Name: Ice-Cap: Een methode voor het kweken Arabidopsis En tomatenplanten in 96-well platen voor high-throughput genotypering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Leer de Ice-Cap-methode voor high-throughput genotypering van Arabidopsis en tomatenplanten in 96-well platen. Deze techniek maakt niet-destructieve wortelharvesting mogelijk voor efficiënt DNA-extractie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door een subsidie ​​van de National Science Foundation (subsidie ​​aantal MCB-0447750).

<ol><li>Clark, K. A., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+An+improved+high-throughput+method+for+generating+tissue+samples+in+96-well+format+for+plant+genotyping+%28Ice-Cap+2.0%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0).</a> Plant Methods. 3, 8-8 (2007).</li>
<li>Krysan, P. I. ce-cap <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+capturing+plant+tissue+samples+for+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis.</a> Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).</li>
<li>Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+map-based+cloning+in+the+post-genome+era%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era.</a> Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).</li>
<li>Liljegren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHATTERPROOF+MADS-box+genes+control+seed+dispersal+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis.</a> Nature. 404, 766-770 (2000).</li>
<li>Buechel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+A-type+ARABIDOPSIS+RESPONSE+REGULATORS+in+meristem+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration.</a> Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).</li>
<li>Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+kinase+gene+family+encodes+essential+positive+regulators+of+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis.</a> Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).</li>
<li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iTILLING%3A+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).</li>
<li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILLING%3A+practical+single-nucleotide+mutation+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery.</a> Plant J. 45, 684-694 (2006).</li>
<li>Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILLING.+Traditional+mutagenesis+meets+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics.</a> Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).</li>
<li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+%28TILLING%29+for+plant+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De Ice-Cap-methode hier gepresenteerde laat een wetenschapper om weefselmonsters te verzamelen van honderden of zelfs duizenden, van individuele planten in een enkele dag en efficiënt genomische DNA-extract van deze monsters voor gebruik in de genotypering reacties. Door het geven van een individuele wetenschapper de mogelijkheid om duizenden zaailingen genotype in een korte periode van tijd, de Ice-Cap-methode heeft het potentieel om een ​​aantal genetische experimenten die anders niet zou praktisch zijn om uit te voeren te vergemakkelijken. Een aantal voorbeelden worden hieronder gegeven. <ol><li> Genetische Mapping. Fine-scale genetische mapping kan worden versneld als de onderzoeker in staat is om recombinatie gebeurtenissen te identificeren binnen een bepaald interval langs het chromosoom 3. Als dit interval gaat om een ​​zeer korte genetische afstand, dan is de recombinatie gebeurtenissen zullen relatief zeldzaam zijn in de segregerende mapping bevolking. Om deze reden kan het nodig zijn om het scherm van duizenden individuele planten op de gewenste re vindenCombinant individuen. Dit kan aanzienlijk worden versneld door het gebruik van Ice-Cap. Zelfs in het tijdperk van de genoom-brede re-sequencing, is het nog steeds noodzakelijk is om direct aan te tonen dat een bepaalde mutatie is direct verantwoordelijk voor een fenotype van belang. In deze gevallen zal het nodig zijn om de mutatie van de rente af te scheiden van andere nauw met elkaar verbonden mutaties in om aan te tonen een kandidaat-mutatie is eigenlijk oorzakelijke. In deze situaties, zouden Ice-Cap bieden een efficiënte methode voor het verbreken koppeling tussen een paar nauw verbonden mutaties. </li><li> Multi-mutanten. Het is gemeengoed geworden voor onderzoekers bestuderen van Arabidopsis aan mutant allelen van een aantal verschillende loci te combineren in een enkel individu om functionele redundantie 4-6 te overwinnen. Als voorbeeld, overweeg een zaak waar men wenst te mutante allelen combineren van vier verschillende loci in een enkele plant door middel van genetische kruising. Voor dit project, zal het nodig zijn om een ​​te genererenn individu dat heterozygoot is op deze vier loci, als onderdeel van de kruising regeling. Wanneer deze quadruple-sets heterozygote zaad, is de viervoudige homozygote verwacht aanwezig te zijn bij een snelheid van een van de 256 in de resulterende populatie van nageslacht. Screening voor deze zeldzame individu door traditionele methoden zou nogal arbeidsintensief. Ter vergelijking, zou de wetenschapper met behulp van Ice-Cap voor dit project te voorzien van een efficiënte strategie voor het identificeren van de zeldzame quadruple homozygote in een enkele generatie. </li><li> iTILLING. Ons laboratorium onlangs beschreef een nieuwe benadering voor screening op de aanwezigheid van de geïnduceerde mutaties in interessante genen in Arabidopsis 7. Deze methode is een variatie op een bestaande techniek genaamd Tilling die wordt gebruikt om mutaties vinden in geordende populaties van mensen die werden behandeld met een chemisch mutageen 8-10. We hebben onze methode iTILLING want het is een geïndividualiseerde versie van bewerken die het mogelijk maakt een individual wetenschapper iets dat traditioneel verplicht een groot onderzoeksteam in te vullen bereiken. Ice-Cap vormt een integraal onderdeel van de iTILLING methode 7, zoals hieronder beschreven. </li></ol> Het idee achter iTILLING is het produceren van een kortstondige mutant bevolking, die staat in tegenstelling tot de duurzame populaties mutant gemaakt voor de traditionele bewerken projecten. Voor iTILLING, worden zaden van een bulk M2 bevolking gezaaid in 50 tot 100 Ice Cap blokken, en DNA wordt geëxtraheerd met behulp van de Ice-Cap-methode. Arabidopsis zaailingen worden dan geplaatst bij 4 ° C, terwijl mutatie screening is uitgevoerd met behulp van de Ice-Cap-DNA preps. Tomaat zaailingen worden bewaard bij 12 ° C. Zodra zaailingen uitvoeren gewenste mutaties zijn geïdentificeerd, worden ze hersteld van de Ice-Cap platen en overgebracht naar de bodem. iTILLING is niet bedoeld als een langdurige mutant bevolking voor een hele onderzoeksgemeenschap te voorzien om het scherm. In plaats daarvan, iTILLING biedt een strategie waarmeeeen wetenschapper kan het scherm een ​​aangepaste mutant bevolking voor mutaties in een handvol genen snel, efficiënt en tegen een relatief lage kosten. Wij hebben gevonden Ice-Cap aan een effectieve methode voor het kweken van en genotypering Arabidopsis, tomaat en rijst. We verwachten dat andere soorten van planten ook moet worden ontvankelijk voor Ice-Cap. Een beperking van de verscheidenheid van soorten die kunnen worden opgevangen door Ice-Cap is de grootte van de zaden. Alleen planten met zaden klein genoeg om in de putjes van een 96-wells plaat zal compatibel zijn met Ice-Cap in de huidige configuratie.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Commentaar (optioneel) </td></tr><tr><td> GenoGrinder </td><td> Spex / CertiPrep, Metuchen, NJ </td><td> 2000 Geno / Grinder </td><td> Machine voor het schudden Root platen voor DNA-extractie </td></tr><tr><td> ABgene Thermo-Sealer </td><td> ABgene USA </td><td> AB-0384 </td><td> Handmatige warmte sealmachine gebruikt om Root Plates voorafgaand aan de weefsel verstoring </td></tr><tr><td> Centrifuge uitgerust met swingende microplaat carriers </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra 25R </td><td> Elke centrifuge met swingende microplaat dragers geschikt zou zijn </td></tr><tr><td> MicroFill Microplate Dispenser </td><td> BioTek www.biotek.com </td><td> AF1000A </td><td> Geautomatiseerde vloeistof dispenser voor het vullen van microplaten </td></tr><tr><td> BIALETTI merk17x11 inch Commerciële Grote Cookie Sheet </td><td> Target Warenhuis </td><td> www.bialetti.com </td><td> Deze specifieke bakplaat heeft de ideale diepte voor Ice-Cap </td></tr><tr><td> Custom Made Metal Rack </td><td> Hardware Store </td><td></td><td> Zie de tekst voor een volledige beschrijving </td></tr><tr><td> 33 Liter plastic opbergdoos </td><td> Target Warenhuis </td><td> Sterilite Brand </td><td> Voor de Ice-Cap Fountain. Plastic opbergdoos groot genoeg om de 17x11 inch bakpapier te houden </td></tr><tr><td> 30 liter per uur Fountain Pump </td><td> Sunterra </td><td> 104506 </td><td> Kleine dompelpomp fontein pomp verkrijgbaar bij de tuin aanbod winkels </td></tr><tr><td> Slang voor fontein pomp </td><td> Elke lab leveringsbedrijf </td><td></td><td> Slang compatibel met fontein pomp </td></tr><tr><td> Kunststof klem </td><td> Hardware Store </td><td></td><td> Klem om de slang vast te houden cookiesvel </td></tr><tr><td> Doorzichtige plastic deksels van Falcon Microtest vlakke bodem 96-well polystyreen platen </td><td> BD Falcon www.bdbiosciences.com </td><td> 351172 </td><td> Doorzichtige plastic deksels voor het afdekken van Ice-Cap Seedling Plates </td></tr><tr><td> 3M Micropore chirurgische tape </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19-027-761 </td><td></td></tr><tr><td> 3/32-inch diameter roestvrij stalen ballen </td><td> Hartford Technologies, Rocky Hill, CT </td><td> 034 tot 006-1K </td><td> Gebruikt om de wortel weefsel kan verstoren na de oogst </td></tr><tr><td> 3 inch Elastische haarbanden </td><td> De plaatselijke supermarkt </td><td></td><td> Gebruikt om Root Plate vast te zetten Seedling Plate </td></tr><tr><td> 4 mm houten spiesjes </td><td> De plaatselijke supermarkt </td><td></td><td> Deze spiesjes worden gewoonlijk gebruikt om kabobs voor te bereiden </td></tr><tr><td> Fisher Scientific Nunc merk, een-mL filterplaten zonder frit </td><td> Fisher Scientific </td><td> 278012 </td><td> 96-wells Seedling platen met gaten in de bodem. </td></tr><tr><td> Fisherbrand 96-Well Tall-Schoorsteen PCR Plate </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-230-242 </td><td> 96-well platen Root </td></tr><tr><td> Agar-agar - celkweek getest </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1296 </td><td></td></tr><tr><td> 4-Morpholinoethanesulfonic acid (MES) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2933 </td><td></td></tr><tr><td> Murashige en Skoog (MS) basale zoutmengsel </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-5524 </td><td></td></tr><tr><td> Easy Peel warmte afdichtingsfolie </td><td> ABgene USA </td><td> AB-0745 </td><td> Warmte afdichting film voor het afdichten van Root Platen voorafgaand aan de weefsel verstoring </td></tr><tr><td> Duck Extra Wide Brand Packaging Tape, 3.00 &quot;x 54,6 m </td><td> OfficeMax www.officemax.com </td><td> Artikelnr. 21242139 </td><td> Plakbandvoor het afdichten van microplaten met DNA-extracten voor opslag </td></tr><tr><td> Afdichting Roller </td><td> Bio-Rad </td><td> MSR-0001 </td><td> Hand held rollende hulpmiddel voor het persen van klevende afdichtingsband op microplaten </td></tr><tr><td> 96-well metalen thermische blok </td><td> Cole-Parmer </td><td> 36400-66 </td><td> Gebruikt om de Root Platen voor tissue oogst bevriezen </td></tr><tr><td> Whatman filterpapier </td><td> Whatman International </td><td> 1002 090 </td><td> Gebruikt worden voor oppervlaktebehandeling steriliseren zaden </td></tr><tr><td> Wegwerp Pasteur pipet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13 tot 678-6A </td><td> 5 ¾ &quot;disposable Pasteur pipet wordt gebruikt voor het overbrengen van zaden om Seedling Plate </td></tr><tr><td> Pyrex ovenschaal (20 cm x 30 cm) </td><td> Target Warenhuis </td><td></td><td> Gebruikt om een ​​droogijs / ethanol bad te bouwen. </td></tr></tbody></table>

ice-cap: een methode voor het kweken arabidopsis en tomatenplanten in 96-well platen voor high-throughput genotypering

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Het wordt steeds vaker voor planten wetenschappers aan projecten die de genotypering van grote aantallen planten vereisen. De eerste stap in een genotypering project is om een ​​weefsel te verzamelen van elke individuele plant. De traditionele benadering van deze taak is om te proeven planten een-op-een-keer. Als men wil genotype honderden of duizenden mensen, maar het gebruik van deze strategie resulteert in een belangrijk knelpunt in de genotypering pijplijn. De Ice-Cap methode die we beschrijven hier biedt een high-throughput oplossing voor deze uitdaging doordat een wetenschapper om weefsel te verzamelen van enkele duizenden zaailingen in een enkele dag 1,2. Dit niveau van de doorvoer wordt mogelijk gemaakt door het feit dat weefsel wordt geoogst uit planten 96-bij-een-time, in plaats van een-op-een-keer. De Ice-Cap-methode biedt een geïntegreerd platform voor het uitvoeren van groei van zaailingen, weefsel oogst en DNA-extractie. De basis voor Ice-Cap is de groei van seedliNGS in een gestapelde paar van 96-wells platen. De putten van de bovenste plaat bevat stekkers van agar groei media waarop de individuele zaailingen ontkiemen. De wortels groeien naar beneden door de agar media, de bovenste plaat af te sluiten door middel van een gat, en gaan over in een onderplaat met water. Om de oogst weefsel voor DNA-extractie, het water in de onderste plaat met wortel weefsel snel bevroren, terwijl de zaailingen in de bovenste plaat blijven bij kamertemperatuur. De bovenste plaat wordt vervolgens uit de buurt van de onderste plaat geschild, waardoor een plaat met 96 wortel weefselmonsters bevroren in ijs en een plaat met 96 levensvatbaar zaailingen. De techniek is de naam &quot;Ice-Cap&quot;, omdat het gebruik maakt van ijs vast te leggen de wortel weefsel. De 96-well plaat met de zaailingen kunnen dan verpakt in folie en overgebracht naar lage temperatuur. Dit proces opschort verdere groei van de zaailingen, maar heeft geen invloed op hun levensvatbaarheid. Zodra genotype analyse is afgerond, kan zaailingen met de gewenste genotype worden overgedragen van de 96-wells plaat de bodem voor verdere vermeerdering. We hebben aangetoond dat het nut van de Ice-Cap methode met behulp van Arabidopsis thaliana, tomaat en rijst zaailingen. We verwachten dat de methode ook moeten gelden voor andere soorten van planten met zaden klein genoeg om in de putjes van 96-wells platen.

De Ice-Cap-methode maakt het mogelijk om planten te kweken in 96-well platen en niet-destructieve oogst wortel weefsel van elke zaailing. DNA geëxtraheerd uit deze wortel weefsel kan worden gebruikt voor genotypering reacties. We hebben gevonden dat Ice-Cap goed werkt voor<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt;, Tomaat en rijst zaailingen.

Ice-Cap: Een methode voor het kweken Arabidopsis En tomatenplanten in 96-well platen voor high-throughput genotypering

Het wordt steeds gebruikelijker dat plantwetenschappers projecten ontwikkelen die de genotypering van grote aantallen planten vereisen. De eerste stap bij elke genotypering ...

Het algemene doel van dit experiment is het isoleren van wortelweefselmonsters van plantzaailingen, gekweekt in 96-wellplaten, voor DNA-extractie en genotypering. Dit wordt bereikt door eerst zaailingen te laten kiemen in speciale 96-wellplaten die agar-groeimedium bevatten en gaten in de bodem van elke well hebben. De tweede stap is om de zaailingplaat bovenop een standaard 96-wellplaat te stapelen die is gevuld met water.Zodra de wortels naar beneden in de onderste 96-wellplaat zijn gegroeid, worden de gestapelde platen in een vriesblok geplaatst om het water in de onderste plaat te laten bevriezen. De laatste stap is om de bovenste plaat van de onderste plaat af te pellen, waardoor de wortels, die in de onderste plaat zijn bevroren, worden afgebroken. Uiteindelijk kunnen de resulterende wortelweefselmonsters worden gebruikt om DNA-monsters van elke individuele plant te extraheren voor genotypeanalyse.Het belangrijkste voordeel van ice cap ten opzichte van alternatieve methoden is dat het mogelijk maakt om DNA van duizenden planten in één dag te isoleren. Dit productiviteitsniveau is haalbaar omdat planten bij ice cap in groepen van 96 worden verwerkt, in plaats van de traditionele methode waarbij planten één voor één worden behandeld. Enkele voorbeelden van het gebruik van ice cap zijn het screenen van grote plantpopulaties om zeldzame recombinanten te identificeren tussen nauw gekoppelde IDE-genererende planten die een groot aantal verschillende in kaart gebrachte mutaties dragen, en het uitvoeren van marker-ondersteunde selectie bij gewassoorten.In principe kan elk experiment waarbij genotyping van grote aantallen individuele planten kosten met zich meebrengt, potentieel profiteren van het icecap-vat. We hebben icecap oorspronkelijk ontwikkeld voor gebruik bij konijnenabcessen, maar we hebben ook succes behaald bij het verzamelen van weefsel van rijst- en tomatokiemplanten. We verwachten dat icecap ook effectief zal zijn bij andere soorten, zolang hun zaden klein genoeg zijn om in een 96-wells plaat te passen.Wikkel eerst de zaailingplaten in folie en autoclaveer deze gelijktijdig. Week de transparante plastic deksels van de zaailingplaten in 95%ethanol nadat de autoclaveercyclus is voltooid; laat de zaailingplaten en deksels vervolgens grondig drogen in een laminaire flowkast. Zodra de platen volledig droog zijn, brengt u verpakkingstape aan op de bodem van elke zaailingplaat en sluit u deze stevig af met een roller.Gebruik vervolgens een microplaatdispenser voor microvullingen of een meerkanaals pipetteerhulpmiddel om 450 µL gesmolten groeimedium in de putjes van elke zaailingplaat te dispenseren. Dek de platen af met plastic deksels en laat het groeimedium stollen bij kamertemperatuur. Strooi droge zaden op watman-filterpapier en dek elk zaad grondig af met 95% ethanol.Laat de zaden vervolgens grondig aan de lucht drogen. Draag de zaden daarna over naar de kiemplaten door eerst het vlamgesteriliseerde uiteinde van een aangepaste glazen pipette op het oppervlak van het agarmedium te plaatsen. Dit bevochtigt de punt van de pipette, waardoor een enkel zaadje gemakkelijk kan worden opgepikt en op het agaroppervlak kan worden overgebracht.Zodra elke put een zaadje bevat, wordt elke kiemplaat afgedekt met een transparant plastic deksel en afgesloten met micropore chirurgische tape. Wikkel de gestapelde platen in aluminiumfolie en bewaar ze vier dagen bij vier graden Celsius om de zaden te stratificeren en de kieming te synchroniseren. Plaats de kiemplaten na vier dagen nog eens vier dagen onder fluorescent licht bij 18 tot 20 graden Celsius.Om de kieming te starten, wordt de ijskapfontein op een plank in de plantengroeikamer geplaatst, zodat het oppervlak van de ijskapfontein direct fluorescent licht ontvangt. Voor de assemblage: plaats eerst de op maat gemaakte rekstructuur in een plastic opbergbox en plaats vervolgens een bakplaat hierbovenop.Gebruik de nivelleringsmoeren om het niveau van de bakplaat af te stellen. Plaats vervolgens een dompelpomp in de opbergbak en bevestig de uitlaatslang van de pomp aan de zijkant van de bakplaat met een veerclamp. Vul daarna de ijskapfontein met een mengsel van drie delen gedestilleerd water en één deel kraanwater.Voeg water toe totdat de dompelpomp zich enkele centimeters onder het waterniveau bevindt. Markeer het uiteindelijke waterniveau in de plastic opbergbak met laboratoriumtape en een markerpen. Bereid de wortelplaten voor door in elke put van een 96-well wortelplaat één roestvrijstalen balletje te plaatsen.Dispenseer vervolgens 340 µL van een mengsel bestaande uit drie delen gedistilleerd water op één deel kraanwater in elke put van de wortelplaat. Verwijder de plakfolie van de onderkant van de zaailingenplaten en neem de transparante plastic deksels eraf.Plaats elke plaat met zaailingen in een wortelplaat die een metalen bol en water bevat en bevestig de gekoppelde platen aan elkaar met twee elastieken. Plaats vervolgens de gestapelde platen in de ice cap-fontein. De gekoppelde plaat moet gedurende 10 tot 14 dagen in de ice cap-fontein blijven staan.Houd gedurende deze tijd het waterniveau in de ijskapfontein op peil door gedestilleerd water bij te vullen. Zodra het wortelweefsel van de meeste zaailingen door de wortelplaten is gedrongen, verwijdert u de platen uit de ijskapfontein ter voorbereiding op het oogsten van het wortelweefsel. Nadat de platen uit de ijskapfontein zijn verwijderd, steekt u drie houten prikkers tussen de putjes van de gestapelde zaailing- en wortelplaten.De spiesjes tillen de randen van de zaailingplaatjes uit de putjes van de wortelplaten. Laat de gestapelde ijskapplaatjes met de ingevoegde houten spiesjes een nacht onder lampen staan. Deze incubatie zorgt voor een lichte verdamping van de vloeistof in de wortelplaten, wat het daaropvolgende vriesproces en de scheiding van de plaatjes vergemakkelijkt.Bereid op de dag van de weefselname een vriesbad voor. Plaats een metalen thermische block voor 96 wells in een Pyrex-schaal met een mengsel van droogijs en 95% ethanol. Laat het thermische block ongeveer 20 minuten acclimatiseren tot de gewenste temperatuur.Plaats de gestapelde ice cap-platen met houten prikkers op het gekoelde thermische blok en incubeer vijf minuten. Gedurende deze tijd zal het water in de wortelplaat volledig bevriezen. Verwijder de gestapelde ice cap-platen uit het vriesbad en plaats ze op de laboratoriumbank bij kamertemperatuur; verwijder vervolgens de elastiekjes en de houten prikkers van de gestapelde platen.Druk stevig op de bovenkant van de zaailingplaat om de platen te breken. Pel vervolgens voorzichtig de wortelplaat en de zaailingplaten van elkaar. Laat het water in de wortelplaten ontdooien bij kamertemperatuur.Anders kan het ontdooien worden versneld door de wortelplaten in een thermoblok te incuberen. Stel een temperatuur van 25 °C in terwijl de wortelplaten ontdooien. De zaailingplaten kunnen worden klaargemaakt voor opslag.Om dit te doen, wordt het onderste deel van de zaailingplaat afgedicht met plakband. Plaats vervolgens een transparant plastic deksel op de zaailingplaat en bevestig dit met micropore-tape.Stapel de platen met zaailingen op elkaar, wikkel ze in aluminiumfolie en plaats de arabidopsis-zaailingen bij vier graden Celsius. De zaailingen kunnen gedurende enkele weken bij deze temperaturen worden bewaard zonder dat dit de levensvatbaarheid beïnvloedt. Zorg ervoor dat het water in de wortelplaten volledig is ontdooid.Inspect vóór het uitvoeren van de DNA-extractieprocedure de platen om te bepalen of sommige wells aanzienlijk minder water bevatten dan gemiddeld; pipetteer gedestilleerd water in de wells die extra water nodig hebben. Pipetteer vervolgens 25 µL van een 500 mM TRIS 50 mM EDTA-oplossing in elke well van de wortelplaat. Sluit daarna de wells van de wortelplaten af met thermische sealfolie en een heat-sealing machine.Plaats de verzegelde wortelplaten in de geno grinder-machine, waarbij de verzegelde zijde van de platen naar beneden is gericht. Schud de platen in de geno grinder gedurende drie en een half minuut bij 1 350 slagen per minuut. Verplaats de platen naar een centrifuge met microplaatcarriers en centrifugeer de platen 10 minuten bij 3 500 RPM bij vier graden Celsius om het gepulveriseerde wortelweefsel te pelletiseren.Breng met een meerkanaals pipet 20 µL supernatant van elke put van de wortelplaat over naar een nieuwe 96-well plaat die in elke put 80 µL milli Q-water bevat. Dit verdunde extract bevat genomisch DNA dat direct kan worden gebruikt in de genotyperings-PCR-reactie volgens standaardprotocollen. Zodra het genotype van elke zaailing is geïdentificeerd, worden de zaaiingsplaten uit de koude opslag gehaald en worden potten met waterverzadigd grondmengsel voorbereid; gebruik perslucht en een rubberen slang om voorzichtig luchtdruk uit te oefenen op het kleine gaatje in de put van de zaaiingsplaat, zodat de agaropplugging en de zaailing uit de plaat op de labtafel springen.Maak een klein gaatje in de bodem, ongeveer ter grootte van de agarplug. Plaats vervolgens de agarplug in de bodem en druk vochtige aarde rondom de agarplug aan om de kiemplant in de bodem te fixeren. Plaats de verpotte kiemplanten onder licht bij 18 tot 22 °C.Dek elke pot gedurende de eerste twee dagen na het overplanten af met een plastic deksel. Verwijder vervolgens het deksel en kweek de plant onder standaard kweekomstandigheden. Deze afbeelding illustreert Arabidopsis-zaailingen die twee weken lang in de ice cap fountain zijn gekweekt en klaar zijn voor de weefselwinning.Elk van de twee putjes bevat een Arabidopsis-zaailing. Dit zijaanzicht van dezelfde twee putjes van de wortelplaat laat zien dat de wortels zich om het binnenste oppervlak van de putjes winden. Deze techniek kan worden gebruikt om tot 40 icecap-platen in een dag van acht uur te verwerken.Hierdoor kan één wetenschapper in één enkele dag DNA-preparaten maken van meer dan 3.800 individuele zaailingen. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken de kweekplaten direct in de ijskapfontein over te brengen zodra de zaailingen ontkiemen. Controleer de platen dagelijks, zodat u het juiste moment voor de overdracht niet mist. Veel succes met uw experimenten.

ice-cap-method-for-growing-arabidopsis-tomato-plants-96-well-plates

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ca2 + signalering reguleert diverse biologische processen in planten. Hier presenteren we benaderingen voor het toezicht op abiotische stress geïnduceerde ruimtelijke en temporele Ca2 + signalen in Arabidopsis cellen en weefsels met behulp van de genetisch gecodeerde Ca 2 +-indicatoren Aequorin of Case12.

Meten Ruimtelijke en temporele Ca 2 + Signalen in Arabidopsis Planten

Dit artikel beschrijft de methoden voor het screenen van de genen die plasmodesmal doorlaatbaarheid en dus auxine verloop tijdens trope respons. Dit omvat het meten van de mate van respons in tropische hypocotyl   van Arabidopsis thaliana en controleren plasmodesmal permeabiliteit door 8-hydroxypyreen-1,3,6-trisulfonzuur (HPTS) laad- en tenslotte callose niveau assessment.

Een strategie om de rol van callose gemedieerde Plasmodesmal Poortsignalen in de Tropic Response valideren

Met behulp van DNA assembly kunnen meerdere CRISPR vectoren parallel worden geconstrueerd in een enkele klonen reactie, waardoor de bouw van grote aantallen vectoren CRISPR een eenvoudige taak. Tomaat harige wortels zijn een uitstekend model systeem om CRISPR vectoren te valideren en het genereren van mutant materialen.

High-throughput CRISPR Vector Constructie en karakterisering van DNA Wijzigingen van Generation van Tomato Hairy Roots

Het doel van deze studie was om te bepalen van de effecten van bleekmiddel en chloor gas sterilisatie op kiemkracht van zaad van een bereik van Arabidopsis genotypen geteeld op steriele media. Geoptimaliseerde sterilisatie protocollen zijn ontwikkeld om te voorkomen dat de groei van microbiële verontreinigingen terwijl het verstrekken van bevredigende zaad overleven.

Gestandaardiseerde methode voor High-throughput sterilisatie van Arabidopsis zaden

Een scherm met hoge doorvoersnelheid van synthetische kleine moleculen vond plaats op de model plantensoorten, Arabidopsis thaliana. Dit protocol, ontwikkeld voor een liquid handling robot, verhoogt de snelheid van voorwaartse chemische genetica schermen, versnellen van de ontdekking van nieuwe kleine moleculen beïnvloeden de plantenfysiologie.

Optimaliseren van het gebruik van een Liquid Handling Robot uit te voeren van een hoge doorvoersnelheid vooruit chemische genetica scherm van Arabidopsis thaliana

Het is vaak noodzakelijk om te beoordelen van de potentiële cytotoxiciteit van een reeks van verbindingen op gekweekte cellen. Hier beschrijven we een strategie om betrouwbaar op te schermen voor giftige stoffen in een 96-well formaat.

Een strategie om verbindingen te identificeren die van invloed zijn op de celgroei en overleving in gekweekte zoogdiercellen bij een lage tot matige doorvoer

Een zachte touch-Force laad machine is opgebouwd uit menselijke haar borstels, robotarmen en een controller. De haar borstels worden aangedreven door robotarmen die op de machine zijn geïnstalleerd en bewegen periodiek om touch-Force op planten toe te passen. De sterkte van machinaal aangedreven haar aanrakingen is vergelijkbaar met die van handmatig aangebrachte aanrakingen.

Een arbeidsbesparende en herhaalbare Touch-Force signalering Mutant screen protocol voor de studie van Thigmomorphogenesis van een model plant Arabidopsis thaliana

Dit artikel beschrijft twee methoden voor het kwantificeren van verdediging reacties in Arabidopsis thaliana na blootstelling aan immuun uitlokken: de voorbijgaande oxidatieve uitbarsting, en de remming van zaailing groei.

Patroon-geactiveerde oxidatieve burst en zaailing groeiremming assays in Arabidopsis thaliana

De zaailing overstromingstest vergemakkelijkt een snelle screening van wilde tomaten toetredingen voor de weerstand tegen de Pseudomonas syringae bacterie. Deze test, gebruikt in combinatie met de zaailing bacteriële groei test, kan helpen bij het verder karakteriseren van de onderliggende weerstand tegen de bacterie, en kan worden gebruikt om het scherm mapping populaties om de genetische basis van resistentie te bepalen.

High-Throughput Identificatie van resistentie tegen Pseudomonas syringae pv. Tomaat in Tomaat met seedling Flood Assay

Het vertalen van ribosoomaffiniteitszuivering (TRAP) biedt de mogelijkheid om ontwikkelingsprogramma's te ontleden met minimale verwerking van organen en weefsels. Het protocol levert hoogwaardig RNA op uit cellen die zijn gericht op een groene fluorescerende eiwit (GFP)-gelabelde ribosomalsubunit. Downstream analysetools, zoals qRT-PCR of RNA-seq, onthullen weefsel- en celtypespecifieke expressieprofielen.

Het vertalen van Ribosome Affinity Purification (TRAP) om Arabidopsis thaliana Root Development te onderzoeken op een cell type-specifieke schaal

Hier beschrijven we een geavanceerd hulpmiddel dat is ontworpen voor het monitoren van de biosynthese van chlorofyl tijdens de vroege stadia van de de-etiolatie van Arabidopsis-zaailingen . De nieuwe methodologie biedt niet-invasieve real-time chlorofylfluorescentiebeeldvorming met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.

Niet-invasieve test voor bepaling van de kinetiek van chlorofylbiosynthese tijdens vroege stadia van de-etiolatie van Arabidopsis

Leer de Ice-Cap-methode voor high-throughput genotypering van Arabidopsis en tomatenplanten in 96-well platen. Deze techniek maakt niet-destructieve wortelharvesting mogelijk voor efficiënt DNA-extractie.

Ice-Cap: Een methode voor het kweken Arabidopsis En tomatenplanten in 96-well platen voor high-throughput genotypering

Meer video's verkennen