Name: Efficiënte Recombinant Parvovirus productie met de hulp van Adenovirus-afgeleide systemen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Leer een efficiënte methode voor recombinant parvovirusproductie met behulp van een adenovirus type 5-gebaseerde helpervector. Deze techniek verhoogt de opbrengst meer dan tien keer vergeleken met bestaande protocollen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken het team van de DKFZ virus productie en ontwikkeling eenheid, met name Marcus Müller, Silvia Münstermann, Barbara Liebetrau, en Mandy Roscher. Deze studie is mede ondersteund door subsidies van het ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF) en de Helmholtz Association in het kader van het Deutsches Krebsforschungszentrum / Cancéropôle du Grand-Est gezamenlijk programma in de Toegepaste Tumor Virology.

Merk op dat een laboratorium met een bioveiligheidsniveau 2 is vereist voor de productie van recombinante parvovirussen (recPV). Het protocol is onderverdeeld in twee grote delen. Het eerste deel (productie van recPV via transfectie) is nodig om de minimale hoeveelheid recPVs dat als inoculum dient in het tweede deel van het protocol (productie van recPVs via infectie) te produceren. Zodra een kleine hoeveelheid recPVs wordt geproduceerd, het eerste deel van het protocol kan worden weggelaten, en het recombinant parvovirus kunnen worden geamplificeerd alleen via infectie die het gen voor de parvovirus capside eiwitten door het adenovirus helper (zie hieronder). 1. Productie van recPVs via transfectie 1,1 viraal DNA transfectie Het is mogelijk om een ​​ingestelde DNA transfectie methode in dit deel van het protocol ofwel gebaseerd op kationische lipiden of calciumfosfaat. We gebruiken over het algemeen Fugene HD transfectiereagens. Om transfectie-efficiëntie te controleren, raden wij u aan transfecteren extra plaat met een plasmide dat verbeterde Green Fluorescent Protein (bijv. pEGFP-N1, Clontech). Transfectie wordt als een efficiënte en optimaal voor virusproductie, wanneer tenminste 50% van de celpopulatie resultaten EGFP-positieve 24 uren na transfectie. <ol><li> 1 dag voor transfectie, zaad 2000000 HEK293T cellen in 10 cm plaat 50% cellulaire confluentie verkregen op de dag van de transfectie. Cellen groeien in 10 ml van Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met toevoeging van 10% foetaal runderserum, 2 mM L-glutamine, 100 U per ml penicilline en 100 pg / ml streptomycine. </li><li> Bereid virus-making mengsel (01:02:01 molaire verhouding) in een 1,5 ml tube: <ol class="lalpha"><li> 3 ug van de vector recPV het herbergen van de transgene van belang (ei PHH-1-GFP 6). </li><li> 6 ug van de vector pCMV / VP 5 herbergen van de parvovirus capside-gen-eenheid </li><li> 8 pg of adenovirus-afgeleide helper plasmide pXX6 7. </li></ol></li><li> Verdun de plasmiden mengen met serum-vrij medium tot 850 pi (eindconcentratie van 20 ng / pl). </li><li> Voeg 42,5 pi Fugene HD (2,5:1 verhouding pi Fugene: ug DNA). Raak kant van de buis bij het toevoegen van Fugene aan het medium. </li><li> Vortex zachtjes gedurende 5-10 seconden. </li><li> Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. </li><li> Voeg de transfectie mengsels druppelsgewijs aan de cellen. Schud de plaat aan het mengsel gelijkmatig te verdelen in. </li></ol> 1,2 virusproductie <ol><li> Incubeer de plaat bij 37 ° C met 92% vochtigheid en 5% CO2 gedurende 72 uur voor de oogst. Gedurende deze periode nakomelingen parvovirus deeltjes worden gevormd uit de parvovirus plasmiden. </li></ol> 1,3 Virus oogst <ol><li> In een weefselkweek kap, schraap de cellen in hun medium, zuigen en breng de inhoud van de plaat in een 15ml plastic buis. </li><li> Centrifugeer de buis 250 g gedurende 5 min bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder 95% van het supernatans. </li><li> Vortex de buis langzaam aan de pellet resuspenderen in de overblijvende supernatant (0,5 ml). </li><li> Bevries de buis bij -80 ° C. Het is mogelijk om de productie stop in dit stadium of verder met het protocol. </li><li> Ontdooien van de schorsing en breng het op kamertemperatuur. </li><li> Bevries de suspensie in een vloeibare stikstof bad en ontdooien in warm water bij 37 ° C. Vortex de buizen krachtig gedurende 15 sec en herhaal de vries-dooi cyclus nog twee keer. </li><li> Centrifugeer de buizen bij 16.000 g gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Gebruik de bovenstaande vloeistof in een nieuwe buis. De buis bevat in deze fase de ruwe virus extract bereiden. </li><li> Ga verder met het virus titratie (zie hieronder). Voor de uitvoering recPV het GFP-gen, moet een typische geven 1-3 x 10 7 virale infectieuze eenheden overeenkomt met ongeveer 1 -3 x 10 10 virale genoom bevattende deeltjes. </li></ol> 1,4 Virus opslag <ol><li> Voor opslag op lange termijn te bevriezen van de buis met de ruwe virus extract bij -80 ° C. Het is mogelijk om ruwe viral extracten inoculum gebruik in het tweede deel van het protocol. </li></ol> 2. De productie van recPVs via infectie Alvorens te beginnen met de recPV productie via infectie, te produceren en te zuiveren adenovirus 5 het dragen van de parvovirus VP-gen (Ad-VP helper, beschreven in 5) volgens de norm protocol 8. Het is ook nodig om een minimale hoeveelheid recPVs die het transgen van belang (bijvoorbeeld geproduceerd door transfectie zoals hierboven beschreven) hebben. Hieronder beschrijven we de recPV productie in 175 cm2 kolf (T175) formaat. Verdere versterking van de virusvoorraad op deze wijze kan worden uitgevoerd in 10 meerlaagse CellStack cultuur kamers (Corning)met kleine aanpassingen van het protocol voorgesteld. 2.1 Infectie <ol><li> 1 dag voor infectie plaat 10000000 NB324K cellen in een T175 kolf 60-80% cellulaire confluentie verkregen op de dag van infectie. Bereid een tweede kolf met hetzelfde aantal cellen als controle (niet-geïnfecteerde cellen). Elke T175 moet 20 ml Minimum Essential Medium (MEM) als eindvolume aangevuld met 5% foetaal runderserum, 2 mM L-glutamine, 100 E per ml Penicilin en 100 pg / ml streptomycine. </li><li> De volgende morgen bereiden virus mengsel in een 2 ml plastic buis bestaande uit: <ol class="lalpha"><li> Ad-VP-helper 5 aan multipliciteit van infectie (MOI, infectieuze eenheden / cel) = 10 (overeenkomend met 1 x 10 8 infectieuze eenheden); </li><li> recPVs op MOI = 0,5 (overeenkomend met 5 x 10 6 infectieuze eenheden). Voltooien 1,5 ml met MEM. </li></ol></li><li> Breng de gehele virus mengsel in een van de kolf T175. </li><li> Incubeer dekolf gedurende 2 uur bij 37 ° C, 92% luchtvochtigheid, 5% CO2 zachtjes schudden om de 15 minuten. </li><li> Incubeer verdere 20-24 uur bij 37 ° C, 92% luchtvochtigheid, 5% CO2. </li><li> Vervang de culturele medium met vers medium. </li></ol> 2,2 virusproductie Incubeer de kolven bij 37 ° C met 92% vochtigheid en 5% CO2 gedurende 48 uur. Als aanduiding van efficiënte virale productie moet duidelijk symptomen van cytotoxiciteit worden waargenomen in de kolf met virale geïnfecteerde cellen, vanaf 36 tot 48 uur na infectie. 2,3 Virus oogst <ol><li> In een weefselkweek kap, zuigen en over te dragen het medium supernatans van de kolf in een centrifugebuis van 50 ml. </li><li> Twee keer Spoel de cellen met 1,5 ml PBS. </li><li> Trypsinize de cellen met 1.5 ml van 0,25% Trysin-EDTA. Voeg de celsuspensie de verwijderde medium. </li><li> Centrifugeer de cellen en de supernatant bij 5000 g gedurende 5 min bij kamertemperatuur buiARD. </li><li> Verwijder het supernatant. </li><li> Voeg 1 ml TE-buffer (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,7) aan de celpellet voorzichtig vortex de buis om de cellen te resuspenderen. </li><li> Bevries de celsuspensie in een vloeibare stikstof bad en ontdooien in warm water bij 37 ° C. Vortex de buis krachtig gedurende 15 sec en herhaal de vries-dooi-cyclus drie keer. </li><li> Behandel de celsuspensie met 50 U / ml Benzonase Nuclease gedurende 30 min bij 37 ° C om de cellen genoom en onverpakte virale DNA te verteren. </li><li> Centrifugeer de buis 5000 g gedurende 20 minuten bij 4 ° C. </li><li> Gebruik de bovenstaande vloeistof in een nieuwe buis. De supernatant dit stadium bevat ruw extract virus preparaat. Typische opbrengsten van recPV-GFP geproduceerd naar aanleiding van deze protocol dient te worden in het bereik van 1-10 x 10 8 virale infectieuze eenheden. </li></ol> 2,4 Virus opslag <ol><li> Voor korte termijn opslag (maximaal 2 maanden), op te slaan virus bij 4 ° C. </li><li> Voor long termijn opslag (langer dan 2 maanden), op te slaan virus bij -80 ° C. </li></ol> 3. RecPV Zuivering <ol><li> Voor de zuivering van recPVs uit de ruwe lysaten, raden wij u aan een Iodixanol discontinue gradiënt uitgevoerd volgens Zolotukhin et al.. 9. Wij raden u aan een minimum van 5 ml van ruwe virale extract (afkomstig van de productie in vijf T175 kolven) voor een efficiënte virus zuivering. </li></ol> 4. Recombinant Parvovirus Titratie <ol><li> Voer recPV titratie als beschreven in El-Andaloussi et al. 5. </li></ol> 5. Quality Controls <ol><li> Gebruik het protocol beschreven in El-Andaloussi et al.. 5 om te controleren op de aanwezigheid van ongewenste replicatie competente virussen (RCV) het verrichten van parvovirus plaque assay in NB324K indicator cellen. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Een voorbeeld van recPVs production via transfectie in de aanwezigheid of afwezigheid van adenovirus genomische elementen in figuur 3. Cellen werden getransfecteerd met pCMV / VP (plasmide dat het gen dat codeert voor de VP parvovirus capside eiwitten) met PHH-1-GFP (a recPV herbergt het GFP-gen) of PHH-1-luciferase (a recPV herbergt de vuurvlieg luciferase-gen) met (+ pXX6) of zonder (pXX6) de pXX6 plasmide (die de adenovirus E2A, E4 (ORF6) en VA RNA genen). Gelijke hoeveelheden van ruwe celextracten werden aangebracht op NB324K cellen en GFP transductie of luciferase assays werden uitgevoerd zoals in El-Andaloussi et al.. 5. Een duidelijke verhoging van de recPVs productie werd in de aanwezigheid van pXX6 de productie verhogen van 0,3 GFP transductional eenheden (TU) / cel verkregen volgens de conventionele protocollen ongeveer 5 TU / cel verkregen bij onze methode (Fig. 3A, B). Een significante toename (ongeveer 24-voudig) van recPV productiop werd ook waargenomen bij PHH-1-luciferase (fig. 3C). Deze resultaten geven aan dat het genetische materiaal in pXX6 kan parvovirus productie verhogen. Een representatief voorbeeld van recPVs productie via infectie in figuur 4. NB324K cellen werden geïnfecteerd met verschillende recPVs (zoals aangegeven in de figuur) en Ad-VP-helper (herbergen van het gen dat codeert voor de PV-VP capside eiwitten). Ad-VP helper verder verbeterd recPV productie tot&gt; 70 TU per gezaaide cellen (Fig. 4A) zonder het optreden van ongewenste replicatiecompetente virusdeeltjes (Fig. 4B). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Vectoren gebaseerd op autonome parvovirussen. (A) boven: Het transgen vervangt een deel van de VP-coderende genen en onder de controle van de virale promotor P38. De genen voor NS1 / 2 weer wordenonderhouden en de expressie wordt gecontroleerd door de virale promotor P4. De vector genoom wordt geflankeerd door de parvoviral ITRs, dat cis-werkende elementen die nodig zijn voor replicatie en inpakken van het recombinante genoom bevatten. Onder: een plasmide dat het VP-gen onder ofwel een heterologe (bijvoorbeeld CMV.) Of autologe (bijv. P38.) Promoter (Px) wordt geleverd in trans in recombinant parvovirus productie om te compenseren voor de verstoring van de structurele genen in de recombinante genoom. ITR, inverted terminal repeat. Figuur afgeleid van 4. (B) Schematische weergave van de klassieke protocol gebruikt voor de productie van recPVs. HEK293T cellen transient getransfecteerd met virale DNA (vector en helper plasmiden) en na drie dagen worden de cellen verzameld en virus geoogst. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Productie van de recPVshulp van de Ad-VP. (A) Schematische kaarten van recPV en Ad-VP genomen. De recPV bevat een heteroloog transgen welk deel van de VP regio vervangt. De Ad-VP herbergt het parvovirus VP-gen. (B) Schematische weergave van het protocol zoals beschreven in dit manuscript. NB324K cellen worden geïnfecteerd met recPV en Ad-VP virussen. Na drie dagen cellen worden geoogst en recPV deeltjes hersteld van cellysaat. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Stimulatie van recPV productie adenovirus gebaseerde plasmiden pXX6. HEK293T cellen geënt in 10 cm schaaltjes werden getransfecteerd met pCMV / VP in combinatie met PHH-1-GFP (A en B) of PHH-1-luciferase (C) recPVs produceren. Tegelijkertijd werden cellen gecotransfecteerd met de adenovirus-afgeleide plasmiden helper pXX6 of niet, zoals aangegeven. Drie dagen na transfectie werden de cellen geoogst en gelyseerd door drie vries en ontdooi cycli. Gelijke volumes van crude virus extracten werden toegepast op de indicator cellen NBK, en transductie testen werden uitgevoerd. (A) Representatieve microfoto met GFP-positieve cellen in confluerende NB324K monolagen. (B) Kwantificering van het GFP-transductie assays uitgedrukt in transductie-eenheid (TU) per geplaatste cel . (C) Kwantificering van de luciferaseactiviteit uitgedrukt als relatieve luciferase eenheden (RLU). De luciferase test werd uitgevoerd zoals beschreven in El-Andaloussi et al.. 5. Kolommen staan ​​gemiddelden van drie replicaten met standaardafwijking staven. Aantal boven op de + pXX6 kolom in (B en C) geeft de toename in de recPV virus titers, verkregen in de aanwezigheid van pXX6 versus zonder. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Stimulatie van recPV productie met behulp van recombinant Ad-VP helpervirus. (A) NB324K cellen werden infectiested met gezuiverd Ad-VP helper virus met een moi van 10 (Ad-X eenheid / cel getitreerd met Adeno-X Rapid Titer Kit) en superinfectie met een van de volgende recombinant parvovirus Chi-hH-1-EGFP 11 (0,1 TU / cel) of H-1-GFP (0,5 TU / cel) 5. Een dag na infectie, werd het medium, en twee dagen later werden de cellen verzameld en gelyseerd door drie vries-dooi-en cycli. Ruwe celextracten werden gebruikt virus titers bepalen transductie test volgens El-Andaloussi et al.. 5. TU, transductie eenheid (B). Virale batches die in aanwezigheid van afwezigheid van Ad-VP werden geanalyseerd op hun inhoud van replicatie-competente virusdeeltjes (HS) van plaque assay op NB324K indicator cellen.

<ol><li>Cotmore, S. F., Tattersall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvoviral+host+range+and+cell+entry+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Virus.+Res%22%5BJournal%5D)">Parvoviral host range and cell entry mechanisms.</a> Adv. Virus. Res. 70, 183(2007).</li>
<li>Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+parvoviruses+as+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185(2010).</li>
<li>Hristov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Through+Its+Nonstructural+Protein+NS1%2C+Parvovirus+H-1+Induces+Apoptosis+via+Accumulation+of+Reactive+Oxygen+Species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Through Its Nonstructural Protein NS1, Parvovirus H-1 Induces Apoptosis via Accumulation of Reactive Oxygen Species.</a> J. Virol. 84, 5909-5909 (2010).</li>
<li>Cornelis, J. J., Salome, N., Dinsart, C., Rommelaere, J. Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCornelis%2C+JJ+%22J.+Virol%22">J. Virol</a>. 6, 193-193 (2004).</li>
<li>El-Andaloussi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+adenovirus-based+helper+system+to+support+production+of+recombinant+parvovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel adenovirus-based helper system to support production of recombinant parvovirus.</a> Cancer Gene Ther. 18, (2011).</li>
<li>Kestler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cis+requirements+for+the+efficient+production+of+recombinant+DNA+vectors+based+on+autonomous+parvoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">cis requirements for the efficient production of recombinant DNA vectors based on autonomous parvoviruses.</a> Hum. Gene. Ther. 10, 1619-1619 (1999).</li>
<li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> J. Virol. 72, 2224(1998).</li>
<li>He, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2509(1998).</li>
<li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene. Ther. 6, 973(1999).</li>
<li>Maxwell, F., Harrison, G. S., Maxwell, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+production+of+recombinant+AAV+by+transient+transfection+of+NB324K+cells+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved production of recombinant AAV by transient transfection of NB324K cells using electroporation.</a> J. Virol. Methods. 63, 129(1997).</li>
<li>Wrzesinski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+and+pseudotyped+parvoviruses+minimize+the+contamination+of+recombinant+stocks+with+replication-competent+viruses+and+identify+a+DNA+sequence+that+restricts+parvovirus+H-1+in+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells.</a> J. Virol. 77, 3851(2003).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

We hebben aangetoond dat recPV productie kan worden versterkt door de aanwezigheid van adenovirale genoom elementen. We hebben het recPV opbrengst van meer dan 10 maal (0,3 tot 5 TU / cel) door adenovirus genomische element via transfectie en niet meer dan 100-voudig co-infecteren van de cellen met Ad-VP-helper in combinatie met de in recPV vergelijking met conventionele protocollen. Het protocol beschreven kan verder worden geoptimaliseerd door het bepalen van de meest geschikte timing voor de levering van het adenovir...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Sigma </td><td> M4655 </td></tr><tr><td> Foetale Bovine Serum </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Gibco </td><td> 25030-024 </td></tr><tr><td> Fugene </td><td> Roche </td><td> 047097050001 </td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300062 </td></tr><tr><td> Benzonase Nuclease </td><td> Sigma </td><td> E8263 </td></tr><tr><td> Adeno-X Rapid Titer Kit </td><td> Clontech </td><td> 632250 </td></tr></tbody></table>

efficiënte recombinant parvovirus productie met de hulp van adenovirus-afgeleide systemen

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Knaagdieren parvovirussen (PV), zoals rat H-1PV en MVM, zijn kleine icosahedrale, enkelstrengs DNA-virussen. Hun genoom bevat twee promoters P4 en P38 die de expressie van niet-structurele (NS1 en NS2) en capside eiwitten (VP1 en VP2) respectievelijk een te regelen. Ze trekken een hoge rente als antikankermiddelen voor hun oncolytische en oncosuppressive vaardigheden terwijl ze niet-pathogeen voor de mens 2. NS1 de belangrijkste effector van virale cytotoxiciteit 3. Om verdere hun natuurlijke antineoplastische te verbeteren, zijn derivaten van deze vectoren zijn gegenereerd door vervanging van de gen dat codeert voor de capside eiwitten met een therapeutisch transgen (bijv. een polypeptide cytotoxische, cytokine, chemokine, tumor suppressor gen, enz.) 4. De recombinante parvovirussen (recPVs) vector behoudt NS1 / 2 coderende sequenties en de PV genoom telomeren die noodzakelijk zijn voor virale DNA-amplificatie en verpakking. Productie vanrecPVs komt alleen in de producerende cellen (doorgaans HEK293T) door co-transfectie van de cel met een tweede vector (pCMV-VP) het gen dat codeert voor de VP eiwitten (Fig. 1) 4. De recPV vectoren gegenereerd op deze manier zijn replicatie defect. Hoewel recPVs bleek verbeterde oncotoxic eigenschappen bezit met betrekking tot het ouderlijk virussen van waaruit ze zijn ontstaan, hun productie blijft een grote uitdaging en sterk belemmert het gebruik van deze middelen in de anti-kanker klinische toepassingen. Wij vonden dat de invoering van een ad-5 afgeleide vector die het E2A, E4 (ORF6) en VA RNA genen (bijv. pXX6 plasmide) in HEK293T verbeterd productie van recPVs meer dan 10 maal in vergelijking met andere protocollen gebruikt. Op basis van deze vondst hebben we geconstrueerd een nieuwe Ad-VP-helper de genomische adenovirale elementen om recPVs productie verbeteren en de parvovir bevatons VP gen-eenheid 5. Het gebruik van Ad-VP-helper, maakt het mogelijk de productie van rec-PV&#39;s met behulp van een protocol dat volledig afhankelijk is van virale infectie stappen (in tegenstelling tot plasmide transfectie), het mogelijk maken van het gebruik van cellijnen die moeilijk te transfecteren (bijv. NB324K) ( Fig. 2). Wij beschrijven een methode verbetert de hoeveelheid geproduceerd recombinant virus, waardoor zowel de productietijd en kosten zonder dat de kwaliteit van het eindproduct 5. Bovendien, grootschalige productie van recPV (in suspensie cellen en bioreactoren) is nu denkbaar.

Hier beschrijven protocol alleen gebaseerd op cel infectie, hetgeen het rendement van recombinant parvovirus productie van meer dan 100 maal in vergelijking met andere protocollen gebruikt verbetert. Dit protocol is gebaseerd op het gebruik van een nieuw adenovirus 5 gebaseerde helper met de parvovirus VP transcriptie-eenheid (Ad-VP).

Efficiënte Recombinant Parvovirus productie met de hulp van Adenovirus-afgeleide systemen

Knaagdierparvovirussen (PV), zoals rat H-1PV en MVM, zijn kleine icosaëdrische DNA-virussen met een enkelstrengs genoom. Hun genoom bevat twee promotors, P4 en P38 ...

Het algemene doel van deze procedure is om recombinante parvovirussen, of rec PV's, te produceren met hoge titers, terwijl hun kwaliteit behouden blijft en de productietijden en -kosten worden verminderd. Dit wordt bereikt door eerst een initiële rec PV-virale stock te produceren via transfectie van HEC 2 9 3 T-cellen met rec PV-plasmiden, samen met een vector afgeleid van adenovirus type vijf. De introductie van ad-genomische elementen in de HEC 2 9 3 T-cellen verhoogt namelijk de productie van rec PV's met meer dan tienvoudig.In vergelijking met bestaande protocollen is een nieuwe AD VP-helper gegenereerd die de genomische adenovirale elementen bevat die nodig zijn om de productie van recombinant parvovirus te verhogen, evenals de parvovirus VP-geneunit. De volgende stap is om deze nieuwe ADD VP-helper te produceren en te zuiveren volgens standaardprotocollen.De laatste stap in deze procedure is het amplificeren van de rec PVS door NB three 20 4K-cellen te co-infecteren met de rec PV- en AD ADP-virussen. De efficiëntie van de rec PV-productie wordt met deze strategie met meer dan 100 keer verbeterd, wat uitsluitend kan worden toegepast zodra er via transfectie een kleine hoeveelh

efficient-recombinant-parvovirus-production-with-help-adenovirus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Redding van recombinant arenavirussen uit gekloneerde cDNA's, gegeven voor een reverse genetische benadering stelt onderzoekers de rol van specifieke virale genproducten, evenals de bijdrage van de verschillende specifieke gebieden en residuen te onderzoeken, om verschillende aspecten van de biologie van arenavirus . Ook reverse genetics technieken FDA-goedgekeurde cellijnen (Vero) voor vaccinontwikkeling verschaft nieuwe mogelijkheden voor het genereren van effectieve en veilige vaccins ter...

Generatie van recombinant arenavirus for Vaccine Development in FDA-goedgekeurde Vero cellen

Newcastle Disease Virus (NDV) is uitgebreid bestudeerd in de afgelopen jaren om nieuwe vectoren te ontwikkelen voor vaccinatie en therapie, onder anderen. Deze studies zijn mogelijk gemaakt door technieken om recombinant virus te redden van cDNA, zoals hier beschreven.

Redding van recombinant Newcastle Disease Virus uit cDNA

De afgelopen 15 jaar hebben honden-adenovirus type 2 (CAV2)-afgeleide vectoren hun efficiëntie bewezen om cellen in vitro en in vivo te transduceren en worden ze veel gebruikt voor vaccinatie en gentherapie. Hier beschrijven we een procedure om CAV2-vectoren te construeren, produceren en zuiveren, wat leidt tot virale suspensies met een hoog titer.

Productie en zuivering van niet-Replicatieve Canine adenovirus type 2 afgeleide vectoren

Hier presenteren we een protocol om een proof-of-principle bivalente adenovirus type 5 (Ad5) vector genereren Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 door gebruik te maken van de Antigen Capsid-Incorporation strategie. Deze vector werd aangetoond kwalitatieve conditie vertonen het vermogen om Ad5-positieve sera in vitro, en de antigeniteit en immunogeniteit ontsnappen naar de opgenomen antigenen.

Gebruik makend van de Antigen Capsid-Incorporation strategie voor de ontwikkeling van adenovirus serotype 5-Vectored Vaccin Approaches

Een protocol voor de generatie van adenovirale vectoren met hoge capaciteit waarbij alle virale coderende sequenties ontbreken, wordt gepresenteerd. Het klonen van transgenen die in het vectorgenoom zijn opgenomen, is gebaseerd op homing-endonucleasen. Virusamplificatie in producencellen die als adhesieven cellen worden gekweekt en in suspensie is afhankelijk van een helpervirus dat virale genen in trans levert.

Klonen en grootschalige productie van hoge capaciteit adenovirale vectoren op basis van de menselijke adenovirus type 5

Beschrijven we een methode voor het genereren van en sturen genetisch gemodificeerde respiratoir syncytieel virussen (RSVs) en een geoptimaliseerde plaque assay voor RSVs. We illustreren dit protocol door het creëren van twee recombinante virussen die respectievelijk toestaan kwantificering van RSV replicatie en live analyse van RSV opneming organen en integratie-organen-geassocieerde korrels dynamiek.

Generatie, versterking en titratie van recombinante respiratoir syncytieel virussen

Generatie recombinantrotavirussen uit plasmid DNA is een essentieel instrument voor de studie van rotavirusreplicatie en pathogenese, en de ontwikkeling van rotavirusexpressievectoren en vaccins. Hierin beschrijven we een vereenvoudigde omgekeerde genetica benadering voor het genereren van recombinante rotavirussen, met inbegrip van stammen uitdrukken fluorescerende reporter eiwitten.

Vereenvoudigde Reverse Genetics Methode om Recombinant Rotavirussen Expressing Reporter Eiwitten terug te vorderen

Dit is een methode om "scarless" recombinant vaccinia virussen te genereren met behulp van host-range selectie en visuele identificatie van recombinante virussen.

Snelle, naadloze generatie recombinante poxvirussen met behulp van Host Range en Visuele Selectie

Hier presenteren we een protocol voor de productie van adenovirus met behulp van het pAdEasy-systeem. De technologie omvat de recombinatie van de pAdTrack en pAdEasy-1 plasmiden, de verpakking en versterking van het adenovirus, de zuivering van de adenovirale deeltjes uit cellysaat en kweekmedium, de virale titratie en het functioneel testen van het adenovirus.

Een efficiënte methode voor de productie van Adenovirus

De omloopsnelheid van virussen in zee-en zoetwater-systemen kan worden geschat door een reductie en herhaling techniek. De gegevens kunnen de onderzoekers om de tarieven van de virus-gemedieerde microbiële sterfte in aquatische systemen af ​​te leiden.

Het schatten van Virus Productie tarieven in aquatische systemen

Leer een efficiënte methode voor recombinant parvovirusproductie met behulp van een adenovirus type 5-gebaseerde helpervector. Deze techniek verhoogt de opbrengst meer dan tien keer vergeleken met bestaande protocollen.

Efficiënte Recombinant Parvovirus productie met de hulp van Adenovirus-afgeleide systemen

Meer video's verkennen