een pipet om 50 µL 0,5% propaankloridraat op het hoornvlies aan te brengen. Wacht vijf minuten en plaats de muis vervolgens onder een dissectiemicroscoop, zodat één oog zich direct onder het objectief bevindt.Maak met een steriel von Grave-staarmes een zeer voorzichtig sneetje in het midden van het hoornvlies, ongeveer 1,2 tot 1,4 millimeter vanaf de limbus van het hoornvlies. Wees uiterst voorzichtig om niet door het hoornvlies heen te snijden. Maak nu een pocket onder de epitheellaag van het hoornvlies door het mes horizontaal in de incisie in te brengen en het mes voorzichtig uit te breiden.Maak de zak groot genoeg om één basic FGF-pellet te kunnen bevatten. Wees opnieuw uiterst voorzichtig om te voorkomen dat het hoornvlies wordt doorboord. Plaats de pellet op het hoornvlies en vouw deze twee keer.Plaats het pellet langzaam met een pincet in de pocket en druk het pellet vervolgens zo plat mogelijk aan met het pincet om de procedure te voltooien; gebruik een applicator met een oftalmische tip om het gehele oog te bedekken. Breng een lokale oftalmische antibiotische zalf aan en verplaats de muis naar een warme en droge plek. Zodra de muis in staat is een rechtopstaande houding aan te nemen, kan deze twee keer per dag terugkeren naar de thuiskooi terwijl de muis herstelt.Dien vier tot 10 dagen na de implantatie van het pellet systemische analgetica zoals buprenorfine en een topische antibiotische zalf toe aan het oog, anesthetiseer de muis en onderzoek het oog. Met behulp van een spleetlamp en een biologische microscoop werden de bloedvaten in het hoornvlies, geïnduceerd door de angiogene factor, waargenomen onder een dissectiemicroscoop, evenals een hoornvlies dat enkel met een vehikel was behandeld. In een hoornvlies behandeld met basis FGF werd geen bloedvatgroei waargenomen als bewijs voor angiogenese.De groei van nieuwe bloedvaten was robuust. De groei van de bloedvaten werd beoordeeld door de maximale lengte te meten tussen de normale limbusvaten en de top van de nieuwe vaten. Evenzo werd ook het totale bloedvatareaal gemeten.Zoals u ziet, is dit een relatief eenvoudige procedure. Eenmaal onder de knie, kan dit in vijf minuten voor één oog worden uitgevoerd. Tijdens deze procedure moet er bijzondere zorg worden betracht, vooral bij het maken van de pocket en bij het inbrengen van het gaasje in de pocket.Het mes moet nauwkeurig worden gehanteerd zodat het hoornvlies niet wordt doorboord. Bedankt voor uw aandacht. Veel succes.

a-mouse-model-of-the-cornea-pocket-assay-for-angiogenesis-study

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Normale volwassen gevasculariseerde weefsel van zoogdieren die fysiologische angiogenese en die mist nog niet is blootgesteld aan chirurgische ingreep wordt gebruikt om te bestuderen: (i) de instelling en ontwikkeling van angiogenese na intraperitoneale toediening van test-agenten, en (ii) wijziging van angiogenese na systemische toediening van geselecteerde test agenten.

Rat mesenterium Angiogenese Assay

This video demonstrates the development of an ex vivo model of choroidal sprouting to study ocular microvascular angiogenesis. The assay involves culturing mouse eye explants containing the choroid tissue attached to the sclera and retinal pigment epithelium under specific conditions that promote choroidal microvascular sprouting.

Choroid Sprouting Assay to Study Ocular Microvascular Proliferation Ex Vivo

Neovascularisatie (NV) van het hoornvlies kan compliceren meerdere visuele pathologieën. Met behulp van een gecontroleerde, alkali-brandwonden-model, kan een kwantificeerbare niveau van de cornea NV worden geproduceerd voor mechanistische studie van het hoornvlies NV en evaluatie van potentiële therapieën voor neovascular aandoeningen.

Een alkali-brandwonden Model van Cornea Neovascularisatie in de muis

Het protocol beschrijft de corneale micropocket assay zoals ontwikkeld in muizen.

De Cornea micropocket Analyse: Een model van angiogenese in de muis Eye

Hier presenteren we het protocol voor laser-geïnduceerde choroïdale neovascularisatie (CNV) bij muizen, een experimenteel model dat de vasculaire kenmerken van neovasculaire leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) nastreeft. Eenmaal onder de knie, kan het op betrouwbare en effectieve wijze CNV induceren als modelsysteem om verschillende experimentele maatregelen te testen.

Een muismodel voor Laser-geïnduceerde Choroïdale Neovascularisatie

Iris neovascularization, een gemeenschappelijke complicatie van ischemische retinale ziekte, kan leiden tot zicht-bedreigende neovascular glaucoom. Hier beschrijven we een lymfkliertest protocol voor experimentele iris neovascularization die kan worden gebruikt voor noninvasive evaluatie van angiogenese-modulerende stoffen induceren.

Punctie-geïnduceerde Iris Neovascularization als een muismodel van Rubeosis Iridis

Hier presenteren we een protocol om hoornvliesendodelialcellen (CEC) los te koppelen van het membraan (DM) van Descemet met behulp van een neodymium:YAG (Nd:YAG) laser als ex vivo ziektemodel voor bullous keratopathie (BK).

Ontwikkeling van een niet-invasieve, laser-assisted experimenteel model van hoornvlies endotheel celverlies

Dit protocol presenteert choroïde kiemen test, een ex vivo model van microvasculaire proliferatie. Deze test kan worden gebruikt om trajecten die betrokken zijn bij het verspreiden van choroidale microvaten te beoordelen en te beoordelen drug behandelingen met behulp van wilde type en genetisch gemodificeerd muisweefsel.

Een Ex Vivo Choroid Sprouting Assay van Oculaire Microvasculaire Angiogenese

Dit protocol richt zich op alkalische brandwonden geïnduceerde neovascularisatie van het hoornvlies bij muizen. De methode genereert een reproduceerbaar en controleerbaar model voor hoornvliesaandoeningen om pathologische angiogenese en de bijbehorende moleculaire mechanismen te bestuderen en om nieuwe farmacologische middelen te testen om neovascularisatie van het hoornvlies te voorkomen.

Een muismodel voor neovascularisatie van het hoornvlies door alkaliverbranding

Hier stellen we drie verschillende methoden voor om de sensorische vezels die het hoornvlies innerveren te beschadigen. Deze methoden vergemakkelijken de studie van axonregeneratie bij muizen. Deze drie methoden, die kunnen worden aangepast aan andere diermodellen, zijn ideaal voor de studie van de fysiologie en regeneratie van de innervatie van het hoornvlies.

Drie strategieën om neurotrofe keratitis en zenuwregeneratie in het hoornvlies van muizen te induceren

Deze studie presenteert de tweedimensionale (2D) kraswondmigratietest en de driedimensionale (3D) sferoïde kiemtest, samen met hun respectievelijke stroomafwaartse analysemethoden, waaronder RNA-extractie en immunocytochemie, als geschikte tests om angiogenese in vitro te bestuderen.

Onderzoek naar angiogenese op functioneel en moleculair niveau door gebruik te maken van de Scratch Wound Migration Assay en de Spheroid Sprouting Assay

Leer de hoornvlies pocket assay bij muizen om angiogenese te bestuderen met basic FGF. Deze methode induceert robuuste bloedvatgroei vanuit limbusvaten en biedt een reproduceerbaar model voor vasculaire biologie onderzoek.

Een muis model van het hoornvlies Pocket Assay voor Angiogenese Study

Meer video's verkennen