Kwantificeren agonistische activiteit heeft op G eiwit-gekoppelde receptoren

Het algemene doel van deze procedure is om de relatieve affiniteitsconstante KB van een agonist voor de actieve toestand van een receptor te schatten door middel van analyse van de concentratie-responscurve. Dit wordt bereikt door eerst de concentratie-responscurves te meten van een groep agonisten die een respons uitlokken bij een G-eiwitgekoppelde receptor. De volgende stap van de procedure is het schatten van de eemax- en EC 50-waarden van de agonisten met behulp van niet-lineaire regressieanalyse.

Deze waarden worden vervolgens gebruikt om initiële parameterschattingen te berekenen voor de daaropvolgende niet-lineaire regressieanalyse met het operationele model. Als laatste stap worden relatieve schattingen van de affiniteitsconstanten van agonisten voor de actieve toestand van de receptor verkregen door middel van een globale niet-lineaire regressieanalyse van hun concentratie-responscurves. Uiteindelijk kan, met gebruik van een aangepaste vorm van het operationele model, de affiniteitsconstante van een agonist voor de actieve toestand van een receptor, uitgedrukt relatief aan die van een andere agonist, worden geschat via een globale niet-lineaire regressieanalyse van hun concentratie-responscurves.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen in het veld van geneesmiddelenontwikkeling, zoals de vraag of een agonist selectiviteit heeft voor een specifiek signaleringspad. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege de details van de mathematische analyse. Voor de schatting van relatieve agonist KB-waarden is een reeks van ten minste twee agonist-concentratie-responscurven vereist.

Een bespreking van de overwegingen voor dergelijke experimenten kan worden gevonden in het geschreven protocol. Nadat de responscurves zijn verkregen, trekt u de basale respons af van de respons die is gemeten in aanwezigheid van elke concentratie agonist en begint u de gegevens uit de concentratie-responsexperimenten in een gegevenstabel in te voeren. In de Prism-software worden alle log-agonistconcentraties ingevoerd onder de kolom met het label X. De responsmetingen voor de agonist die de grootste maximale respons of eax-waarde lijkt te hebben, worden ingevoerd in kolom A en die voor andere agonisten worden ingevoerd in de aangrenzende kolommen met letters.

Voer herhaalde metingen van concentratie-responscurven in de subkolommen van een specifieke letterkolom in. Selecteer het grafiekblad waarop de gegevens zijn uitgezet en selecteer 'analyze' om de gegevens te analyseren via niet-lineaire regressieanalyse met de variable slope-vergelijking; zet de parameter 'bottom' op nul en voer de regressieanalyse uit. Noteer de parameters 'top' en log EC 50 voor gebruik bij de berekening van de initiële parameterschattingen.

Om de initiële parameterschattingen te berekenen, wijst u de waarden van log tau K observed toe aan de negatieve log EC 50-waarde van de standaardagonist. Bereken vervolgens de log RAI-waarde van elke testagonist als de logaritme van de hoeveelheid bestaande uit het product van de eemax-waarde van de testagonist vermenigvuldigd met de EC 50 van de standaardagonist, gedeeld door het product van de emax-waarde van de standaardagonist vermenigvuldigd met de EEC 50 van de testagonist. In deze vergelijking worden de parameters van de standaardagonist aangeduid met een apostrof.

Ken vervolgens de logaffiniteitsconstante van de testagonist toe aan de negatieve log van hun respectievelijke EC-waarden. Nadat de gegevens in Prism zijn ingevoerd, moet u ervoor zorgen dat de gegevens van de agonist met de grootste EMAX-waarde in kolom A zijn ingevoerd. Deze agonist wordt nu aangeduid als de standaard, terwijl de overige agonisten worden aangeduid als testagonisten. Voer vervolgens een door de gebruiker gedefinieerde vergelijking log, RAI in Prism in over meerdere regels in.

In dit geval omvat de door de gebruiker gedefinieerde vergelijking in totaal vijf agonisten. Voer de initiële parameterschattingen van receptor R en de affiniteitsconstante van de test-agonisten in. M sis krijgt de EMAX-waarde van de standaardagonist toegewezen en aan M wordt een waarde van één toegewezen.

Voer nu de initiële parameterschattingen in van de log RAI-waarden van de testagonisten. Pas parameterbeperkingen toe door log K1 op nul vast te stellen en door log GR, m, sis en M op een gedeelde waarde voor alle datasets in te stellen. Start vervolgens de niet-lineaire regressieanalyse.

De resultaten leveren de waargenomen log K en log RAI-waarden van de geteste agonisten op voor de schatting van agoniste KB-waarden in absolute eenheden van inverse molaire eenheden; hiervoor worden celgebaseerde vitro-assays gebruikt die constitutieve receptoractiviteit vertonen. Kies de agonisten en ontwerp het experiment zoals beschreven in het geschreven protocol. Bereken de constitutieve receptoractiviteit en de respons op elke concentratie agonist als de gemeten respons minus de basale respons in cellen die niet getransfecteerd zijn met de receptor; hier worden responsen op diverse agonisten getoond die op deze wijze zijn berekend voor een signaleringspad met een zeer lage constitutieve activiteit voor een voorlopige analyse.

Voer eerst de gegevens in Prism in zoals beschreven voor niet-constitutieve activiteit. Bevestig dit. Voer daarnaast de respons veroorzaakt door constitutieve receptoractiviteit in de juiste genummerde kolommen in de rij die correspondeert met een log agonistconcentratie van -20. Hier wordt een groot negatief logaritme ingevoerd om een agonistconcentratie van nul te benaderen.

Analyseer de gegevens zoals voorheen, behalve dat voor de constitutieve activiteit de parameter bottom moet worden beperkt zodat deze gedeeld wordt over alle datasets. Noteer de gedeelde parameter en de parameters top en log EC voor elke agonist. Nadat de log affiniteitsconstante van de standaardagonist in afzonderlijke experimenten is bepaald, wordt de initiële schatting van de log K observed waarde van elke partiële testagonist berekend als het logaritme van de uitdrukking bestaande uit het verschil tussen de emax-waarde van de standaardagonist en de testagonist gedeeld door het product van de EC 50 en het verschil tussen de emax-waarde van de standaardagonist en de constitutieve respons.

Bereken de initiële schatting van log KB voor elke agonist en de initiële schatting van log T cis om de KB-waarden van de agonisten te schatten. Voer de gegevens in Prism in en voeg vervolgens een door de gebruiker gedefinieerde vergelijking toe. Voer Log KB in Prism in op meerdere regels, zoals hier gedemonstreerd voor de conditie met twee agonisten.

Voer vervolgens de initiële parameterschattingen in door de affiniteitsstand van elke agonist op te geven. De schatting voor log T sis, de schatting voor M sis en de schatting voor M worden als volgt toegewezen: M sis krijgt de EMAX-waarde van de standaardagonist en M krijgt een waarde van één. Voer tot slot de initiële schattingen van log kb in.

Pas parameterbeperkingen toe door log K1 vast te stellen op de eerder bepaalde waarde, en door log Tsis, msis en M op een gedeelde waarde voor alle datasets in te stellen. Start de niet-lineaire regressieanalyse. De resultaten leveren de log KB van de standaardagonist, de waargenomen log K en de log KB-waarden van partiële agonisten op.

De maximale respons van het systeem, de log T cys-waarde voor het vrije receptorcomplex en de transducer-hellingsfactor in het hier getoonde operationele model zijn de muscarine-agonist-geïnduceerde fosfoïnositidehydrolyse in Chinese hamsterovariecellen die de M3-muscarine-receptor stabiel tot expressie brengen. De concentratie-responscurves van geselecteerde muscarine-agonisten werden in deze assay gemeten, en de gegevens werden geanalyseerd zoals hier beschreven om de KB-waarde van elke agonist te schatten, uitgedrukt relatief aan die van Oxotremorine-M. De theoretische curves vertegenwoordigen de kleinste-kwadratenfit van de regressievergelijking op de gegevens. De log RAI-schattingen worden getoond voor kabalene, arecoline, pilocarpine en McNeil.

A 3, 4 3. De overeenkomstige schattingen van de maximale respons van het systeem en de hellingsfactor van de transducer werden bepaald. De geobserveerde log K-waarden van de agonisten werden eveneens vastgesteld voor elke getoonde agonist.

Hier zijn de resultaten van experimenten naar muscarine-agonist gestimuleerde fosfoïnositide-hydrolyse in HC 2 93-cellen. Stabiele expressie van G alpha 15 transient expressie van de M drie muscarine-receptor veroorzaakte een toename van de basale fosfoïnositide-hydrolyse, wat werd toegeschreven aan constitutieve receptoractiviteit. De gegevens werden geanalyseerd om de log KB-waarden van Oxo Tremaine M en MacNeil, A 3 43 te schatten.

De theoretische curven representeren de kleinst-kwadratenfit van de regressievergelijking op de gegevens. De log KB-schattingen worden getoond voor Oxo Tremoring M en McNeil, A 3 43. De schatting van de K-waarde waargenomen voor McNeil A 3 43 is eveneens bepaald.

Zodra deze techniek voor data-analyse onder de knie is, kan deze in enkele minuten worden uitgevoerd mits dit correct gebeurt. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe zowel relatieve als feitelijke KB-waarden kunnen worden geschat uit de concentratiereactiecurven van agonisten voor het opwekken van een respons stroomafwaarts in de signaleringsroute van een G-proteïnegekoppelde receptor.