Efficiënte Recombinant Parvovirus productie met de hulp van Adenovirus-afgeleide systemen

Het algemene doel van deze procedure is om recombinante parvovirussen, of rec PV's, te produceren met hoge titers, terwijl hun kwaliteit behouden blijft en de productietijden en -kosten worden verminderd. Dit wordt bereikt door eerst een initiële rec PV-virale stock te produceren via transfectie van HEC 2 9 3 T-cellen met rec PV-plasmiden, samen met een vector afgeleid van adenovirus type vijf. De introductie van ad-genomische elementen in de HEC 2 9 3 T-cellen verhoogt namelijk de productie van rec PV's met meer dan tienvoudig.

In vergelijking met bestaande protocollen is een nieuwe AD VP-helper gegenereerd die de genomische adenovirale elementen bevat die nodig zijn om de productie van recombinant parvovirus te verhogen, evenals de parvovirus VP-geneunit. De volgende stap is om deze nieuwe ADD VP-helper te produceren en te zuiveren volgens standaardprotocollen.

De laatste stap in deze procedure is het amplificeren van de rec PVS door NB three 20 4K-cellen te co-infecteren met de rec PV- en AD ADP-virussen. De efficiëntie van de rec PV-productie wordt met deze strategie met meer dan 100 keer verbeterd, wat uitsluitend kan worden toegepast zodra er via transfectie een kleine hoeveelheid rec PVS is geproduceerd. Tot slot wordt kwantitatieve real-time PCR of een transductie-assay gebruikt voor de titratie van de geproduceerde virale stocks.

Daarnaast wordt een plaque-assay uitgevoerd om te bevestigen dat er tijdens het productieproces geen ongewenste replicatie-competente virussen zijn gegenereerd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de klassieke recombinant parvovirus-productie via plasmide-transfectie in actieve en behandelde cellen, is dat zodra we de initiële voorraad recombinant parvovirus in adenovirus VP-helper hebben geproduceerd, onze productie volledig op virusinfectie zal berusten. Dit maakt het gebruik van NBK-cellen mogelijk, die goede producenten van parvovirus zijn, maar niet transfecteerbaar zijn.

Op deze manier is het mogelijk om de recombinante virussen te amplificeren en de gebruikelijke titer van het virus met meer dan 100 keer te verhogen, waardoor de productietijd en de kosten worden verminderd. De procedure zal worden gedemonstreerd door Barbara Loic, hoofd van de Virus Production Unit, die dit nieuwe protocol samen met ons heeft ontwikkeld. We hopen dat u deze video waardevol vindt en we wensen u veel succes met uw experimenten.

De productie van recombinant parvovirus of rec PV via transfectie is noodzakelijk om de minimale hoeveelheid rec PVS te produceren die als inoculum dient bij de daaropvolgende productie van rec PVS via infectie. Voor de productie van rec PVS is een laboratorium met biosafety level twee vereist. Zaai één dag voor transfectie 2 miljoen HEC 2 9 3 T-cellen in een plaat van 10 centimeter om een cellulaire confluentie van 50% te verkrijgen.

Kweek op de dag van transfectie de cellen in 10 milliliters DMEM aangevuld met 10% FBS L-glutamine, penicilline en streptomycine; incubeer deze overnight bij 37 degrees Celsius in 5% carbon dioxide en 92% humidity. Bereid op de dag van transfectie een virus-productiemengsel voor in een 1,5 milliliter buis. Voeg de volgende reagentia toe in een molaire verhouding van één op twee op één: drie micrograms van de rec PV vector die het transgene van belang bevat.

Zes microgram van vector P-C-M-V-V-P die de parvovirus-capside-gene-eenheid bevat, en acht microgram van een uit adenovirus afgeleid helperplasmid. Verdun het plasmidmengsel met serumvrij medium tot 850 microliter om een uiteindelijke concentratie van 20 nanogram per microliter te verkrijgen. Voeg vervolgens 42,5 microliter FU gene HD transfectiereagens toe in een verhouding van 2,5 op 1 FU gene reagens ten opzichte van DNA.

Zorg ervoor dat het FU-genreagens de wand van de buis niet raakt; vortex zachtjes gedurende vijf tot 10 seconden en incubeer het transfectiemengsel vervolgens 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg het transfectiemengsel druppelgewijs toe aan de cellen. Schud de plaat voorzichtig om het mengsel gelijkmatig te verdelen.

Incubeer de plaat gedurende 72 uur bij 37 °C met 5% CO2 en 92% luchtvochtigheid. Gedurende deze periode worden nakomende parvovirusdeeltjes gevormd vanuit de parvovirusplasmiden om het virus te oogsten. Schraap eerst de cellen inclusief hun medium, aspireer vervolgens de suspensie en breng deze van de plaat over in een plastic buis van 15 mL.

Centrifugeer de buis bij 250 G gedurende vijf minuten. Verwijder bij kamertemperatuur 95% van het supernatant, waarbij ongeveer 0,5 milliliter achterblijft. Vortex de buis voorzichtig om het pellet opnieuw te suspenderen in het resterende supernatant en breng dit over naar een eppendorfbuis van 1,5 milliliter.

Bevries de suspensie in een bad met vloeibare stikstof en ontdooi deze vervolgens in warm water bij 37 °C. Vortex de buis krachtig gedurende 15 seconden. Herhaal de vries-dooi-cyclus nog twee keer.

Centrifugeer de buis 15 minuten lang bij 16.000 G bij vier graden Celsius en verzamel het supernatant in een nieuwe buis. Het supernatant bevat in dit stadium het ruwe virusextract, dat kan worden gebruikt als inoculum voor de productie van rec PVS via infectie. Power virus gain.

A-replicaties zijn afhankelijk van cellulaire factoren die tot expressie komen in prolifererende cellen. Daarom is het belangrijk dat de cellen die worden gebruikt voor de productie van het recombinante power virus in een optimale conditie verkeren en in een juiste dichtheid zijn uitgeplaat, zoals gedemonstreerd in dit protocol. Plaats één dag voor de infectie 10 miljoen MB three 20 4K-cellen in een T 1 75-fles om de volgende dag een cellulaire confluentie van 60 tot 80% te verkrijgen.

Bereid een tweede kolf voor met hetzelfde aantal cellen als controle. Elke T 1 75 kolf moet op de ochtend van de dag van infectie een eindvolume van 20 milliliters MEM bevatten, aangevuld met 5%FBS L-glutamine, penicilline en streptomycine. Bereid een virusmengsel in een plastic buisje van twee milliliter.

Voeg deze reagentia toe. Voeg VP-helper toe. Voeg een multiplicity of infection van 10 rec PVS toe bij een MOI van 0,5 en MEM tot 1,5 milliliters.

Breng het volledige virusmengsel aan in een van de T 1 75 flasks. Incubeer de flask gedurende twee uur bij 37 °C, 92% luchtvochtigheid en 5% koolstofdioxide met voorzichtig schudden elke 15 minuten. Incubeer vervolgens nogmaals 20 tot 24 uur bij 37 °C, 92% luchtvochtigheid en 5% koolstofdioxide.

Vervang na 20 tot 24 uur het kweekmedium door vers medium en incubeer de kolf gedurende 48 uur onder dezelfde omstandigheden voor een efficiënte virale productie. In de kolf met viraal geïnfecteerde cellen moeten duidelijke tekenen van cytotoxiciteit waarneembaar zijn. Aspireer en overbreng, beginnend vanaf 36 tot 48 uur na infectie en na een totale periode van 48 uur, het supernatant van het medium uit de kolf naar een centrifugebuis van 50 milliliter.

Was de cellen tweemaal met 1,5 milliliters PBS, behandel ze met trypsine gedurende drie tot vijf minuten en voeg vervolgens de celsuspensie toe aan het verwijderde medium. Centrifugeer de cellen en het supernatant bij 5.000 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, verwijder het supernatant en voeg één milliliter TE-buffer toe aan de celpellet. Vortex de buis voorzichtig om de cellen opnieuw te suspenderen. Vries vervolgens de celsuspensie in een bad van vloeibare stikstof in en ontdooi deze in warm water bij 37 graden Celsius.

Vortex de buis krachtig gedurende 15 seconden. Herhaal de vries-dooi-cyclus drie keer. Behandel vervolgens de celsuspensie gedurende 30 minuten bij 37 °C met Ben Nase nuclease om genomisch cellulair en niet-verpakt viraal DNA te analliseren.

Centrifugeer de buis na 30 minuten 20 minuten lang bij 5.000 G bij vier graden Celsius. Verzamel tot slot het supernatant in een nieuwe buis. Het supernatant bevat in dit stadium een ruw virusextract.

Typische opbrengsten van rec PV GFP geproduceerd volgens dit protocol zouden moeten liggen in het bereik van één tot 10 maal 10 tot de macht acht virale infectieuze eenheden. Een voorbeeld van stimulatie van rec PV-productie door een adenovirus-gebaseerd plasmide wordt hier getoond. Ruwe virusextracten bevattende PHH one GFP erect PV die het GFP-gen bevatten met of zonder.

Het adenovirus-gebaseerde PXX-plasmide werd toegepast op NBK-indicatorcellen; zoals in deze micrografieën te zien is, zijn er meer GFP-positieve cellen aanwezig bij PXX zes. Wanneer GFP-transductie-assays werden uitgevoerd, werd een duidelijke toename in rec PV-productie verkregen in de aanwezigheid van Pxx zes. De productie steeg van 0,3 GFP-transductie-eenheden of TU per cel, verkregen via conventionele protocollen, naar ongeveer vijf TU per cel verkregen via dit protocol.

De resultaten van de GFP-transductieassay geven aan dat de adenovirus E2a-, E4- en VA-RNA-genen in PXX6 in staat zijn om de parvovirusproductie te stimuleren. De volgende figuur toont een representatief voorbeeld van rec PV-productie via infectie. NB3 20 4K-cellen werden geïnfecteerd met gezuiverd ADP-helpervirus en vervolgens superinfecteerd met een van twee recombinante parvovirussen.

Ruwe celextracten werden gebruikt om virustiters te bepalen via een transductie-assay, waaruit bleek dat de AD VP helper de productie van rec PV verder verhoogde tot meer dan 70 T per cel. Ten slotte werden virale batches die geproduceerd waren in de aanwezigheid of afwezigheid van ADP geanalyseerd op hun gehalte aan replicatiecompetente virale deeltjes via een plaque-assay op MB three 20 4K indicatorcellen. De resultaten geven aan dat de ADP helper de rec PV productie versterkte zonder het voorkomen van ongewenste replicatiecompetente virale deeltjes na de ontwikkeling te verhogen.

Deze techniek stelt wetenschappers op het gebied van kanker- en gentherapie in staat om de productie van recombinante power-virussen verder op te schalen. Met behulp van bioreactoren kunnen varianten in de grote hoeveelheden worden geproduceerd die nodig zijn in een klinische setting.