Name: Op lange termijn Cultuur van menselijke borstkankercellen Monsters en hun analyse met behulp van optische projectie Tomografie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Leer een collageen-gebaseerde in vitro assay voor borstkankeronderzoek met primaire weefsels. Deze methode gebruikt Optical Projection Tomografie om driedimensionale tumorinvasie te kwantificeren en geneesmiddelrespons te beoordelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Lorna Renshaw (Edinburgh Breast Unit) voor haar onschatbare hulp bij het verkrijgen van klinische monsters. Gebruik van tumor materiaal werd goedgekeurd door de Lothian Research Ethics Committee (08/S1101/41) en behaalde onder de auspiciën van Experimenteel Kankeronderzoek Medicine Centre-programma (Edinburgh). Dit werk wordt ondersteund door de Schotse Funding Council. ADL is een Miss Margaret Butters Reekie Trust klinische kerel.

1. Extraheren van collageen uit Rat Tails <ol><li> Leg bevroren verse rat staarten in 70% ethanol. </li><li> Deglove de overliggende huid met een scalpel bloot pezen. </li><li> Strip pezen uit de buurt van de staart en plaats in 70% ethanol om te steriliseren. </li><li> Weeg de verzamelde pezen en transfer naar azijnzuur (1g pees tot 250ml 0,5 M azijnzuur). Mix voor 48hr bij 4 ° C. </li><li> Centrifugeer de pees / azijnzuur mix bij 10.000 g voor 30 minuten en gooi de pellet. </li><li> Voeg een gelijk volume van 10% (w / v) NaCl aan het supernatant en laat het mengsel een nacht staan ​​bij 4 ° C. </li><li> Verzamel de collageen-rijke, onoplosbaar onderste laag en centrifugaat voor een verdere 30 minuten bij 10.000 g </li><li> Resuspendeer de collageen-rijke materiaal in 0,25 M azijnzuur bij 4 ° C en dialyse tegen 1:1000 azijnzuur bij 4 ° C gedurende 3 dagen, het veranderen van de dialyse-buffer tweemaal daags. </li><li> Verder steriliseren van de collageen-oplossing door middel van centrifugatie (20.000 g voor 2 uur) en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Verdunnen collageen indien nodig met de toevoeging van steriele 1:1000 azijnzuur een voorraad concentratie van 1mg/ml. </li></ol> 2. 3D-Assay Creation De 3D-test is gebaseerd op een cellijn-test, gepubliceerd voorheen 2. <ol><li> Multiple core biopsies worden geoogst vanaf stemt patiënten ten tijde van de curatieve chirurgische resectie voor invasieve borstkanker. </li><li> Met het blote oog, verdeel de kernen met behulp van een scalpel in 1mm 3 fragmenten. Trim en gooi macroscopisch duidelijk vet. </li><li> Dompel de fragmenten in MEGM Compleet media. Het weefsel kan worden opgeslagen in deze staat voor maximaal 1 uur. </li><li> Voor het maken van het collageen gel, mix op ijs 1mg/ml rattenstaart collageen, tot 1:1000 gefilterd azijnzuur, 10x DMEM/F12 en 0.22M NaOH in een verhouding van 3:5:1:1 creëren een uiteindelijke collageen concentratie van 0,3 mg / ml. </li><li> Injecteer 1,2 ml van collageen mengsel in afzonderlijke putjes van een 24 wells plaat en breng het in een incubator bij 37 ° C gedurende 10min te geleren te starten. </li><li> Na 10min, verwijder de 24 wells plaat uit de incubator. Leg de stukjes tumor op de gelering collageen en duw ze in het centrum van de gel met behulp van een pipet 10μl tip. De terugkeer van de 24 wells plaat naar de incubator voor 1 uur. </li><li> Voor ER + tumoren, aan te vullen MEGM Compleet media met β-oestradiol tot een concentratie van 3.2x10 -10 M. Zodra de gel assays hebben gegeleerde voor 1 uur, voorzichtig 1,2 ml van het aangevulde media introduceren in elk putje. De uiteindelijke β-oestradiol concentratie in de test zal equilibriate om 1.6x10 -10 m aan fysiologische oestrogeenspiegels gevonden in borstweefsel 3 herhalen. </li><li> Voer een 10μl pipettip rond de binnenrand van elk goed, het vrijgeven van elke gel de omtrek, zodat elke gel vrij zweven in de media. De terugkeer van de 24 wells plaat naar de incubator. </li><li> Exchange aangevuld media tweemaal per week tot het einde van het experiment. Beëindig het experiment door het verwijderen van de media en het toevoegen van een formaline fixeermiddel. </li></ol> 3. Antilichaam kleuring of Assay ter voorbereiding van optische projectie Tomography We hebben een eerder gepubliceerde methode voor het hele steekproef vlekken 4. <ol><li> Was formaline gefixeerde monsters voor 30 minuten in PBS. Uitdrogen van de gels stapsgewijs in methanol verdund in PBS dat 0,05% Tween 20 (0,05% PBST): 33%, 66% en 100% voor ≥ 15 minuten bij elke stap. </li><li> Incubeer het weefsel in de vers bereide MeOH: DMSO: 30% H 2 O 2 in een verhouding van 02:01:03 (15% v / v H 2 O 2) bij kamertemperatuur gedurende 24 uur aan de autofluorescentie te lessen. </li><li> Twee keer wassen monsters voor 30min in methanol. Freeze de monsters tot -80 ° C vijf keer voor minstens 1 uur per keer en weer op kamertemperatuur (RT) die antigenen zorgen in de diepere delen van het weefsel zijn toegankelijk gemaakt. </li><li> Hydrateren het weefsel terug tot 0,05% PBST met methanol als oplosmiddel (33%, 66% en 100% voor 15 minuten bij elke stap). </li><li> Blokkeer het weefsel in het blokkeren van oplossing (10% serum in 0,05% PBST) voor 24 uur. </li><li> Incubeer het weefsel met een primaire antilichaam voor de epitheliale inhoud te identificeren, met behulp van konijnen anti-cytokeratine bij een concentratie van 1:500 verdund in 1,5 ml van het blokkeren van oplossing met 5% DMSO voor 48hr. </li><li> Was monsters vier keer met 0,05% PBST voor 30min per stuk. </li><li> Incubeer het weefsel met fluorescerende secundair antilichaam (1:100 geit anti-konijn Alexa555), verdund in 1,5 ml blokkeren oplossing met 5% DMSO voor 48hr. </li><li> Was weer de monsters met 0,05% PBST vier keer voor 30 minuten elk. </li></ol> 4. Optische projectie Tomografie Optische projectie tomografie is een techniek die eerder ontwikkelde microscopie om hoge resolutie 3D-beelden van TL-biologische monsters te produceren met een dikte tot 15 mm 5. <ol><li> Monteer de sgehandhaafd gel in 1% laag smeltpunt agarose en uitdrogen in 100% methanol voor 24 uur. Schakel het model in Babb-oplossing (1:2 benzylalcohol, benzylbenzoaat) voor 48hr en scannen met behulp van het OPT 3001M Scanner (Bioptonics). </li><li> Zowel de doelgroep en autofluorescentie worden gevangen met behulp van de Cy3 filter set (exciter 545nm/30 nm, emitter 610/75 nm) en GFP1 filter set (exciter 425nm/40 nm, emitter LP475 nm) respectievelijk. </li></ol> 5. Reconstructie-en 3D-kwantificering <ol><li> De set van hoekige projecties overgenomen door OPT kan worden gereconstrueerd met behulp van NRecon software (SkyScan) om een ​​reeks van doorsnede plakjes door de invasie-test maken. Deze software is beschikbaar voor gratis downloaden op <a href="http://www.skyscan.be/products/downloads.htm">http://www.skyscan.be/products/downloads.htm</a> . </li><li> Analyseer de gereconstrueerde gegevens met behulp van Volocity software (PerkinElmer). Gratis demonstratie software is beschikbaar voor downloaden op <a href="http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/">http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/</a> . </li><li> Met het oog op epitheliale volume cytokeratine kleuren te kwantificeren, een minimum voxel intensiteit drempel om storing te verminderen van achtergrond fluorescentie in het doel kanaal. Definieerden we empirisch deze drempel bij 9000 au Met behulp van een lijst met beschikbare parameters in de applicatiesoftware voor meten, we gekwantificeerd het volume van de epitheel in continuïteit met de oorspronkelijke kern (afgebakend in de autofluorescente kanaal). Dit liet ons toe om volumes van epitheliale uitgroei kwantificeren tussen de verschillende tumor monsters. </li></ol> 6. Representatieve resultaten: Tijdens de ontwikkeling van de test, een totaal van 52 borstkanker biopsie exemplaren met een brede waaier van histopathologische zijn gebruikt. Van deze &lt;10% (5 / 52) niet ten minste een levensvatbare invasie assay te bieden. Test te wijten was aan een bacteriële supra-infectie of onvoldoende tumor biopsie materiaal. Daarom is de toepassing van de test is niet beperkt tot een bepaald subtype van borstkanker. Typische assays (figuur 1) vast na 20 dagen in collageen cultuur en vervolgens gekleurd voor cytokeratine. Volocity software is in staat om zowel de epitheliale bulk continu met de oorspronkelijke kern en vrijstaande groepen van binnendringende cellen herkennen en afzonderlijk te kwantificeren elk volume. <img src="/files/ftp_upload/3085/3085fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Invasion testen na fixatie en kwantificering. De test ondersteunt monsters verkregen van meerdere subtypen borstkanker: a) ER + b) HER2 + en c) ER-.

<ol><li>Lopez-Garcia, M. A., Geyer, F. C., Lacroix-Triki, M., Marchio, C., Reis-Filho, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+precursors+revisited%3A+molecular+features+and+progression+pathways.+Histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Breast cancer precursors revisited: molecular features and progression pathways. Histopathology.</a> 57, 171-192 (2010).</li>
<li>Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-dependent+versus+-independent+cancer+cell+invasion+programs%3A+three-dimensional+amoeboid+movement+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited.</a> J Cell Biol. 185, 11-19 (2009).</li>
<li>Dabrosin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+extracellular+local+levels+of+estradiol+in+normal+breast+in+vivo+during+the+luteal+phase+of+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Increased extracellular local levels of estradiol in normal breast in vivo during the luteal phase of the menstrual cycle.</a> J Endocrinol. 187, 103-108 (2005).</li>
<li>Alanentalo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+molecular+imaging+and+3D+quantification+within+adult+mouse+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs.</a> Nat Methods. 4, 31-33 (2007).</li>
<li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li>
<li>Hidalgo-Carcedo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+requires+suppression+of+actomyosin+at+cell-cell+contacts+mediated+by+DDR1+and+the+cell+polarity+regulators+Par3+and+Par6%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration requires suppression of actomyosin at cell-cell contacts mediated by DDR1 and the cell polarity regulators Par3 and Par6.</a> Nat Cell Biol. 13, 49-58 (2011).</li>
<li>Katz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+on+the+HER2+amplicon%2C+C35%2C+is+an+oncogene+in+breast+cancer+whose+actions+are+prevented+by+inhibition+of+Syk%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">A gene on the HER2 amplicon, C35, is an oncogene in breast cancer whose actions are prevented by inhibition of Syk.</a> Br J Cancer. 103, 401-410 (2010).</li>
<li>Timpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Regulation+of+RhoA+Activity+during+Pancreatic+Cancer+Cell+Invasion+Driven+by+Mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53.</a> Cancer Res. 71, 747-757 (2011).</li>
</ol>

SEW en JF in dienst zijn bij MRC Technology, dat is het commercialiseren van Bioptonics OPT scanners. Andere auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Op basis van collageen assays om het gedrag van kanker cellijnen studie zijn nu op grote schaal gebruikt 6,7,8. Toch hebben deze testen niet terug te vinden in volle de complexiteit van de tumor en zijn omgeving. In deze studie hebben we laten zien dat de menselijke borstkanker materialen kunnen worden gebruikt op een vergelijkbare manier, ex vivo. Verder OPT is een nuttig hulpmiddel om de 3D-uitbreiding van borstkanker te karakteriseren. We vonden dat de belangrijkste beperking van deze techniek is de beschikbaarheid van de tumor materialen (een single core biopsie is voldoende voor 4-6 assays). Een andere beperkende factor is dat structurele invasie komt alleen voor bij ongeveer 40% van de testen. Om dit, wij regelmatig toe te voegen elke gewenste behandeling rond dag 7 tot alle testen met zichtbare groei. Het gebruik van OPT zou kunnen worden uitgebreid in de toekomst ook te detecteren bulk veranderingen, ex vivo, als gevolg van behandeling met geneesmiddelen. Dit op zijn beurt zou kunnen vergemakkelijken, meer geïndividualiseerde behandeling van kanker, onafhankelijk van diermodellen. We zijn momenteel het verkennen van de reactie van ER + tumoren aan tamoxifen ex vivo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus Nee. </td></tr><tr><td> MEGM Compleet </td><td> Lonza </td><td> CC-3150 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8900 10X1L </td></tr><tr><td> β-oestradiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E8875-250mg </td></tr><tr><td> Konijn anti-cytokeratine </td><td> Dako </td><td> Z0622 </td></tr><tr><td> Geit anti-konijn Alexa555 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr></tbody></table> Alle andere standaard reagentia werden verkregen van Sigma-Aldrich.

op lange termijn cultuur van menselijke borstkankercellen monsters en hun analyse met behulp van optische projectie tomografie

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Borstkanker is een belangrijke oorzaak van sterfte in de Westerse wereld. Het staat vast dat de verspreiding van borstkanker eerst lokaal en later distaal, is een belangrijke factor in de patiënt prognose. Experimentele systemen van borstkanker vertrouwen op cellijnen meestal afgeleid van de primaire tumoren of pleurale effusie. Twee belangrijke obstakels verhinderen dit onderzoek: (i) een aantal bekende sub-types van borstkanker (met name een slechte prognose luminale B tumoren) zijn niet vertegenwoordigd binnen de huidige regel collecties, (ii) de invloed van de tumor micro-omgeving is doorgaans niet in aanmerking genomen. We tonen een techniek om cultuur primaire borstkanker exemplaren van alle sub-types. Dit wordt bereikt door gebruik te maken driedimensionale (3D) cultuur systeem waarin kleine stukjes van de tumor zijn ingebed in zachte rat collageen I kussens. Binnen 2-3 weken, de tumorcellen zich in de collageen en vorm verschillende structuren vergelijkbaar met die waargenomen in de menselijke tumours1. Levensvatbare adipocyten, epitheelcellen en fibroblasten in de oorspronkelijke kern waren duidelijk op histologie. Kwaadaardige epitheliale cellen met squamoid morfologie werden gedemonstreerd binnendringen in het omliggende collageen. Nucleaire pleomorfisme was duidelijk in deze cellen, samen met mitotische figuren en apoptotische lichamen. We hebben in dienst optische projectie Tomografie (OPT), een 3D-imaging technologie, om de omvang van de tumor zich in de cultuur te kwantificeren. We hebben OPT gebruikt om het grootste deel volume van de tumor cultuur te meten, een parameter routinematig gemeten tijdens de neo-adjuvante behandeling van patiënten met borstkanker om de respons op behandeling met geneesmiddelen te beoordelen. Hier presenteren we een kans om cultuur borsttumoren bij de mens zonder sub-type bias en kwantificeren van de verspreiding van die ex vivo. Deze methode kan worden gebruikt in de toekomst van drugs gevoeligheid in de oorspronkelijke tumor te kwantificeren. Dit kan zorgen voor een meer voorspellend model dan de momenteel gebruikte cellijnen.

We hebben een basis van collageen<em&gt; In vitro</em&gt; Test die de proliferatie en de invasie bevordert uit monsters van alle subtypen borstkanker. Optische Projectie Tomografie, een driedimensionale microscopie-techniek werd gebruikt om te visualiseren en te kwantificeren tumor expansie. Deze test kan worden gebruikt om drugs reactie van de individuele tumor monsters te kwantificeren.

Op lange termijn Cultuur van menselijke borstkankercellen Monsters en hun analyse met behulp van optische projectie Tomografie

Borstkanker is een leidende doodsoorzaak in de westerse wereld. Het is een vastgesteld feit dat de verspreiding van borstkanker, eerst lokaal en later ...

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van een langetermijncultuur van primair borstkankerweefsel en het kwantificeren van het driedimensionale groeipatroon. Dit wordt bereikt door eerst type one collageen uit rattenstaarten te extraheren. Vervolgens wordt het kankerbiopsiemonster klaargemaakt en ingebed in de collagenematrix.Na 20 dagen in kweek wordt het borstkankersteweefsel immunofluorescentieel gekleurd en gescand met optische projectietomografie, waarna de data worden gereconstrueerd en gekwantificeerd. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die het invasiepatroon van de tumor van een individu laten zien, wat verder kan worden gekwantificeerd via een driedimensionale analyse. Het belangrijkste voordeel van ex Vivi-kweken is dat er gebruik wordt gemaakt van echt kankermateriaal in een fysiologische context.In tegenstelling tot cellijnculturen is een visuele demonstratie van deze techniek belangrijk, aangezien het verkrijgen van primair kankerweefsel moeilijk is. De juiste techniek zal de kansen op een succesvol experimenteel resultaat optimaliseren. Deze techniek zal worden gedemonstreerd door mijzelf en Joanne Farrell van MRC Technology om te beginnen met het extraheren van type one collagen.Plaats de bevroren rattenstaarten in 70% ethanol tot ze ontdooid zijn. Verwijder met een scalpel de bovenliggende huid om de pezen bloot te leggen, strip de pezen van de staart en plaats deze in 70% ethanol om ze te steriliseren. Weeg de verzamelde pezen en breng ze over naar azijnzuur.Roer gedurende 48 uur bij 4 °C. Centrifugeer vervolgens het mengsel van pees en azijnzuur bij 10.000 ×g gedurende 30 minuten en verwijder het pellet.Voeg een gelijk volume 10% natriumchloride toe aan het S-supernatans en laat het mengsel een nacht staan bij vier graden Celsius. Pipetteer de bovenste laag af en gooi deze weg. Verzamel vervolgens de collageenrijke onoplosbare bodemlaag en centrifugeer deze gedurende 30 minuten bij 10 000 ×g.Laat het materiaal bezinken door zwaartekracht, resuspendeer het collageenrijke materiaal vervolgens in 0,25 M azijnzuur bij vier graden Celsius en pipetteer dit in een dialysezak. Dialyseer gedurende drie dagen tegen 1:1000 azijnzuur bij vier graden Celsius.Vervang de dialysebuffer tweemaal daags. Collageen kan verder worden gesteriliseerd met een extra centrifugatiestap en resuspensie in azijnzuur voor deze analyse. Begin met meerdere kernbiopten die bij instemmende patiënten zijn afgenomen tijdens de curatieve chirurgische resectie van invasief borstkanker, waarbij selectie visueel is gebeurd met behulp van een scalpel.Verdeel het weefsel in fragmenten van één kubieke millimeter, trim deze en verwijder al het macroscopisch zichtbare vet. Door het monster op een scalpellamel te monteren, is de visualisatie in de zuurkast beter en wordt de dissectie nauwkeuriger en veiliger. Dompel de fragmenten onder in compleet MEGM-medium.Het weefsel kan in deze toestand tot één uur worden bewaard om een collageengelmix van 0,3 mg/mL op ijs te maken, bestaande uit 1 mg/mL rattenstaartcollageen, 1:1000 gefilterd azijnzuur, 10x DMEM/F12 en 0,22 M natriumhydroxide. Pipetteer 1,2 mL van het collageenmengsel in individuele wells van een 24-wells plaat en plaats deze 10 minuten in een incubator bij 37 °C. Verwijder de plaat uit de incubator om de gelvorming te initiëren.Plaats de tumorstukjes op het gelerende collageen en gebruik een pipetpunt van 10 µL om ze voorzichtig in het midden van de gel te duwen. Plaats de plaat gedurende één uur terug in de incubator. Vul A-M-E-G-M compleet medium aan met bèta-estradiol tot een eindconcentratie van 3,2 × 10⁻¹⁰ M.Nadat de gel-assays één uur hebben geïncubeerd, wordt er voorzichtig 1,2 milliliter van het aangevulde medium in elke put aangebracht. De uiteindelijke bèta-estradiolconcentratie zal equilibreren naar 1,6 × 10⁻¹⁰ M om de fysiologische oestropegels die in borstweefsel worden aangetroffen na te bootsen. Beweeg een 10 µL pipetpunt langs de binnenrand van elke put om elke gel circumferenceel los te maken, zodat elke gel vrij kan drijven in het medium.Plaats de 24-wells plaat terug in de incubator en vervang het gesuppleerde medium tweemaal per week tot het einde van het experiment. Invasieve groei kan hier in real-time worden waargenomen met een brightfield-microscoop. Een time-delay capture extended depth of focus-video demonstreert de invasie van het epitheel vanuit de tumorrand in het omringende collageen gedurende 60 uur, van dag zeven tot en met negen.Beëindig het experiment door het medium te verwijderen en voeg een formule toe. Fixeer gedurende 48 uur om de 3D-assaymonsters immunochemisch te kleuren voor optische projectietomografie. Verplaats vervolgens de in formaline gefixeerde specimens van de wells naar een vial.Was ze vervolgens gedurende 30 minuten. Voer in PBS een stapsgewijze dehydratatie van de gels uit met behulp van methanol verdund in PBS met 0,05% Tween 20; incubeer het weefsel in vers bereid methanol, DMSO en 30% waterstofperoxide in een verhouding van twee op één op drie bij kamertemperatuur gedurende 24 uur om de autofluorescentie te doven. Was de monsters daarna twee keer gedurende 30 minuten.Bevries en ontdooi de monsters in methanol vijf keer van -80 °C naar kamertemperatuur, telkens gedurende ten minste één uur, om ervoor te zorgen dat de antigenen in de diepere delen van het weefsel toegankelijk worden gemaakt. Rehydrateer het weefsel vervolgens terug naar PBS met 0,05%T tussen 20 met methanol als verdunner, incubeer het weefsel gedurende 24 uur bij 4 °C in blokkeringsoplossing om epitheliale inhoud te identificeren, en incubeer de monsters gedurende 48 uur bij 4 °C in konijnen anti-cytokeratine primaire antilichamen verdund in 1,5 ml blokkeringsoplossing met 5%DMSO. Was de monsters 24 keer gedurende elk 30 minuten in PBS met 0,05%T tussen 24.Incubeer het weefsel in fluorescerende secundaire antilichamen, verdund in 1,5 milliliters blokkeringsoplossing met 5% DMSO gedurende 48 uur bij vier graden Celsius. Was de monsters opnieuw in PBS met 0,05% tussen 24 keer gedurende telkens 30 minuten. Om de monsters voor optische projectietomografie voor te bereiden, wordt de gekleurde gel gemonteerd in 1% low melting point aase en gedehydrateerd in 100% methanol gedurende 24 uur.Maak het preparaat vervolgens 48 uur lang helder in BABB-oplossing. Scan de monsters met de OPT 3001 M scanner. Zowel het doelwit als de autofluorescentie worden respectievelijk vastgelegd met de SI three en GFP one filtersets.Het monster wordt ondersteund in een transparante cilinder van aerogel en gedraaid in hoekstappen van 0.9 graden. Er wordt bij elk van de 400 gedraaide posities een digitale afbeelding van het statische monster gemaakt. Gebruik de n recon-software om de set hoekprojecties die met OPT zijn verkregen te reconstrueren door een reeks dwarsdoorsneden door de invasie-assay te creëren.Analyseer de gereconstrueerde gegevens met velocity-software om het epitheliale volume via cytokeratine-kleuring te kwantificeren; stel een minimale voxel-intensiteitsdrempel in om interferentie van achtergrondfluorescentie in het doelkanaal te verminderen. Deze drempel is empirisch vastgesteld op 9.000 willekeurige eenheden.Gebruik ten slotte een lijst met beschikbare parameters in de meetapplicatie en de gegevens van het autofluorescente kanaal dat het epitheel afbakent dat continu is met de oorspronkelijke kern om het volume van het epitheel in een tumoraangroei te kwantificeren. Hier wordt een typische assay getoond die na 20 dagen in collageencultuur is gefixeerd en vervolgens is gekleurd voor cytokeratine. Velocity-software is in staat om zowel de epitheliale massa, die continu is met de oorspronkelijke kern, als losgekoppelde groepen invaderende cellen te herkennen en elk volume afzonderlijk te kwantificeren.De oorspronkelijke biopsieën waren afkomstig van diverse tumoren na ex vivo kweken. Men zou ook andere technieken kunnen gebruiken, zoals immunohistochemie of immunofluorescentie, om de mate van proliferatie, apoptose of soortgelijke processen te bepalen. De ontwikkeling van deze techniek heeft onderzoekers in het veld van translationeel borstkankeronderzoek in staat gesteld om methoden te verkennen voor het identificeren van geneesmiddelenresistentie bij personen met borstkanker.

long-term-culture-human-breast-cancer-specimens-their-analysis-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Huang, Y. et. al., Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the use of optical coherence tomography (OCT) to monitor tumor spheroids in a multi-well plate by capturing high-resolution cross-sectional images. By analyzing light reflections from cellular structures, OCT constructs 3D models to assess morphological features like size and shape while also...

Morphological and Physiological Monitoring of Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography 

Complex weefsel massa, van organen tumoren, zijn samengesteld uit verschillende cellulaire elementen. We opgehelderd de bijdrage van cellulaire fenotypes binnen een weefsel met behulp van multi-gelabelde fluorescerende transgene muizen in combinatie met multiparameter immunofluorescentiekleuring gevolgd door spectrale unmixing naar cel oorsprong evenals karakteristieken van de cel op basis van eiwit expressie ontcijferen.

Kwantitatieve Multispectral Analyse Na Fluorescent Tissue Transplantatie voor Visualisatie van de Cel Origins, types en interacties

Ex vivo analyse van arteriële laesies uit diermodellen van hart- en vaatziekten is klassiek gebaseerd op histologische en immunohistochemische technieken. Deze bieden 2-dimensionale metingen in 3-dimensionale laesies. Dit manuscript beschrijft de generatie van arteriële laesies voor kwantitatieve analyse in 3-dimensies met behulp van optische projectietomografie.

Generatie en 3-dimensionale kwantificering van arteriële laesies in Muizen met behulp van optische projectie Tomografie

Drie dimensionale cultuur van mammaire epitheelcellen op een gereconstitueerde basaalmembraan is een handige methode om de in vivo architectuur van de goedaardige borst herhalen, en het maligne fenotype onderscheiden van goedaardige borst fenotype. Belangrijk is dat dit systeem worden toegepast invasieve carcinomen studie in weefsels.

Drie dimensionaal culturen: Een hulpmiddel om te studeren Normaal Acinaire Architectuur versus maligne transformatie van cellen borst

Protocollen worden beschreven voor het bestuderen van borstkanker celmigratie, proliferatie en kolonisatie in een menselijk botweefsel explantaatmodel systeem.

Methoden voor het kweken van menselijke dijbeen weefselexplantaten naar Breast Cancer Cell Kolonisatie van het gemetastaseerde Niche Bestudeer

Optische coherentie tomografie (OCT), een driedimensionale imaging technologie, werd gebruikt om te controleren en te karakteriseren de kinetiek van de groei van meercellige tumor spheroïden. Precieze volumetrische kwantificering van tumor spheroïden met behulp van een voxel tellen aanpak, en label-vrije dood weefsel detectie in de spheroïden op basis van intrinsieke optische demping daarentegen werden gedemonstreerd.

Longitudinale morfologische en fysiologische Monitoring van driedimensionale Tumor spheroïden met behulp van optische coherentie tomografie

Driedimensionale culturen van patiënt BMPC-specimens en xenografts van botgemetastaseerde prostaatkanker behouden de functionele heterogeniteit van hun oorspronkelijke tumoren, wat resulteert in cysten, sferoïden en complexe, tumorachtige organoïden. Dit manuscript biedt een optimalisatiestrategie en protocol voor de 3D-cultuur van heterogene patiëntafgeleide monsters en hun analyse met behulp van IFC.

Oprichting en analyse van driedimensionale (3D) organoïden afgeleid van patiënt prostaatkanker Bot metastase Specimens en hun Xenografts

Patiënt-afgeleide organoïden (BOB's) zijn een krachtig hulpmiddel in translationeel kankeronderzoek, dat zowel de genetische als fenotypische heterogeniteit van de ziekte en de reactie op gepersonaliseerde antikankertherapieën weerspiegelt. Hier wordt een geconsolideerd protocol voor het genereren van pdo's voor primaire blaaskanker bij de mens ter voorbereiding op de evaluatie van fenotypische analyses en medicijnresponsen gedetailleerd beschreven.

Cultuur van blaaskanker organoïden als precisie geneeskunde tools

We beschrijven een protocol voor de productie, cultuur en visualisatie van menselijke kankers, die zijn uitgezaaid naar de peritoneale oppervlakken. Reseceerde tumormonsters worden gesneden met behulp van een vibratoom en gekweekt op permeabele inserts voor verhoogde oxygenatie en levensvatbaarheid, gevolgd door beeldvorming en downstream-analyses met behulp van confocale microscopie en flowcytometrie.

Cultuur en beeldvorming van ex vivo organotypische pseudomyxoma peritonei tumorplakken van gereseceerde menselijke tumorspecimens

Een gedetailleerd protocol wordt hier verstrekt voor het vaststellen van menselijke borstorganoïden uit van de patiënt afgeleide borsttumorresecties of normaal borstweefsel. Het protocol biedt uitgebreide stapsgewijze instructies voor het kweken, bevriezen en ontdooien van menselijke patiënten afgeleide borstorganoïden.

Oprichting en kweek van van de patiënt afgeleide borstorganoïden

Dit protocol biedt een systematisch kader voor de oprichting van organoïden van eierstokkanker uit verschillende ziektestadia en pakt de uitdagingen van patiëntspecifieke variabiliteit aan om de opbrengst te verhogen en robuuste uitbreiding op lange termijn mogelijk te maken voor volgende toepassingen. Het bevat gedetailleerde stappen voor weefselverwerking, zaaien, het aanpassen van mediavereisten en immunofluorescentiekleuring.

Strategie voor biobanking van organoïden van eierstokkanker: aanpak van de heterogeniteit tussen patiënten tussen histologische subtypes en ziektestadia

Leer een collageen-gebaseerde in vitro assay voor borstkankeronderzoek met primaire weefsels. Deze methode gebruikt Optical Projection Tomografie om driedimensionale tumorinvasie te kwantificeren en geneesmiddelrespons te beoordelen.

Op lange termijn Cultuur van menselijke borstkankercellen Monsters en hun analyse met behulp van optische projectie Tomografie

Meer video's verkennen