Name: Voorspelling van HIV-1 coreceptor Usage (tropisme) Sequentie analyse met een Genotypische Approach (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Leer HIV-1 coreceptorgebruik voorspellen door sequentieanalyse van de V3-regio van het envelopgen met behulp van geno2pheno. Deze methode ondersteunt gepersonaliseerde antiretrovirale therapie en verbetert behandelingsresultaten voor patiënten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs worden gefinancierd uit de Corus, MedSys Cell Entry, ketting en Resina projecten.

Het protocol wordt samengevat in Fig. 4. 1. Nemen van bloedmonsters <ol><li> Verzamel minimaal 3 ml bloed in EDTA buizen op de klinische locatie. </li><li> De monsters kunnen worden opgeslagen tot een week bij 4 ° C. </li><li> Stuur het EDTA-bloedmonsters zo snel mogelijk naar het laboratorium per gewone post. </li></ol> 2. Isolatie van HIV RNA en / of DNA <ol><li> Verkrijgen viraal RNA en / of DNA van 1000 ui volbloed, serum of plasma, met de Magna Pure Compact nucleïnezuurisolatiemethoden I I kit en de Magna Pure Compact System. </li><li> Elueer het verkregen RNA of DNA in 50 pl TE buffer. Alternatief kunnen andere nucleïnezuren zuiveringsprocedures worden gebruikt. </li></ol> 3. Amplificatie van het env-gebied Amplificeren het env-gebied (figuren 2 en 4) van zowel plasma RNA of proviraal DNA. Een 1245 bp lange product, waarbij de meerderheid van de Env proteïne (nt 6,556 tot 7,811 according tot HXB2) gegenereerd. <ol><li> RNA-monsters: RT-PCR reactie <ol><li> Viral RNA presenteert een zeer complex secundaire structuur (Fig. 4) die de RT-reactie kunnen belemmeren. Om dit probleem te vermijden, incubeer 10 pi RNA bij 65 ° C gedurende 10 minuten (reeds in de PCR buis en in de PCR machine) en verlaag de temperatuur tot 50 ° C. </li><li> Voeg 40 ul van de PCR Master Mix waaronder de primers Env-F en Env-R. Master Mix voor RT-PCR In-House-systeem: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> volume / reactie (pl) </td><td> eindconcentratie </td></tr><tr><td> RNase-free H 2 O </td><td> 14,4 </td><td></td></tr><tr><td> 5x Buffer (Qiagen OneStep RT-PCR Kit) </td><td> 10 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 5x Q-Solution </td><td> 10 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> dNTP Mix (10 mM elk) </td> &lt;td&gt; 2 <td> 400 uM van elk dNTP </td></tr><tr><td> Enzym-Mix (Qiagen OneStep RT-PCR Kit) </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Primer Env-F (100 uM) </td><td> 0,3 </td><td> 0,6 uM </td></tr><tr><td> Primer Env-R (100 uM) </td><td> 0,3 </td><td> 0,6 uM </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor (RNasin) </td><td> 1 </td><td> 5 eenheden / reactie </td></tr></tbody></table> Env-F: 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA 3 '(nt 6556 → 6586 volgens HXB2) Env-R: 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '(nt 7785 ← 7811) </li><li> Voer de RT reactie bij 50 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Lopen de eerste PCR als volgt: <table border="1"><tbody><tr><td> 95 ° C, 15min </td><td> 1 x </td></tr><tr><td> 95 ° C, 30 sec 50 ° C, 30 sec 72 ° C, 2 min </td> 1 x </tr><tr><td> 95 ° C, 30 sec 56 ° C, 30 sec 72 ° C, 2 min </td><td> 38 x </td></tr><tr><td> 72 ° C, 10 min 4 ° C ∞ </td><td></td></tr></tbody></table></li></ol></li><li> DNA monsters: PCR reactie Voor provirale DNA monsters initieel RT-reactie nodig en de PCR reactie kan direct. <ol><li> Voeg 40 ul PCR Master Mix tot 10 pl provial DNA. Master Mix voor PCR In-House-systeem: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> volume / reactie (pl) </td><td> eindconcentratie </td></tr><tr><td> RNase-free H 2 O </td><td> 15,4 </td><td></td></tr><tr><td> 5x Buffer (HotStarTaq DNA Polymerase) </td><td> 10 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 5x Q-Solution </td><td> 10 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> dNTP Mix (10 mM elk) </td><td> 2 </td><td> 400 uM van elk dNTP </td></tr><tr><td> Enzym-Mix (HotStarTaq DNA Polymerase) </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Primer Env-F (100 uM) </td><td> 0,3 </td><td> 0,6 uM </td></tr><tr><td> Primer Env-R (100 uM) </td><td> 0,3 </td><td> 0,6 uM </td></tr></tbody></table> Env-F: 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 '(nt 6556 → 6586) Env-R: 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '(nt 7785 ← 7811) </li><li> Voer het PCR wijze als hiervoor beschreven voor RNA monsters (stap 3.1.4). </li></ol></li></ol> 4. Amplificatie van het V3-gebied: geneste PCR <ol><li> Voor de geneste PCR, met 5 ul van de eerste PCR reactie (zonder voorafgaande analyse agarose gel) als template en voeg 95 ul PCR Master Mix. Master Mix voor Geneste-In-House PCR <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> volume / reactie (pl) </td><td> eindconcentratie </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 61,9 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PCR Buffer </td><td> 10 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 5x Q-Solution </td><td> 20 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> dNTP Mix (10 mM elk) </td><td> 2 </td><td> 200 uM van elk dNTP </td></tr><tr><td> Primer Env-2F (100 uM) </td><td> 0,3 </td><td> 0,6 uM </td></tr><tr><td> Primer Env-2R (100 uM) </td><td> 0,3 </td><td> 0,6 uM </td></tr><tr><td> HotStarTaq DNA Polymerase </td><td> 0,5 </td><td> 2,5 eenheden / reactie </td></tr></tbody></table> Env-2F: 5'-GTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTC -3 '(nt 6838 → 6864) <li> Voer de PCR als volgt: <table border="0"><tbody><tr><td> 93 ° C, 15min </td><td> 1 x </td></tr><tr><td> 95 ° C, 30 sec 50 ° C, 30 sec 72 ° C, 90 sec </td><td> 1 x </td></tr><tr><td> 95 ° C, 30 sec 56 ° C, 30 sec 72 ° C, 90 sec </td><td> 43 x </td></tr><tr><td> 72 ° C, 10 min 4 ° C ∞ </td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Analyseer het PCR product op een 1% agarose gel (Fig. 4). De verwachte product is 902 bp lang. </li><li> Zuivering van de sequentie monsters. <ol><li> Zuiver het PCR product met de Qiagen PCR zuivering kit, met het protocol, oplossingen en micro-kolommen van de leverancier. Elueer in 30 tot 100 ul PE buffer, afhankelijk van de band intensiteit. </li><li> Als alternatief kunnen de monsters worden gezuiverd met ExonucleaseIk en Fast AP (Thermo alkalische fosfatase). Daartoe voeg 6 pl Exo-AP Mix tot 15 pl PCR product en incubeer 15 minuten bij 37 ° C. <table border="1"><tbody><tr><td> 580 pi H 2 O </td></tr><tr><td> 66 ul snel AP </td></tr><tr><td> 13,4 ul Exo I </td></tr></tbody></table></li></ol></li></li></ol> 5. Sequentie reactie van de V3 amplicon <ol><li> De sequentie reactie bestaat uit een PCR reactie met slechts een van de volgende primers: Env-2: 5'-GTACAATGYACACATGGAATTAGGC -3 (nt 6959 → 6980) Env-5: 5'-AAAATTCCCCTCCACAATTA - 3 '(nt 7352 ← 7371) Env-6: 5'-GGCCAGTAGTATCAACTCAAC - 3 '(nt 6979 → 7000) Env-7: 5'-TGTCCACTGATGGGAGGGGC - 3 '(nt 7530 ← 7549) Env-10: 5 '- GCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGC - 3' (nt 7478 ← 7507) Env-11: 5 '- TACATTGCTTTTCCTACTTTCTGCCAC - 3' (nt 7638 ← 7664) Eerste keuze primers zijn: Env-2, Env-6 of Env-7, Env-11 </li><li> Gebruik 1 ui van het gezuiverde V3 amplicon als sjabloon en voeg 9 pi PCR master-mix. Sequencing Master Mix: <table border="1"><tbody><tr><td> 4 pl volgorde mix (HIV-Genotyping Kit) </td></tr><tr><td> 4 ui H 2 O </td></tr><tr><td> Primer 1 pi (100 pmol / ul) </td></tr></tbody></table></li><li> Voer het sequentie reactie als volgt: <table border="0"><tbody><tr><td> 96 ° C, 10 sec </td><td></td></tr><tr><td> 50 ° C, 10 sec </td><td> 36 x </td></tr><tr><td> 60 ° C, 45 sec </td><td></td></tr><tr><td> 4 ° C ∞ </td><td></td></tr></tbody></table></li></ol> 6. Zuivering van de sequentie samples Zuiver sequenties using Sephadex G-50 superfine. <ol><li> Vul het juiste aantal putjes in de "kolom loader" met Sephadex G-50 superfine. Breng de Sephadex de filterplaat MAHVN4510 door draaien. </li><li> Voeg 300 ul Milli-Q H 2 O aan elk putje in de filterplaat en incubeer voor tenminste 3 uur bij 2-8 ° C. </li><li> Centrifugeer de platen gedurende 5 minuten bij 910Xg en 4-15 ° C. Gooi de doorstroom. </li><li> Voeg 10 ul H 2 O product om de sequentie en de sequentie pipet op het opgezwollen Sephadex plaat. </li><li> Het gezuiverde product te krijgen, centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten. 910Xg bij 4-15 ° C en verzamelen en de doorstroming. </li></ol> 7. Sequencing de gezuiverde monsters op de sequencer ABI Prism 3130 XL <ol><li> Voor elke run, veranderen de buffer en controleer het volume van het polymeer (POP7). Indien nodig Vervang het polymeer kolf door een nieuwe. </li><li> De opgeslagen run omstandigheden, waaronder een injectietijd van 18 seconden. </li><li> In deze machine wordt de verzameling van de gegevens van een signaal run met 16 sequentie samples ongeveer 60 min (36 cm capillair) of 150 min (50 cm capillair). </li></ol> 8. Sequence bewerken <ol><li> Gebruik het programma Lasergene (DNA-ster) tot uitlijnen en bewerken van de sequenties (Fig. 5). Andere sequentie bewerkingsprogramma's worden gebruikt. Een "V3-consensus B" en env consensus sequentie als referentie. </li><li> Lasergene creëert een consensus sequentie van het geanalyseerde monster met alle ruwe gegevens en opslaan als FASTA file. Het FASTA bestand is een tekstbestand dat een header met de naam van het monster en de nucleotide sequentie omvat. </li></ol> 9. Sequencing data-interpretatie en tropisme voorspelling <ol><li> Sequencing interpretatie van gegevens wordt uitgevoerd door de web-based interpretatie systeem geno2pheno [coreceptor] ( <a href="http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php">http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/</a>index.php). Voor het tropisme voorspelling kunnen verschillende instellingen worden geselecteerd FPR. De standaardinstelling is afhankelijk van de Duits-Oostenrijkse therapie richtlijnen. Voor FPR ≥ 20%, wordt het virus geclassificeerd als R5 als FPR ≥ 20% en X4 voor FPR &lt;12,5%. </li><li> Upload het FASTA bestand in de server. Deze server vertaalt de nucleotidesequentie in aminozuren, uitgelijnd met de V3-consensus sequentie B en vormt een subtype classificatie. Bovendien genereert een voorspelling van de coreceptor gebruik (Fig. 4) uitgedrukt als valse meldingen (FPR). </li></ol> 10. Representatieve resultaten De geno2pheno [coreceptor] uitgang toont een gegradeerde interpretatie van de tropisme. Afhankelijk van de waarschijnlijkheid van het coreceptor gebruik, de interpretatie van tekst en achtergrond kleur varieert van groen (&lt;20% FPR), hetgeen duidt op een veilige toediening voor MVC, naar geel, wijst op een mogelijke, laag risico en uiteindelijk in rood. Rood is de kleur suggererenING niet aan MVC voorschrijven. Bovendien genereert de server een pdf rapport dat kan worden afgedrukt, gevuld met patiënt en voorbeeldgegevens en naar de arts. Voorbeelden van geno2pheno [coreceptor] uitgang afgebeeld in Fig. 6. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur. 1. Schematische replicatie van HIV. Het virion moet binden aan de cellulaire receptor CD4 als en de CCR5 of CXCR4 coreceptor als bedoeld. De co-receptor CCR5 kan worden geblokkeerd met CCR5-antagonisten zoals Maraviroc (MVC, Celsentri, Selzentry). Na fusie van de virale en cellulaire membranen wordt het virale nucleocapside model in het cytoplasma. De nucleocapside demonteert en het virale RNA complex wordt vrijgemaakt in het cytoplasma. Het virale reverse transcriptase (RT) transcribeert het genoom RNA in provirale DNA, dat vervolgens wordt getransporteerd naar de nucleus en geïntegreerd in het gastheergenoom door HIV integrase. Cellulair RNA polymerasen transcribe virale genoom en messenger RNA uit het provirale genoom. De virale eiwitten in het cytoplasma en naar het celoppervlak. De virusdeeltjes knop als onrijpe, niet-infectueuze virionen uit de cellen. De HIV-protease splitst de eiwitten produceren aan besmettelijke deeltjes. Remming van een van de stappen leidt tot een onderbreking van de replicatiecyclus. De anti-retrovirale geneesmiddelen en de replicatie stap die ze remmen zijn rood gemarkeerd. Het virale RNA en proviraal DNA (materiaal dat wordt gebruikt voor het tropisme of weerstand analyse) zijn gemarkeerd in het groen. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. HIV provirale genoom. Het HIV deeltje gebouwd met verschillende structurele eiwitten huizen en diverse enzymen en eiwitten zowel tegen virale en cellulaire oorsprong. Het cijfer tonens de locatie van de genen in het virale genoom. De oppervlakte-eiwitten gp120 en gp41 vormen spikes op het oppervlak van het virion en contact de menselijke cel om de membraanfusie te voeren. In het onderste deel van de figuur zijn de PCR amplificatieproducten en de primers die in ons protocol getoond. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Percentage van de patiënten met een lage virale belasting (VL) metingen geanalyseerd voor drug-weerstand of tropisme bepaling bij het ​​Instituut voor Virologie, Universiteit van Keulen (Duitsland). <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Algemeen schema van de experiment .. Gelieve <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3264/3264fig4_lg.jpg">Klik hier</a> voor een grotere versie van deze figuur te zien. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Sequence bewerken met Lasergene. V3 Het amplicon gesequentieerd met ten minste een voorwaartse en een achterwaartse primer. Lasergene alignes de ". Abi" bestanden verkregen uit de sequencer met de referentie sequenties "V3-Consensus B" en env. Lasergene wordt een consensussequentie met alle rijen gegevens. De referentie sequenties worden gemarkeerd (en dan grijs getoond) zodat deze niet bijdragen aan het monster consensussequentie. <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6. Tropisme voorspelling rapporten die door het geno2pheno [coreceptor] tool.The rapporten worden gegenereerd als pdf-bestanden die kunnen worden opgeslagen en voltooid in de computer. Aanvullende gegevens zoals ons patiënt naam, datum van bloed extractie, enz., kan handmatig worden opgenomen met behulp van een pdf writer programma. Specifieke opmerkingen kunnen ook worden toegevoegd. These gegevens zijn exclusief op de computer van de gebruiker en niet op de geno2pheno [coreceptor] server. Gelieve <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3264/3264fig6_lg.jpg">Klik hier</a> voor een grotere versie van deze figuur te zien.

<ol><li>Heger, E., Schuelter, E., Klimkait, T., Lengauer, T., Kaiser, R., Walter, H., Sierra, S. European coreceptor proficiency panel test. 9th European Workshop on HIV & Hepatitis Treatment Strategies & Antiviral Drug Resistance, Paphos, Cyprus, , (2011).</li>
<li>Lengauer, T., Sander, O., Sierra, S., Thielen, T., Kaiser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatic+prediction+of+HIV+coreceptor+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotech%22%5BJournal%5D)">Bioinformatic prediction of HIV coreceptor usage.</a> Nature Biotech. 25 (12), 1407-1410 (2007).</li>
<li>McGovern, R., Dong, W., Zhong, X., Knapp, D., Thielen, A., Chapman, D., Lewis, M., James, I., Valdez, H., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population-based+Sequencing+of+the+V3-loop+Is+Comparable+to+the+Enhanced+Sensitivity+Trofile+Assay+in+Predicting+Virologic+Response+to+Maraviroc+of+Treatment-na+ve+Patients+in+the+MERIT+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Population-based Sequencing of the V3-loop Is Comparable to the Enhanced Sensitivity Trofile Assay in Predicting Virologic Response to Maraviroc of Treatment-na ve Patients in the MERIT Trial.</a> 17th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, San Francisco, USA, , (2010).</li>
<li>Reuter, S., Braken, P., Jensen, B., Sierra-Aragon, S., Oette, M., Balduin, M., Kaiser, R., Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+in+treatment-experienced+patients+with+HIV-1+infection+-+experience+from+routine+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Med.+Res%22%5BJournal%5D)">Maraviroc in treatment-experienced patients with HIV-1 infection - experience from routine clinical practice.</a> Eur. J. Med. Res. 15 (6), 231-237 (2010).</li>
<li>Recordon-Pinson, P., Soulie, C., Flandre, P., Descamps, D., Lazrek, M., Charpentier, C., Montes, B., Trabaud, M. A., Cottalorda, J., Schneider, V., Morand-Joubert, L., Tamalet, C., Desbois, D., Mace, M., Ferre, V., Vabret, A., Ruffault, A., Pallier, C., Raymond, S., Izopet, J., Reynes, J., Marcelin, A. G., Masquelier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+genotypic+prediction+of+HIV-1+coreceptor+use+versus+a+phenotypic+assay+and+correlation+with+the+virological+response+to+maraviroc%3A+the+ANRS+GenoTropism+study%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the genotypic prediction of HIV-1 coreceptor use versus a phenotypic assay and correlation with the virological response to maraviroc: the ANRS GenoTropism study.</a> Antimicrob. Agents. Chemother. 54 (8), 3335-3340 (2010).</li>
<li>Swenson, L. C., Knapp, D., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+and+accuracy+of+the+geno2pheno+co-receptor+algorithm+for+predicting+HIV+tropism+for+single+and+triplicate+measurements+of+V3+genotype%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Calibration and accuracy of the geno2pheno co-receptor algorithm for predicting HIV tropism for single and triplicate measurements of V3 genotype.</a> 10th International Congress on Drug Therapy in HIV Infection, Glasgow, UK, , (2010).</li>
<li>Macartney, M. J., Cameron, J., Strang, A., García, A., Booth, C., Marshall, N., Johnson, M., Geretti, A. M. Use of a genotypic assay for the prediction of HIV-1 coreceptor tropism and guiding the use of CCR5 antagonists in clinical practice. 8th European HIV Drug Resistance Workshop, Sorrento, Italy, , (2010).</li>
<li>Sierra, S., Thielen, A., Reuter, S., Jensen, B., Esser, S., Fätkenheuer, G., Lengauer, T., Pfister, H., Sichtig, N., Kaiser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropism+determination+and+clinical+outcome+of+61+patients+under+MVC+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Tropism determination and clinical outcome of 61 patients under MVC treatment.</a> 8th European HIV Drug Resistance Workshop, Sorrento, Italy, , (2010).</li>
<li>Obermeier, M., Carganico, A., Bieniek, B., Schleehauf, D., Dupke, S., Fischer, K., Freiwald, M., Neifer, S., Schuler, C., Mayr, C., Klausen, G., Köppe, S., üünsche, T., Berg, T., Baumgarten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropism+testing+from+proviral+DNA+-+analysis+of+a+subgroup+from+the+Berlin+Maraviroc+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Tropism testing from proviral DNA - analysis of a subgroup from the Berlin Maraviroc cohort.</a> 8th European HIV Drug Resistance Workshop, Sorrento, Italy, , (2010).</li>
<li>Vandekerckhove, L. P., Wensing, A. M., Kaiser, R., Brun-Vezinet, F., Clotet, B., De Luca, A., Dressler, S., Garcia, F., Geretti, A. M., Klimkait, T., Korn, K., Masquelier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+guidelines+on+the+clinical+management+of+HIV-1+tropism+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">European guidelines on the clinical management of HIV-1 tropism testing.</a> Lancet Infect Dis. 11 (5), 394-407 (2011).</li>
<li>Walter, H., Eberle, J., Möller, H., Noah, C., Wolf, E., St rmer, M., Braun, P., Krn, K., D umer, M., Berg, T., Obermeier, M., Thielen, A., Kaiser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Empfehlung+zur+Bestimmung+des+HIV-1-Korezeptor-Gebrauchs+%28DAIG+Recommendations+for+the+HIV-1+tropism+testing%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Empfehlung zur Bestimmung des HIV-1-Korezeptor-Gebrauchs (DAIG Recommendations for the HIV-1 tropism testing).</a> , (2011).</li>
<li>Obermeier, M. J., Carganico, A., Dupke, S., Schranz, D., Cordes, C., Freiwald, M., Klausen, G., Köppe, S., Schuler, C., Mayr, C., Schleehauf, D., Berg, T., Krznaric, I., Baumgarten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+application+of+genotypic+co-receptor+tropism+testing+from+viral+RNA+and+proviral+DNA%3A+week+24+analysis+of+the+Berlin+maraviroc+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+International+AIDS+Society%22%5BJournal%5D)">Clinical application of genotypic co-receptor tropism testing from viral RNA and proviral DNA: week 24 analysis of the Berlin maraviroc cohort.</a> Journal of the International AIDS Society. 13, Suppl . 4. 129-129 (2010).</li>
<li>Toma, J., Frantzell, A., Hoh, R., Martin, J., Deeks, S., Petropoulos, C., Huang, W. Determining HIV-1 Co-receptor Tropism Using PBMC Proviral DNA Derived from Aviremic Blood Samples. 18th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, San Francisco, USA, , (2010).</li>
</ol>

Deze video artikel wordt gesponsord door ViiV Healthcare en GlaxoSmithKline.

De V3-sequentie maakt een betrouwbare voorspelling virale tropisme, zoals getoond in klinische studies 3-9. In feite is genotypische bepaling overwogen in de huidige Europese en Duitse-Oostenrijkse richtlijnen 10. Vergeleken met fenotypische testen niet alleen de omzet korter (gelijk aan resistentietest), maar ook zijn de kosten. Daarnaast is een groot voordeel van genotypische testen is dat de resultaten worden als FPR en kan dus worden aangepast aan de behoeften van de patiënt. Trofile resultaten, daarentegen, zijn gewoon R5 of X4 rapporten en toegang tot de ruwe data niet gegeven. Op dit moment, de Europese richtlijnen suggereren een FPR cut-off van 20% 10, terwijl de Oostenrijks-Duitse richtlijnen laten de aanpassing van het FPR cut-off specifiek aan de behoeften van elke patiënt 11. In deze lijn, voor patiënten met een breed scala van antiretrovirale geneesmiddelen opties, hogere FPR cut-offs (&gt; 20%) zijn aanbevelingbeëindigd. Daarentegen voor zwaar voorbehandelde patiënten met een beperkte therapeutische opties, lagere FPR cut-offs (&gt; 5%) worden gebruikt. Deze vorm van therapie begeleiding is momenteel aan de gang door de weerstand testen om NRTI&#39;s, NNRTI&#39;s, PI&#39;s, en Inis, waar een deel-actieve geneesmiddelen kunnen worden opgenomen in de behandeling van patiënten met een verminderde therapeutische opties. Bovendien, met een groeiend aantal genotypisch-begeleide therapie veranderingen, de klinisch relevante FPR cut-offs worden voortdurend bijgesteld door een panel van bio-informatici, virologen en clinici. Een ander belangrijk voordeel van de genotypische tropisme testen is de mogelijkheid te analyseren klinische monsters met zeer lage of niet detecteerbare viral load (VL). In deze gevallen, wanneer plasma RNA niet amplificeerbaar is, kan het provirale DNA gesequeneerd worden en gebruikt voor betrouwbare voorspellingen 9,12. Van de nota, is het aantal patiënten met een lage of niet detecteerbare viral load sterk toegenomen in de laatste jaren. Tot dusverre heeft de Trofiel test laat alleen de analyse van monsters van patiënten met VL &lt;1000 kopieën / ml. Echter hebben voorlopige studies aangetoond dat proviraal DNA kan ook worden adecuate worden getest door Trofile 13.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Magna Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 04 802 993 001 </td><td></td></tr><tr><td> Magna Pure Compact System </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 03731146001 </td><td></td></tr><tr><td> T3000 Thermocycler </td><td> Biometra </td><td> 050 tot 723 </td><td></td></tr><tr><td> One Step RT-PCR Kit </td><td> Qiagen </td><td> 210215 </td><td></td></tr><tr><td> HotStarTaq Master Mix Kit </td><td> Qiagen </td><td> 203445 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick PCR Purification Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28106 </td><td></td></tr><tr><td> Exonuclease I (Exo I) </td><td> Fermentas </td><td> EN0582 </td><td></td></tr><tr><td> FastAP Thermosensitive alkalische fosfatase </td><td> Fermentas </td><td> EF0651 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4337457 </td><td></td></tr><tr><td> Sephadex G-50 superfijne </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0041-01 </td><td></td></tr><tr><td> ABI Prism 3130 XL capillaire sequencer </td><td> Applied Biosystems </td><td> 3130XL </td><td></td></tr></tbody></table>

voorspelling van hiv-1 coreceptor usage (tropisme) sequentie analyse met een genotypische approach

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is de eerste goedgekeurde antiretrovirale geneesmiddel van de klasse van co-receptor antagonisten. Het bindt aan de coreceptor CCR5 gastheer die wordt gebruikt door de meeste HIV-stammen om de menselijke immune cellen (Fig. 1) infecteren. Andere HIV-isolaten een andere coreceptor, de CXCR4. Die receptor wordt gebruikt, wordt bepaald door het virus Env-eiwit (Fig. 2). Afhankelijk van de coreceptor, worden de virussen geclassificeerd als R5 of X4 respectievelijk. MVC bindt aan de CCR5 receptor remmen van de opneming van R5 virussen in de doelcel. In de loop van de ziekte, kan X4 virussen ontstaan ​​en groeien de R5 virussen. Bepaling van coreceptor gebruik (ook wel tropisme) is daarom absoluut noodzakelijk voor toediening van MVC, waarop door EMA en FDA. De studies voor MVC efficiëntie te motiveren, MERIT en 1029 zijn uitgevoerd met de Trofile bepaling van het Monogram, San Francisco, Verenigde Staten Dit is een hoge kwaliteit assay gebaseerd op Sophisticated recombinant tests. De aanvaarding van deze test voor de dagelijkse routine is vrij laag buiten de Verenigde Staten, omdat de Europese artsen eerder de neiging om te werken met decentrale deskundige laboratoria, die ook voorzien gelijktijdige weerstand testen. Deze laboratoria hebben ondergaan verschillende kwaliteitsborging evaluaties, de laatste wordt gepresenteerd in 2011 1. Sinds enkele jaren, hebben wij controlewerkzaamheden uitgevoerd tropisme vaststellingen op basis van sequentie-analyse van de HIV env-V3-gen regio (V3) 2. Deze regio draagt ​​voldoende informatie om een ​​betrouwbare voorspelling te voeren. De genotypische bepaling van coreceptor gebruik biedt voordelen zoals: kortere doorlooptijd (gelijk aan het testen van resistentie), lagere kosten, de mogelijkheid om de resultaten aan te passen aan de behoeften van de patiënt en de mogelijkheid van het analyseren van klinische monsters met een zeer lage of zelfs niet-detecteerbare viral load (VL ), met name omdat het aantal monsters geanalyseerd met VL &lt;1000 kopieën / ulruwweg toegenomen in de laatste jaren (Fig. 3). De voornaamste stappen voor tropisme testen (Fig. 4) toonde in deze video: 1. Verzamelen van een bloedmonster 2. Isolatie van het HIV RNA uit het plasma en / of HIV proviraal DNA van mononucleaire bloedcellen 3. Amplificatie van het env-gebied 4. Amplificatie van het V3 gebied 5. Sequentie reactie van de V3 amplicon 6. Zuivering van de sequentie samples 7. Sequencen van het gezuiverde monsters 8. Sequence bewerken 9. Sequencing data-interpretatie en tropisme voorspelling

De voorspelling van de coreceptor gebruik van HIV-1 is vereist voor de toediening van een nieuwe klasse antiretrovirale geneesmiddelen, namelijk coreceptor antagonisten. Het kan worden uitgevoerd door sequentieanalyse van de<em&gt; Env</em&gt; Gen en de daaropvolgende interpretatie door middel van een op internet gebaseerde interpretatie systeem (geno2pheno<sub&gt; [Coreceptor]</sub&gt;).

Voorspelling van HIV-1 coreceptor Usage (tropisme) Sequentie analyse met een Genotypische Approach

Maraviroc (MVC) is het eerste goedgekeurde antiretrovirale geneesmiddel uit de klasse van coreceptorantagonisten. Het bindt aan de coreceptor CCR5 van de gastheer, die wordt gebruikt door ...

<a class="grey_button" href="http://www.jove.com/video/4153"> Spaans </a>

prediction-hiv-1-coreceptor-usage-tropism-sequence-analysis-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De kroon van de verschillende regio V3 lus sequenties van het oppervlak enveloppe glycoproteïne (gp120) van HIV-1 kan structureel worden gekarakteriseerd in veel gevallen door in silico vouwing van de posities 10 tot 22 van de lus met behulp van een...

Beoordeling van immunologisch relevante Dynamic tertiaire structurele kenmerken van de HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence door Ab initio Folding

HIV tropisme kan worden afgeleid uit de V3 gebied van de virale envelop. V3 is PCR geamplificeerde in drievoud met geneste RT-PCR, in volgorde, en geïnterpreteerd met behulp van bio-software. Monsters met met 1 of meer sequentie (s) met een lage G2P scores worden geclassificeerd als niet-R5-virus.

Genotypische Inferentie van HIV-1 tropisme de populatie-gebaseerde Sequencing van V3

Kwantificeren niveaus van HIV-1 RNA in het plasma en de volgorde single HIV-1 genoom van individuen met een viral load onder de detectielimiet (50-75 kopieën / ml) is moeilijk. Hier beschrijven we hoe te winnen en te kwantificeren plasma virale RNA met behulp van een real-time PCR-test die een betrouwbare maatregelen HIV-1 RNA beneden tot 0,3 kopieën / ml en hoe virale genomen versterken door enkele genoom, van monsters met een zeer lage viral load.

Versterken en kwantificeren van HIV-1 RNA in HIV-geïnfecteerde personen met een viral load onder de limiet van de Opsporing van Standard Clinical Assays

Drug resistentie testen voor HIV-1 geïnfecteerde individuen falende antiretrovirale therapie (ART) kan toekomstige therapieën begeleiden en verbeteren behandelingsresultaten. Het optimaliseren van de individuele en de bevolking gezondheidsresultaten in hoge HIV-prevalentie, maar met beperkte middelen zal uiteindelijk vereisen betaalbaar en toegankelijk resistentie genotypering en interpretatie methoden.

Een betaalbare HIV-1 drug-resistentie Monitoring Methode voor het met beperkte middelen

HIV-1-pathogenese wordt bepaald door zowel virale kenmerken als genetische factoren van de gastheer. Hier beschrijven we een robuuste methode die reproduceerbare metingen mogelijk maakt om de impact van de gag gensequentieverschil op de in vitro replicatiecapaciteit van het virus te beoordelen.

Een restrictie-enzym Based Klonen Methode om de Beoordelen<em&gt; In vitro</em&gt; Replicatie Capaciteit van HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Virussen

Groeiconcurrentie tussen bijna isogene virussen biedt een gevoelige meting voor het bepalen van relatieve replicatiefitheid. De hier beschreven protocollen omvatten de constructie van recombinante HIV-1-klonen, viruspropagatie en groeiconcurrentie en analysemethoden geoptimaliseerd om gevoelige en consistente resultaten op te leveren.

Paarsgewijze Groei Competitie Assay voor het bepalen van de Replicatie Fitness van Human Immunodeficiency Virussen

We beschrijven een protocol voor het amplificeren van retrovirale integratieplaatsen vanuit het genomische DNA van geïnfecteerde cellen, het sequencen van de versterkte virus-gastheer grenzen, en vervolgens het in kaart brengen van deze sequenties naar een referentie-genoom. We beschrijven ook technieken om de verdeling van integratieplaatsen te kwantificeren ten opzichte van verschillende genomische annotaties met behulp van BEDTools.

Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites

Full-length individuele proviraal sequencing (FLIPS) een efficiënte en hoog-productie methode voorziet in de versterking en sequentiebepaling van één, in de buurt van full-length (intact en defecte) HIV-1 proviruses en zorgt voor de bepaling van hun potentieel replicatie-competentie. FLIPS overwint beperkingen van eerdere tests ontworpen om de volgorde van het latente reservoir van HIV-1.

Versterking van in de buurt van Full-length HIV-1 Proviruses voor Next-Generation Sequencing

Hier presenteren we een diepe rangschikken benadering waarmee een onbevooroordeelde bepaling van ontluikende 3'-termini en vogelgriepvirus profielen van single-stranded DNA moleculen. De belangrijkste toepassing is de karakterisatie van ontluikende retrovirale complementaire Ani (cDNAs), de tussenproducten die tijdens het proces van retrovirale omgekeerde transcriptie gegenereerd.

Bepalende 3'-Termini en sequenties van ontluikende Single-Stranded virale DNA moleculen tijdens HIV-1 Reverse transcriptie in geïnfecteerde cellen

RNA haarspelden en lussen kunnen fungeren als primers voor reverse transcriptie (RT) bij afwezigheid van sequentie-specifieke primers, interfereren met de studie van overlappende antisense transcripten. We hebben een techniek ontwikkeld die in staat is om streng-specifiek RNA te identificeren, en we hebben het gebruikt om HIV-1 antisense Protein ASP te bestuderen.

Detectie van humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) antisense protein (ASP) RNA transcripten bij patiënten door onderdeel-specifieke RT-PCR

Leer HIV-1 coreceptorgebruik voorspellen door sequentieanalyse van de V3-regio van het envelopgen met behulp van geno2pheno. Deze methode ondersteunt gepersonaliseerde antiretrovirale therapie en verbetert behandelingsresultaten voor patiënten.

Voorspelling van HIV-1 coreceptor Usage (tropisme) Sequentie analyse met een Genotypische Approach

Meer video's verkennen