Voorspelling van HIV-1 coreceptor Usage (tropisme) Sequentie analyse met een Genotypische Approach

Het algemene doel van het volgende experiment is het voorspellen van het gebruik van de co-receptor door HIV-1 voor de toediening van een nieuwe klasse antiretrovirale geneesmiddelen. Dit wordt bereikt door de virale genomische nucleïnezuren, viraal RNA of proviraal DNA uit het bloed van de patiënt te isoleren, gevolgd door amplificatie van de envelope-regio. De virale V3-regio, die de belangrijkste determinant is voor tropisme, wordt geamplificeerd via nested PCR.

Vervolgens wordt het V3-amplicon gesequenced met verschillende primers om een fasta-bestand te genereren. De resultaten tonen het virale tropisme en de gevoeligheid voor coreceptor-antagonisten, gebaseerd op de fout-positieve ratio (FPR) zoals verkregen via de online interpretatietool geno to pheno coreceptor. Afhankelijk van het CORECEPTOR-gebruik worden HIV-virussen geclassificeerd als R5 of X4.

Maraviroc bindt aan de CCR5-receptor, waardoor de toegang van R5-virussen tot de doelcel wordt geremd. Tijdens het verloop van ziekte X kunnen X4-virussen ontstaan die de R5-virussen overvleugelen. De bepaling van het receptorgebruik, ook wel tropisme genoemd, is daarom verplicht voorafgaand aan de toediening van maraviroc, zoals vereist door de EMA en FDA.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat men zeer eenvoudig een parallelle bepaling van de resistentie tegen andere klassen antiretrovirale geneesmiddelen kan uitvoeren. Deze methode maakt een veel meer gepersonaliseerde geneeskunde mogelijk, aangezien de afkapwaarden voor de tropismeresultaten kunnen worden aangepast aan de behoeften van de patiënt. We kregen het idee voor deze methode aan het begin van de jaren negentig, toen we de moleculaire basis wilden kennen van de verschillende celtuurgroei van HIV-stammen en de ziekteprogressie bij patiënten; de procedure wordt gedemonstreerd door een technicus uit onze groep voorafgaand aan de start van dit protocol.

Monsters worden op de klinische locatie afgenomen als EDTA-bloed en naar het laboratorium gestuurd om HIV-nucleïnezuren te isoleren uit 1000 µL volbloedserum of plasma met behulp van het mag pure compact-systeem en een nucleïnezuur-isolatiekit volgens de instructies van de fabrikant. Het verkregen RNA of DNA wordt vervolgens opgelost in 50 µL TE-buffer. De volgende stap is het amplificeren van de envelope-regio van het nucleïnezuur via reverse transcription PCR voor RNA of simpelweg PCR voor DNA zoals beschreven in de tekst; de reactie moet een product van 1.245 basenparen genereren dat het grootste deel van de envelope-proteïneregio omvat. Om de V3-regio van het envelope-proteïne te amplificeren, volgt men met een nested PCR waarbij 5 µL van de eerste PCR-reactie als template wordt gebruikt.

Bereid de reacties voor met de mastermix voor nested in-house PCR zoals beschreven in de tekst. De parameters voor het uitvoeren van de nested PCR staan daar ook vermeld. Analyseer na amplificatie van de V3-regio het PCR-product via gelelectroforese om het verwachte product van 902 basepaar lengte te verifiëren voordat u overgaat tot sequencing.

Zuiver het PCR-product zoals beschreven in het geschreven protocol. Zodra het PCR-product is gezuiverd, voert u de sequentiereactie uit zoals uiteengezet in de tekst. Zuiver na voltooiing van de reactie de sequentiemonsters met cidex G 50 superfine en een multi-screen filterplaat met durapore-membraan, volgens de instructies in het geschreven gedeelte van deze procedure. Om het gezuiverde product te sequensen, bereidt u de sequencer voor door de polymeer te controleren en de buffer te vervangen.

Laad vervolgens de monsters, stel de condities in en start de run. Na de sequencing-run kan het DNA STAR laser gene-programma worden gebruikt om de sequenties uit te lijnen en te bewerken.

Het V3-amplicon wordt gesequenced met ten minste één forward- en één reverse-primer. LaserGene lijnt de ABI-bestanden die van de sequencer zijn verkregen uit met de referentiesequenties. Met de functie V3, consensus B en envelope in LaserGene wordt een consensussequentie van het geanalyseerde monster gemaakt met behulp van alle beschikbare ruwe data, zonder de referenties, en deze wordt opgeslagen als een FASTA-bestand.

Het FASTA-bestand is een tekstbestand dat een header met de naam van het monster en de nucleotidevolgorde bevat. Om te beginnen met de interpretatie van de gegevens en de voorspelling van het tropisme, uploadt u het FASTA-bestand in het webgebaseerde interpretatiesysteem. Geno Tono co-receptor selecteert de FPR-afkapwaarde tot welke het virus als R vijf wordt geclassificeerd.

Volgens de Duitse richtlijnen wordt het virus geclassificeerd als R5 wanneer de FPR groter is dan of gelijk is aan 20%, en als X4 wanneer de FPR minder dan 12,5% is. Selecteer eventuele aanvullende klinische parameters indien beschikbaar, en selecteer vervolgens 'align and predict'. Deze server vertaalt de nucleotidevolgorde naar aminozuren, lijnt deze uit met de V3 consensus B-sequentie en produceert een subtypeclassificatie. Daarnaast genereert het een voorspelling van het co-receptorgebruik, uitgedrukt als FPR.

De output vertoont een graduele interpretatie afhankelijk van de waarschijnlijkheid van het gebruik van de co-receptor. Bij hoge FPR-waarden is men er vrij zeker van dat het virus geen X four is, en bij een lage FPR is men onzeker over het uiterlijk van het virus als de interpretatie, tekst en achtergrondkleur groen zijn. Een veilige toediening van Ravi Rock wordt dan aangegeven, terwijl geel wijst op een mogelijk laag risico bij het gebruik van Ravi Rock, en rood aangeeft dat Ravi Rock niet voorgeschreven mag worden.

Daarnaast genereert de server een PDF-rapport dat kan worden geprint en naar de arts kan worden verzonden. Aanvullende gegevens, zoals de naam van de patiënt of de datum van de bloedafname, kunnen handmatig worden toegevoegd met behulp van een PDF-schrijfprogramma. Op de computer van de gebruiker kunnen in privacy specifieke opmerkingen worden toegevoegd.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de virale chops kunt bepalen met behulp van de geno pheno receptor tool. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om regelmatig kwaliteitscontroles uit te voeren. Vergeet niet dat werken met HIV uiterst gevaarlijk kan zijn; neem daarom altijd voorzorgsmaatregelen en maak gebruik van geautoriseerde biologische beveiligingslaboratoria.