Het in kaart brengen Remmende neuronale circuits door Laser Scanning fotostimulatie
6 oktober 2011
Deze paper introduceert een benadering van het combineren van laser scanning fotostimulering met hele cel opnames in transgene muizen die GFP in beperkte remmende neuron populaties. De techniek maakt uitgebreide mapping en kwantitatieve analyse van lokale synaptische circuits specifieke remmende corticale neuronen.
Het algemene doel van deze procedure is om de lokale functionele organisatie van remmende neuronale circuits te onderzoeken. De procedure begint met het bereiden van levende hersensneden van de primaire somatosensorische cortex van muizen. De volgende stap is om getargete GFP-uitdrukkende remmende celtypen in de hersenslice te visualiseren en op te nemen.
Na deze laser scanning foto stimulatie via glutamaat, wordt oncaging gebruikt om kleine clusters van pre-synaptische neuronen te activeren als opwindend of remmend. Post-synaptische stromen worden opgenomen in de GFP-uitdrukkende interneuronen. De laatste stap is om door te gaan met foto stimulatie, data-analyse en het genereren van kwantitatieve kaarten van synaptische input naar de opgenomen neuronen.
Uiteindelijk maakt laser scanning foto stimulatie in combinatie met gehele cel opnames de constructie mogelijk van gedetailleerde kaarten van synaptische input naar specifieke typen remmende neuronen, wat mogelijk de organisatie en functie van lokale remmende corticale circuits kan bepalen. De foto stimulatie-gebaseerde techniek werd ontwikkeld door Dr. Larry Katz, Ned Calloway, en verder ontwikkeld door Dr. Carols Waboda, mijn pi, Dr. Xing Z, die getraind is met Dr. Calloway, het Salk Institute, waar hij veel onderzoek deed naar interorale circuits. Onze groep breidt en continueert deze studies momenteel en onderzoekt interorale circuits.
Om deze procedure te beginnen, offer een transgene muis op postnatale twee tot drie weken aan door onthoofding en verwijder snel de hersenen, plaats de hersenen in een bevroren en geoxygeneerde snijoplossing. Gebruik vervolgens de GFP-bril om de hersenen visueel te screenen en te controleren op GFP-expressie. Snijd vervolgens de primaire somatosensorische cortex in secties van 400 micrometer dikte met een vibrator.
Incubeer de plakken in de sucrose bevattende A CSF met 95% O2 en 5% CO2 bij 32 graden Celsius gedurende 30 minuten tot een uur. Breng de plakken daarna over naar de reguliere A CSF bij kamertemperatuur om de laser klaar te maken voor het experiment, zet de laser koelsysteem en voeding aan. Zet vervolgens alle hardware aan die gerelateerd is aan foto stimulatie controle, inclusief het scanspiegelsysteem en optische modulator en elektronische sluiter, en een fotodiode input versterker.
Schakel vervolgens de elektrofysiologische apparatuur zoals multi clamp 700 B versterker en micro manipulatoren in. Elektrofysiologische opnames, foto stimulatie en beeldvorming worden uitgevoerd in de slice perfusiekamer gemonteerd op de gemotoriseerde trap van de microscoop. Schakel vervolgens de beeldvormingscamera in, de slice zal gevisualiseerd worden in de rechtopstaande microscoop met infrarood DIC en epi fluorescente optica via het beeldvormingssysteem.
Open vervolgens de MATLAB-gebaseerde FS software en Q capture camera software op de monitor. Voordat je het experiment uitvoert, controleer het laser foto stimulatie systeem en zorg ervoor dat het in een werkende staat is. Plaats een stuk papier onder de vier x microscoop objectief om het laserscan patroon te observeren terwijl het systeem loopt.
Om de micro-elektrode met vier tot zes mega OM weerstand te maken, trek een glazen elektrode met de pipette puller. Vul vervolgens de elektrode met een interne oplossing die 0,1% biotin bevat voor cellabeling en morfologische identificatie. Schakel vervolgens het geperste perfusiesysteem in om A CSF in de kamer te pompen.
Zorg voor een constante vloeistofniveau van 2,0 millimeter boven de slice in de kamer. Voeg een aliquot van de voorraadoplossing van MNI caged glutamaat toe aan 25 milliliters circulerende A CSF voor een concentratie van 0,2 millimolair caged glutamaat. Breng vervolgens een hersenslice over naar de opnamekamer.
Voer het beeldvormingssysteem uit om de slice kwaliteit te controleren en anatomisch de primaire somatosensorische regio te lokaliseren. Anker vervolgens de slice met een op maat gemaakte stringed platina ring, en zorg ervoor dat je de anker niet over het hersengebied plaatst dat bedoeld is voor opname. Visualiseer de cellen met een 60 x objectief op basis van de visualisatie van GFP-expressie onder een A DIC fluorescente microscoop.
Identificeer en selecteer de remmende celtypen. Let op dat opname zal worden uitgevoerd onder visuele controle geholpen door infrarood DIC. Videobewaking en het schakelen tussen de DIC en fluorescente modi is noodzakelijk om de GFP-cel locatie te bevestigen terwijl de elektrode naar de doelcel wordt verlaagd.
Gebruik de conventionele patch clamp techniek. Breng eerst positieve druk aan op de elektrode. Beweeg het dicht bij het celoppervlak om een herkenbare kuil op het doelcelmembraan te creëren.
Breng vervolgens snel negatieve druk aan om een giga seal te vormen en het binnen te breken van de cel terwijl de stroominjectiereacties op de videomonitor worden gecontroleerd. Na het breken, neem de beelden van de opgenomen GFP-uitdrukkende intra neuron op 60 x vergroting op onder de DIC en fluorescente modi voor online verificatie. Voordat de foto stimulatie gegevens worden verzameld, injecteer hyperpolariserende en depolariserende stroompulsen om de basis elektrofysiologische eigenschappen van elke cel te onderzoeken.
Eenmaal stabiel, gehele cel opname is bereikt met goede toegangsweerstand, die meestal minder dan 20 mega ohm is, schakel de microscoop objectief van 60 x naar vier x vergroting voor laser scanning foto stimulatie, verwerf een slice beeld bij vier x vergroting en gebruik het voor het leiden en registreren van de foto stimulatie sites. Stel de foto stimulatie en data acquisitie parameters in door de configuratieschakel module van phys te activeren. Gebruik een milliseconde laserpuls van ongeveer 20 milliwatt met een stimulus interval van één seconde.
Voor foto stimulatie mapping, verzamel gegevenssporen van één seconde die zijn bemonsterd bij 10 kilohertz. Laad vervolgens het vier x slice beeld in de mapper module van phys. Definieer de locatie van de soma en stel de foto stimulatie sites in van een 16 bij 16 patroon met 80 micrometer bij 80 micrometer.
Ruimte rond de cel locatie, die alle corticale lagen bedekt. Bepaal vervolgens het excitatieprofiel van de opgenomen neuron door de spiking locaties te onderzoeken in reactie op foto stimulatie in de stroomklemmodus. Onze gebruiksvriendelijke software met online weergave functies vergemakkelijkt de mapping experimenten.
Verbind vervolgens de lokale excitatoire circuitverbindingen door de excitatoire post-synaptische stromen van de opgenomen cel te detecteren. Met laser scanning op verschillende locaties
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het in kaart brengen en analyseren van lokale synaptische circuits van specifieke inhiberende corticale neuronen met behulp van laser-scanning fotostimulatie in combinatie met whole-cell registraties in transgene muizen die GFP tot expressie brengen. Deze benadering maakt een gedetailleerd onderzoek mogelijk naar de functionele organisatie van inhiberende neurale circuits.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Neurale circuits
Achtergrond
- Remmende neuronen spelen een cruciale rol bij het reguleren van neurale circuits.
- Transgene muizen die GFP tot expressie brengen, maken gerichte studies naar specifieke neuronpopulaties mogelijk.
- Inzicht in lokale synaptische circuits is essentieel voor het ontrafelen van de hersenfuncties.
- Laser-scanning fotostimulatie is een krachtig instrument voor het bestuderen van synaptische interacties.
Doel van de studie
- Om de lokale functionele organisatie van inhiberende neuronale circuits te onderzoeken.
- Om synaptische input naar specifieke inhiberende neuronen in kaart te brengen.
- Om het begrip van synaptische dynamiek in corticale netwerken te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van levende hersensnijden uit de primaire somatosensorische cortex van muizen.
- Visualisatie en registratie van gerichte GFP-expresserende inhiberende celtypen.
- Laser-scanning fotostimulatie om presynaptische neuronen te activeren.
- Data-analyse voor het genereren van kwantitatieve kaarten van synaptische input.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle mapping van lokale synaptische circuits in specifieke inhiberende neuronen.
- Kwantitatieve analyse van synaptische inputs onthulde onderscheidende patronen.
- Aantoonde de effectiviteit van de gecombineerde techniek voor het bestuderen van neuronale circuits.
- Bood inzichten in de functionele organisatie van inhiberende netwerken.
Conclusies
- De methode biedt een robuuste aanpak voor het bestuderen van inhiberende circuits in de hersenen.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van synaptische interacties in corticale neuronen.
- Deze techniek kan worden toegepast om de dynamiek van neurale circuits verder te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Het in kaart brengen van inhiberende neuronale circuits biedt mechanistische risicoreductie voor doelwitvalidatie bij de ontdekking van geneesmiddelen voor het centrale zenuwstelsel door de functionele synaptische organisatie te onthullen. Deze aanpak ondersteunt het voorspellende vertrouwen in strategieën voor padmodulatie en maakt een datagestuurde triage van therapeutische hypothesen mogelijk. De techniek verbetert de translationele continuïteit van de ontdekkingsfase tot de preklinische beoordeling van drugseffecten op circuitniveau.
Strategische toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & doelwitvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door synaptische inputs in kaart te brengen op specifieke inhiberende neuron-subtypen, waardoor de betrokkenheid van pathways wordt verduidelijkt.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie mogelijk door kwantitatieve beoordeling van targetmodulatie op circuitniveau.
- Predictieve waarde: Ondersteunt portefeuilleselectie door de functionele gevolgen van targetinhibitie op de lokale netwerkdynamiek te onthullen.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door baseline synaptische inputpatronen te definiëren.
- Reproduceerbaarheid: Genereert kwantitatieve kaarten van synaptische inputs die gestandaardiseerde vergelijkingen tussen experimentele condities mogelijk maken.
- Platformnut: Ondersteunt schaalbare evaluatie van verbindingen door readouts van de neuronale respons op circuitniveau te bieden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Brengt inhiberende circuits in ziekterelevante systemen in kaart om deze af te stemmen op translationele biomarkerstrategieën.
- Preklinische Continuïteit: Verbindt circuitmapping uit de ontdekkingsfase met de preklinische validatie van drug-effecten op netwerkniveau.
- Risico-gecorrigeerde Vooruitgang: Informeert go/no-go-beslissingen door compenserende of paradoxale circuitresponsen op targetmodulatie te onthullen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van het testen van doelwithypothesen via leadidentificatie tot preklinische validatie, door functionele read-outs op circuitniveau te verschaft.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en de verduidelijking van signaalpaden door het in kaart brengen van de synaptische organisatie van inhiberende neuronen.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via reproduceerbare kwantificering van synaptische input naar geregistreerde neuronen.
- Analytics: Levert kwantitatieve metingen van synaptische sterkte, latentie en het aantal inputs om vergelijkingen tussen condities te faciliteren.
- Translational Research: Verbindt met preklinische continuïteit door circuit-niveau beoordeling van drugseffecten in ziekterelateerde modellen mogelijk te maken.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een herbruikbare capaciteit voor iteratieve circuitmapping over verschillende doelwitklassen en ziektemodellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende zekerheid bij targetvalidatie door mechanische risicoreductie van effecten op circuitniveau.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid van synaptische inputmapping over laboratoria en studies heen.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door het verminderen van biologische risico's in een late fase als gevolg van onvoorziene circuitadaptaties.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering op basis van kwantitatieve profielen van circuitmodulatie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in elektrofysiologie, laser-scanning fotostimulatie en de omgang met transgene muizen.
- Afhankelijk van laser-scanning fotostimulatiesystemen, elektrofysiologische opstellingen en fluorescentiemicroscopie.
- Vereist standaardisatie tussen teams van stimuleringsparameters, voltage-clampinstellingen en datapipes voor analyse.
- Houdt rekening met aanpassingen bij toepassing op verschillende corticale regio's of ziektemodellen.
- Beperkt door de weefsellevensvatbaarheid en de noodzaak van gezonde hersenplakjes om betrouwbare synaptische responsen te garanderen.
