Voorspelling van HIV-1 coreceptor Usage (tropisme) Sequentie analyse met een Genotypische Approach

Het algemene doel van het volgende experiment is om het co-receptorgebruik van HIV een te voorspellen voor de toediening van een nieuwe klasse van antiretrovirale geneesmiddelen. Dit wordt bereikt door de virale genomische nucleïnezuren, viraan RNA of proviraal DNA uit het bloed van de patiënt te isoleren na amplificatie van de envelopregio. De virale V drie-regio, die de belangrijkste determinant voor tropisme is, wordt geamplificeerd door nested PCR.

Vervolgens wordt de V drie-amplicon gesequenced met verschillende primers om een fasta-bestand te genereren. Er worden resultaten verkregen die het virale tropisme en de gevoeligheid voor coreceptorantagonisten tonen op basis van de vals positieve snelheid of FPR zoals verkregen door de online interpretatietool geno naar feno coreceptor. Afhankelijk van het CORECEPTOR-gebruik worden HIV-virussen geclassificeerd als R vijf of X vier.

Miri rock bindt via de CCR vijf-receptor en remt de binnenkomst van R vijf-virussen in de doelcel. Tijdens het verloop van de ziekte kunnen X vier-virussen opduiken en de R vijf-virussen overgroeien. De beëindiging van receptorgebruik, ook wel tropisme genoemd, is daarom verplicht vóór toediening van maraviroc zoals geëist door EMA en FDA.

Het grote voordeel van deze techniek is dat men gemakkelijk een parallelle bepaling van de resistentie tegen andere antiretrovirale geneesmiddelenklassen kan maken. Deze methode maakt veel meer gepersonaliseerde geneeskunde mogelijk, omdat de drempels voor de tropismeresultaten kunnen worden aangepast aan de behoeften van de patiënt. We hadden het idee voor deze methode aan het begin van de jaren negentig toen we de moleculaire basis van de verschillende celcultuurgroei van HIV-stammen wilden kennen en de ziekteprogressie bij patiënten die de procedure demonstreerden, zal een technicus uit onze groep dit protocol vóór het begin starten.

Steekproeven worden verzameld als EDTA-bloed op de klinische locatie en naar het laboratorium gestuurd om te beginnen met het isoleren van HIV-nucleïnezuren uit 1000 microliters totaal bloedserum of plasma met behulp van het mag pure compact-systeem en het nucleïnezuurisolatiekit volgens de instructies van de fabrikant. Het verkregen RNA of DNA wordt vervolgens geaald in 50 microliter TE-buffer. De volgende stap is het amplificeren van de envelopregio van het nucleïnezuur door reverse transcriptie-PCR voor RNA of eenvoudigweg PCR voor DNA, zoals beschreven in de tekst, de reactie moet een product van 1.245 basenparen genereren dat het grootste deel van de envelopproteineregio omvat om de V drie-regio van het envelopproteine te amplificeren, volg met nested PCR met vijf microliters van de eerste PCR-reactie als sjabloon.

Bereid de reacties voor met behulp van de mastermix voor nested in-house PCR zoals beschreven in de tekst. De uitvoeringsparameters voor nested PCR worden daar ook beschreven. Na amplificatie van de V drie-regio, analyseer het PCR-product om het verwachte product met een lengte van 902 basenparen te verifiëren door middel van gelelektroforese voordat het wordt gesequenced.

Zuiver het PCR-product zoals beschreven in het geschreven protocol. Nadat het PCR-product is gezuiverd, voer de sequencingreactie uit zoals beschreven in de tekst na voltooiing van de reactie. Zuiver de sequencingmonsters met cidex G 50 superfine en een multi-screenfilterplaat met durapore-membraan volgens de instructies in het geschreven gedeelte van deze procedure om het gezuiverde product te sequentiëren, bereid de sequencer voor door de polymeer te controleren en de buffer te verversen.

Laad vervolgens de monsters, stel de voorwaarden in en start de run. Na de sequencing-run kan het DNA STAR laser gene-programma worden gebruikt om de sequenties uit te lijnen en te bewerken.

De V drie-amplicon wordt gesequenced met ten minste één voorwaartse en één achterwaartse primer. Laser gene lijnt de ABI-bestanden die zijn verkregen van de sequencer uit met de referentiesequenties. V drie, consensus B en enveloplaser gene creëren een consensussequentie van het geanalyseerde monster met behulp van alle beschikbare ruwe gegevens, maar niet de referenties en slaat deze op als een FASTA-bestand.

Het FASTA-bestand is een tekstbestand dat een koptekst bevat met de naam van het monster en de nucleotidesequentie. Om de data-interpretatie en tropismevoorspelling te beginnen, uploadt u het FASTA-bestand naar het webgebaseerde interpretatiesysteem. Geno Tono co-receptor selecteert de FPR-drempelwaarde waarboven het virus als R vijf wordt geclassificeerd.

Volgens de Duitse richtlijnen wordt het virus geclassificeerd als R vijf. Wanneer FPR groter dan of gelijk is aan 20% en als X vier, wanneer FPR minder dan 12,5% is, selecteer eventuele aanvullende klinische parameters indien beschikbaar en selecteer, align en predict Deze server vertaalt de nucleotidesequentie in aminozuren, lijnt deze uit met de V drie consensus B-sequentie en produceert een subtypeclassificatie. Bovendien genereert het een voorspelling van het co-receptorgebruik, uitgedrukt als FPR.

De uitvoer toont een gegradeerde interpretatie afhankelijk van de waarschijnlijkheid van het co-receptorgebruik. Voor hoge FPR-waarden is men er vrij zeker van dat het virus niet X vier is en voor lage FPR is men onzeker over hoe het virus eruitziet als de interpretatie, tekst en achtergrondkleur groen zijn. Veilige toediening voor Ravi Rock is geïndiceerd, terwijl geel een mogelijk laag risico voor het gebruik van Ravi Rock suggereert en rood geeft aan dat Ravi Rock niet mag worden voorgeschreven.

Bovendien genereert de server een PDF-rapport dat kan worden afgedrukt en naar de arts kan worden gestuurd. Aanvullende gegevens zoals de naam van de patiënt of de datum van bloedextractie kunnen handmatig worden opgenomen met behulp van een PDF-schrijfprogramma. In de privacy van de computer van de gebruiker kunnen ook specifieke opmerkingen worden toegevoegd.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de virale chops kunt bepalen met behulp van de geno feno receptortool Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om regelmatig kwaliteitscontroles uit te voeren. Vergeet niet dat het werken met HIV buitengewoon gevaarlijk kan zijn, dus voorzorgsmaatregelen en geautoriseerde biologische veilige laboratoria moeten altijd worden gebruikt.