Name: Werkwijze voor het isoleren en identificeren van mRNAs, microRNA en eiwitcomponenten van ribonucleoproteïne complexen uit celextracten met RIP-Chip (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Leer RIP-Chip voor het isoleren van ribonucleoproteïnecomplexen uit cellysaten. Deze methode identificeert mRNA-doelen van RNA-bindende eiwitten voor post-transcriptionele genregulatieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ministerie van Defensie (Idea Award W81XWH-07-0406) - Om Ulus Atasoy NIH RO1 A1080870 - Om Ulus Atasoy NIH R21 A1079341 - Om Ulus Atasoy Universiteit van Missouri Institutional Funds - Om Ulus Atasoy

Experiment voorbereiding Voordat u begint te experimenteren, is het essentieel om alle reagentia, containers en apparaten RNase vrij hebben. Behandel glaswerk met RNase inhibitor (RNaseZAP, Ambion) gevolgd door spoelen met DEPC behandeld water. Zorg ervoor dat alle reagentia worden bevestigd als RNase vrij. 1. Bereid mRNP Lysaat <ol><li> Kweken en oogsten exponentieel groeiende weefselcellen tussen 2-5 mg totaal eiwit per RIP. <ol class="lalpha"><li> Twee P150 cultuur gerechten zijn meestal voldoende. </li><li> Voor elke RBP wordt onderzocht, moet de totale mobiele nummer en eiwit hoeveelheden worden geoptimaliseerd om geschikt doelwit mRNA en RBP interacties te maximaliseren. </li><li> RIP voor qRT-PCR analyse vereisen minder cellulaire lysaat (ongeveer 400 ug totaal eiwit) vanwege de amplificatie en detectie methode vooral voor grote overvloed RBPs zoals Hur, AUF1, TIAR. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Pellet cellen via centrifugatie bij 200 xg gedurende 8-10 min bij 4 ° C, vervolgens driemaal wassen met ijskoude PBS. </li><li> Na een laatste wasbeurt tik zachtjes tegen de onderkant van de buis en resuspendeer celpellet in gelijke volumes bereide polysome lysis buffer (PLB) met RNase en proteaseremmers. <ol class="lalpha"><li> Het is aan te raden om het afmeten van de exacte omvang van de cel pellet. </li></ol></li><li> Pipet zachtjes mengsel (niet vortex) te splitsen klompen cellen en incubeer lysaat op ijs gedurende 5 minuten. </li><li> Centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C aan het lysaat van vuil te verwijderen. </li><li> Onmiddellijk overbrengen supernatant vrijgemaakt voor uw gekoelde microfugebuis. </li><li> Blijf op ijs en bewaar bij -80 ° C. <ol class="lalpha"><li> Onmiddellijke bevriezing voltooit de juiste lysis van de cellen en voorkomt ongewenste binding. Ga verder met RIP onmiddellijk volgende voorbeeld ontdooien en te houden monsters op ijs om RNA degradatie te voorkomen. &lt;/ Li&gt; <li> Dit lysaat kan worden opgeslagen gedurende zes maanden bij -80 ° C. Vermijd herhaalde vries-dooi cycli omdat dit kan leiden tot eiwit en / of mRNA degradatie. </li></ol></li><li> Kwantificeren eiwitconcentratie in lysaat met standaard Bradford Protein assay. </li></ol> 2. Coat Protein A Sepharose kralen met antilichaam en Wash <ol><li> Pre-swell proteïne A Sepharose (PAS) kralen overnight in NT2 buffer (3-4 volumes) met 5% BSA. Bewaar bij 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Langdurige opslag van enkele maanden bij 4 ° C is mogelijk wanneer aangevuld met 0,1% natriumazide. </li><li> Protein Sepharose beads worden gekozen op basis van isotype doel RBP antilichaam. Eiwitten A, G en A / G hebben specifieke isotype doelen en verschillen in affiniteit doel. Proteïne A sepharose korrels werden gebruikt na isotype specificiteit en affiniteit voor Hur eiwit antilichaam. </li></ol></li><li> Voor het gebruik, verwijder overtollig NT2 buffer, zodatdie laatste kralen buffer verhouding 1:1. </li><li> Toepassing van 1,5 ml RNAse-vrije microcentrifugebuizen, verwijder 100 ul PAS slurry en voeg 30 ug antilichaam voor elk IP reactie (dat wil zeggen specifieke RBP en isotype controle). </li><li> Voeg 100-200 ul buffer aan antilichaam NT2 bead mix. <ol class="lalpha"><li> Mengsel kan worden opgeslagen gedurende verscheidene weken bij 4 ° C bij aangevuld met 0,1% natriumazide. </li><li> Een isotype-gematchte antilichaam of hele normale sera van dezelfde soort worden gebruikt in parallel als een antilichaam tegen achtergrond controle RNA. </li></ol></li><li> Voeg het juiste antilichaam aan kralen en incubeer overnacht, tuimelen eind over eind bij 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Antilichaamtiter optimaliseren voor specifieke eiwit onderzocht (1, 5, 10 of 30 ug antilichaam is gewoonlijk voldoende). </li></ol></li><li> Bereid antilichamen beklede kralen onmiddellijk voor gebruik door wassen met 1 ml vanijskoude NT2 buffer 5 keer. <ol class="lalpha"><li> Wassen bead mix door centrifugeren bij 13.000 xg gedurende 1-2 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder voorzichtig het maximale bedrag van supernantant met de hand pipet of aspirator maar wees voorzichtig niet te verstoren pellet. </li><li> Wassen helpt bij het verwijderen ongebonden antilichaam en RNase verontreinigingen uit antilichaam mengsel. </li></ol></li><li> Zodra de laatste wassing voltooid, resuspendeer de beads in 700 pl ijskoude buffer NT2 gevolgd door behandeling met RNase verschillende remmers aan de doelwit mRNA&#39;s, waarvan 10 pi RNase Out bij 40 U / ul, 10 ul 100 mM beschermen DTT en 15 ul EDTA (15 mM). Breng volume tot 1000 ui met NT2 buffer. <ol class="lalpha"><li> Vanadyl ribonucleoside complexen niet door remmende effect van EDTA gebruikt. </li></ol></li></ol> 3. Immunoprecipitatie en RNA Precipitation <ol><li> Optioneel Preclear Stap:<ol class="lalpha"><li> Om de achtergrond te verminderen, kan kralen en controle antilichaam worden gebruikt om vooraf heldere lysaat. Dit kan verminderen signaal in de output. </li><li> Deze stap kan nodig zijn om achtergrond te verlagen bij het doen IP gevolgd door microarray. Het is algemeen niet nodig voor IP gevolgd door qRT-PCR. </li><li> Preclear met 15 ug isotype controle gedurende 30 min / 4 ° C tuimelen eind over eind. </li><li> Voeg 50 ul van preswollen PAS ongecoate kralen met antilichaam van stap 2.1. </li><li> Incubeer 30 min / 4 ° C onder rotatie eind over eind </li><li> Centrifugeer bij 10.000 xg bij 4 ° C. Opslaan supernatant voor IP. </li></ol></li><li> Voeg 100 ul geïsoleerd geklaard lysaat (ongeveer 2-5 mg) bereid antilichaam mix. <ol class="lalpha"><li> Verdunnen lysaat zal helpen om achtergrond en niet-specifieke binding te verminderen. </li><li> Bedrag van lysaat ingang kan variëren afhankelijk van detectiemethode en de overvloed van RBP or efficiëntie van RBP antilichaam zoals genoteerd in stap 1.1.c. </li></ol></li><li> (Optioneel) direct tube meng voorzichtig tikken herhaaldelijk gevolgd door korte centrifugatie bij 10.000 xg bij 4 ° C tot pellet kralen en onmiddellijk 100 ul supernatant als totale input mRNA vertegenwoordiging qPCR analyse met standaard isolatietechnieken RNA. <ol class="lalpha"><li> Deze stap is om te bevestigen dat invoer lysaat RNA is optimaal voor IP en mag alleen uitgevoerd als een controle stap of als een probleemoplossing stap na RIP met slechte RNA resultaten worden. </li></ol></li><li> Wrap in parafilm om afdichting en incubeer bij 4 ° C zorgen voor 2 tot 4 uur, tuimelen eind over eind. <ol class="lalpha"><li> Vertraagd incubatie worden geoptimaliseerd volgens de doelstelling overvloed en moeten worden beperkt tot complexe herschikking of afbraak te voorkomen. Voor sommige RBPs korter incubaties kunnen meer optimaal. </li></ol></li><li> Pellet korrels bij 5.000 XGFof 5 min bij 4 ° C en bewaar supernatant voor mogelijke analyse door Western blot. Store aliquots bij -80 ° C. <ol class="lalpha"><li> Hoeveelheden van supernatans met grote hoeveelheden rest doeleiwit kan duiden op een falen van het eiwit wordt neergeslagen door sepharose kralen. </li></ol></li><li> Zoals eerder beschreven, was kralen 5 maal met 1 ml ijskoude buffer en NT2 centrifugeren (5.000 g gedurende 5 min bij 4 ° C) en verwijder supernatant met hand pipet of een aspirator. <ol class="lalpha"><li> Strengere wash methoden worden toegepast om de achtergrond te verlagen door aanvulling NT2 buffer met natriumdeoxycholaat, ureum of SDS. </li><li> Bewaar monsters op ijs zoveel mogelijk snel werken om degradatie van doelwit mRNA minimaliseren. </li></ol></li><li> Optioneel: Sla een kleine hoeveelheid (10%) van bead mix of een extra monster dat parallel controle op de IP efficiëntie van doeleiwit met Western blot analyse.</li></ol> 4. DNase en Proteinase K behandelingen <ol><li> Na wassen resuspendeer beads met 100 pi NT2 buffer aangevuld met 5 gl RNase-vrij DNase 1 (2 U / pl). </li><li> Houden bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten. Voeg 1 ml van NT2 buffer en centrifugeer bij 5000 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur. <ol class="lalpha"><li> Een kleine (~ 10%) aliquot van parels worden gebruikt om de IP efficiency controleren door SDS-PAGE analyse. </li></ol></li><li> Hersuspendeer pellet PAS in 100 ul buffer NT2, 5 pl Proteinase K (10 mg / ml) en 1 pi 10% SDS. </li><li> Incubeer de geresuspendeerde bead mengsel gedurende 30 min bij 55 ° C in een waterbad voorzichtig tikken op elke 10 minuten. <ol class="lalpha"><li> Proteinase K zal helpen bij de vrijgave van de RNP componenten. </li></ol></li><li> Pellet beads bij 5.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) en verzamel de supernatant (~ 100 pi). </li><li> Voeg 200 ul buffer NT2 aan beads, centrifuge 5000 g gedurende 2 min bij kamertemperatuur, verzamel supernatant (~ 200 ul) en gooi kralen. </li><li> Combineer supernatanten (100 ul en 200 ul) en voeg 300 ul onderlaag zuur fenol-CHCl3. </li><li> Vortex, 1 min RT (of 37 ° C in shaker) en gecentrifugeerd bij 16.000 xg bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut. </li><li> Verzamel 250 ul van de bovenste laag (NIET verstoren interface), voeg 25 ul natriumacetaat bij pH 5,2, 625 ul 100% EtOH en 5 ul glycoblue, en meng goed. </li><li> Bewaar nacht bij -20 ° C. <ol class="lalpha"><li> Om het hergebruiken van RNA waarborgen, de toevoeging van glycoblue de zichtbaarheid van de RNA pellet verhogen als een dragermolecuul. </li></ol></li><li> De volgende dag mix buizen door inversie 3-5 keer, centrifugeren bij 12.000 xg bij 4 ° C gedurende 30 min en gooi het supernatant. </li><li> Voeg 1 ml van 70% ETOH de blauwe pellet en meng door omkeren of vortexen. </li><li> Centrifugeer 12.000 xg bij 4 ° C gedurende 2 minuten. </li><li> Discard supernatant en centrifugeer 12.000 xg gedurende 1 min bij 4 ° C. </li><li> Eventueel overblijvend 70% ETOH met een pipet en drogen pellet bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer in 20-40 ul RNase / DNase-vrij water of een andere geschikte volume als dat nodig is. <ol class="lalpha"><li> Monster is nu klaar voor verdere verwerking toepassingen zoals qRT-PCR of microarray. </li><li> Nanodrop spectrofotometrie worden gebruikt bij de beoordeling monsterconcentratie, maar met kostbare monsters, kan het gunstig zijn nanodropping monsters te voorkomen als het kan verspilling en relatief onnauwkeurig. Wij stellen voor het normaliseren van monsters om de huishouding gentranscripten om zuiverheid en IP-efficiëntie te beoordelen voor edelstenen en lage opbrengst monsters. </li></ol></li></ol> 5. Representatieve resultaten Als de procedure geoptimaliseerd en correct wordt uitgevoerd, dient de immunoprecipitatie opleveren significante verrijking van mRNA targets. TypischAfhankelijk van de RBP en mRNA target (s), zien we verrijking van ongeveer 10 - tot 50-voudig indien beoordeeld door qRT-PCR. Veel doelstellingen van RBPs kan worden ontdekt en masse met behulp van microarray analyse. Deze methode is gevoelig voor afbraak vergeleken met qRT-PCR. Afhankelijk van de RBP, het aantal doelen en de efficiëntie van de reactie kan microarray onthullen honderden nieuwe targets, of kan pas ontdekken een paar, indien aanwezig. Bijvoorbeeld, een van de betere kenmerk RNA bindingseiwitten Hur, post-transcriptioneel de expressie reguleert en translatie van vele belangrijke fysiologische genen 1, 2. Isolatie van de Hur-ribonucleo-complex via RIP-Chip in borstkanker cellijnen bijvoorbeeld geopenbaard verrijking van enkele belangrijke bekende Hur doelen, inclusief β-actine met qRT-PCR zoals weergegeven in figuur 1. In beide cellijnen β-actine is verrijkt 12 - tot 15-voudige. Typisch, op de juiste wijze uitgevoerd zien we een significante Enrichment van β-actine in verschillende cellijnen. Echter, als de RIP blijkt geen significante verrijking voor β-actine is er een probleem met de RIP en de procedure kan moeten worden herhaald. Bovendien microarray analyse van monsters van deze immunologisch cellijnen openbaarde verschillende subsets expressie van Hur targets in verschillende oestrogeenreceptor (ER) positieve MCF-7 kankercellen versus ER negatieve MB-231 borstkanker cellijnen zoals aangetoond in figuur 2 1. Deze doelstellingen vallen in verschillende categorieën: bekende en onbekende Hur doelen die ofwel werden geassocieerd of niet geassocieerd met kanker. Bijvoorbeeld, CALM2 en CD9 zijn beide kanker genen die niet eerder werden geïdentificeerd als HUR doelen. Met de microarray en bevestigd met qRT-PCR, en CALM2 CD9 bleken 5 - tot 180-voudig verrijkt in de Hur pellet geeft een belangrijke interactie tussen het eiwit en Hur deze doelgenen. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/3851/3851fig1.jpg&quot; alt = &quot;Figuur 1&quot; /&gt; Figuur 1. Immunoprecipitatie en RIP in MB-231 (ER-) en MCF-7 (ER +) borstkankercellen. Immunoprecipitaties werden uitgevoerd door MB-231 of MCF-7 cellysaten met anti-Hur monoklonaal antilichaam (3A2) en IgG1 isotype controle. A. IP West van Hur onthulde de verwachte lengte band zoals gedetecteerd door 3A2. Panel rechts toont hoeveelheden van Hur in input lysaten gebruikt van beide cellijnen, met β-tubuline als een laad controle. B. Controle door kwantitatieve RT-PCR toonde vijftien en elf maal verrijkingen van β-actine, een bekend doelwit Hur, in het 3A2 IPs van MB-231 en MCF-7, respectievelijk. Alle ΔΔCT waarden werden genormaliseerd voor GAPDH. Experimenten werden uitgevoerd in tweevoud (n = 2). <img src="/files/ftp_upload/3851/3851fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Hur RIP-CHIP identificeert verschillende genetische profielen in ER + en ER-borstkankercellen.Hur immunoprecipitaties werden uitgevoerd van MB-231 of MCF-7 cellysaten met Hur IgG1 antilichaam en isotype controle gehybridiseerd Illumina Sentrix arrays (47.000 genen). Controle signalen werden afgetrokken. Resultaten geven gecumuleerde gegevens uit 12 verschillende arrays. Experimenten werden uitgevoerd in drievoud (n = 3) voor elke cellijn met bijpassende controles. Weegschalen zijn log2.

<ol><li>Calaluce, R., Gubin, M. M., Davis, J. W., Magee, J. D., Chen, J., Kuwano, Y., Gorospe, M., Atasoy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+binding+protein+HuR+differentially+regulates+unique+subsets+of+mRNAs+in+estrogen+receptor+negative+and+estrogen+receptor+positive+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer.</a> BMC Cancer. 10, 126-140 (2010).</li>
<li>Gubin, M. M., Calaluce, R., Davis, J. W., Magee, J. D., Strouse, C. S., Shaw, D. P., Ma, L., Brown, A., Hoffman, T., Rold, T. L., Ulus Atasoy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+RNA+binding+protein+HuR+impairs+tumor+growth+in+triple+negative+breast+cancer+associated+with+deficient+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the RNA binding protein HuR impairs tumor growth in triple negative breast cancer associated with deficient angiogenesis.</a> Cell Cycle. 9, 3337-3346 (2010).</li>
<li>Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIP-Chip%3A+the+isolation+and+identification+of+mRNAs%2C+microRNAs+and+protein+components+of+ribonucleoprotein+complexes+from+cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts.</a> Nature Protocols. 1, 302-307 (2006).</li>
<li>Tenenbaum, S. A., Lager, P. J., Carson, C. C., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonomics%3A+identifying+mRNA+subsets+in+mRNP+complexes+using+antibodies+to+RNA-binding+proteins+and+genomic+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Ribonomics: identifying mRNA subsets in mRNP complexes using antibodies to RNA-binding proteins and genomic arrays.</a> Methods. 26, 191-198 (2002).</li>
<li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Atasoy, U., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+regulatory+analysis+using+en+masse+nuclear+run-ons+and+ribonomic+profiling+with+autoimmune+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Genome-wide regulatory analysis using en masse nuclear run-ons and ribonomic profiling with autoimmune sera.</a> Gene. 317, 79-87 (2003).</li>
<li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14085-14090 (2000).</li>
<li>Baroni, T. E., Chittur, S. V., George, A. D., Tennebaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+RIP-Chip+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in RIP-Chip Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 419, 93-108 (2008).</li>
<li>de Silanes Lopez, I., Zhan, M., Lal, A., Yang, X., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+target+RNA+motif+for+RNA-binding+protein+HuR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2987-2992 (2004).</li>
<li>de Silanes Lopez, I., Lal, A., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HuR%3A+post-transcriptional+paths+to+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">HuR: post-transcriptional paths to malignancy.</a> RNA Biol. 2, 11-13 (2005).</li>
<li>Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+stability+using+transcription+inhibitors+and+microarrays+reveals+posttranscriptional+control+of+ribosome+biogenesis+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA stability using transcription inhibitors and microarrays reveals posttranscriptional control of ribosome biogenesis factors.</a> Mol. Cell Biol. 24, 5534-5547 (2004).</li>
<li>Hieronymus, H., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+RNA-protein+interactions+illustrates+specificity+of+the+mRNA+export+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of RNA-protein interactions illustrates specificity of the mRNA export machinery.</a> Nat. Genet. 33, 155-161 (2003).</li>
<li>Hieronymus, H., Yu, M. C., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mRNA+surveillance+is+coupled+to+mRNA+export%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mRNA surveillance is coupled to mRNA export.</a> Genes Dev. 18, 2652-2662 (2004).</li>
<li>Mukherjee, N., Corcoran, D. L., Nusbaum, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Regulatory+Mapping+Indicates+that+the+RNA-Binding+Protein+HuR+Couples+Pre-mRNA+Processing+and+mRNA+Stability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative Regulatory Mapping Indicates that the RNA-Binding Protein HuR Couples Pre-mRNA Processing and mRNA Stability.</a> Molecular Cell. 43, 1-13 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.

Vanwege de aard van dit experiment optimalisatie en ervaring de enige gegarandeerd manieren om succesvol de beoogde resultaten te verkrijgen. In vele stappen van deze procedure, temperatuur en efficiënte behandeling van de reagentia en producten van doorslaggevend belang zijn. Een goede planning en uitvoering van techniek zal helpen verzekeren dat het experiment werd uitgevoerd binnen een passende termijn in de aanbevolen optimale temperaturen. Een belangrijk probleem met RNA isolatie experimenten is de gevoeligheid van RNA voor afbraak door RNasen. Alle reagentia moeten RNase vrij en opgeslagen of gebruikt in RNase-vrij containers. Dit is een cruciale stap in het waarborgen van de integriteit van uw mRNA monster. Zelfs wanneer het experiment goed wordt uitgevoerd, kan echter het gewenste resultaat niet door de aard van de interactie tussen de RBP en zijn doelwit mRNA worden bereikt. Een potentieel probleem is het hebben van lage of zelfs geen signaal van de RNA geïsoleerd door RIP-Chip.Hoewel er signaal van totaal RNA zijn, kan dit het gevolg van onvoldoende binding eiwit wordt afgebroken door de kralen. De eerste stap is om te bevestigen dat het cellulaire lysaat gebruikt adequate expressie van de specifieke RBP heeft. Na bevestiging kan eiwit worden geïsoleerd na de laatste NT2 wassen en geresuspendeerd in Laemmli buffer of andere geschikte denaturerende buffer en verwarmd op 95 ° C gedurende 5 minuten. Western blot analyse kan worden gebruikt bij deze monsters in coördinatie met ingang lysaat als negatieve controles om voldoende beneden trekken van geassocieerde eiwitten. Bovendien, omdat het lyseren van de cel nodig is om deze componenten te openen, kan de mogelijkheid van abnormale en ongewenste interacties tussen normaal gescheiden eiwitten en mRNA worden ingevoerd. Deze interacties zou kunnen binden en &quot;genieten&quot; je doel mRNA&#39;s of bindende eiwitten door middel van niet-specifieke interacties. Bovendien eiwitten in deze verschillende conditions kunt vouwen in meerdere varianten en hun bindende motieven kan ontoegankelijk geworden om hun doel mRNA&#39;s, het voorkomen van hun interacties. Beide versterken het belang van het efficiënt gebruik en de optimale temperatuur genoemde deze ongewenste interacties beperken. Daarnaast zal optimalisatie van wasomstandigheden voor elke specifieke doeleiwit kritisch om de zuiverheid van de interactie maximaliseren. Strengere wascondities nodig zijn. Bijvoorbeeld kan de wasbuffer worden aangevuld met SDS of een geschikte hoeveelheid ureum om niet-specifieke interacties en achtergrond te verminderen in een uitgangssignaal. Dit is volledig afhankelijk doel de experimentator RBP en het doel-mRNA in de unieke fysiologische omstandigheden. Sommige omstandigheden niet geschikt voor bepaalde mRNA analyse-instrumenten opgemerkt in voorbereiding van het monster. Tenslotte, hoewel RIP succesvol in de verrijking van RNARBP-interacties, een bekend probleem met RIP (CHIP) methode is het onvermogen om de specifieke bindende domeinen van de RBP identificeren op transiënte mRNA targets. Aantal verknopingstechnieken kan worden gevolgd door RIP unieke sequentie targets isoleren, maar het gebruik van korte golf UV gewoonlijk tot nucleïnezuur schade. Een nieuwe methode die PAR-CLIP of fotoactiveerbare ribonucleoside verknoping en immuoprecipitation, stelt langegolf UV thiouridine te nemen in nascent RNA waardoor de identificatie van unieke bindingsplaatsen van zowel stabiele en transiënte RNA interacties. Over het algemeen is RIP-Chip is opgericht als een uitstekend instrument dat wordt gebruikt voor het isoleren en de interacties tussen RNA-bindende eiwitten en hun mRNA doelen te bestuderen door onze groep net als vele andere onderzoeksgroepen. Hoewel gevoelig van aard en de praktijk zal goede uitvoering van deze procedure opbrengst van de isolatie van deze RNP complexen, die tot voor kort, zijn inaccessible voor ontdekking en analyse.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 1 M dithiothreitol </td><td> Visser </td><td> BP172-5 </td><td> DTT </td></tr><tr><td> DNase 1 </td><td> Ambion </td><td> 2235 </td><td> RNase vrij </td></tr><tr><td> Ethyleendiamine Tetraccetic Acid </td><td> Visser </td><td> BP118-500 </td><td> EDTA </td></tr><tr><td> Glycogeen </td><td> Ambion </td><td> 9516 </td><td></td></tr><tr><td> 1 HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375-100G </td><td> pH 7,0 </td></tr><tr><td> Igepal Nonidet P-40 </td><td> USB </td><td> 78641 </td><td> NP40 </td></tr><tr><td> 1 M KCl </td><td> Visser </td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl2 </td><td> Visser </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> NT2 Buffer </td><td> * Hieronder zie </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polysome Lysis Buffer </td><td> * Hieronder zie </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Proteaseremmer cocktail tabletten </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> Protein A Sepharose kralen </td><td> Sigma </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Visser </td><td> BP1700-100 </td><td></td></tr><tr><td> RNase Out RNase inhibitor </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td> 40 U / pl </td></tr><tr><td> 1 M NaCl </td><td> Visser </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfaat </td><td> Visser </td><td> BP166-500 </td><td> SDS </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> Visser </td><td&gt; BP153-500 </td><td> pH 7,4 </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-026 </td><td></td></tr><tr><td> Vanadyl Ribonucleoside Complexen </td><td> New England Labs </td><td> S1402S </td><td> VRC </td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><td> Reagens Opwerken </td></tr><tr><td> Bereid reagentia in RNase / DNase-vrij, DEPC behandeld glaswerk </td></tr><tr><td> Polysome lysisbuffer </td></tr><tr><td> 100 mM KCl </td></tr><tr><td> 5 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> 10 mM HEPES (pH 7,0) </td></tr><tr><td> 0,5% NP40 </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr><tr><td> 100 eenheden / ml RNase Out </td></tr><tr><td> 400 uM VRC </td></tr><tr><td> Proteaseremmer cocktail tablet </td></tr><tr><td> 5 ml lysisbuffer Polysome </td></tr><tr><td> Voeg 50 ul van 1 M HEPES (pH 7,0) </td></tr><tr><td> 500 pi van 1 M KCL </td></tr><tr><td> 25 ul van 1 M MgCl2 </td></tr><tr><td> 25 pi van NP40 </td></tr><tr><td> 4,7 ml RNase-vrij DNase-H 2 O </td></tr><tr><td> 50 ul van 1 M DTT </td></tr><tr><td> 12,5 pi van 100 U / ml RNase Out </td></tr><tr><td> 200 pi proteaseremmer cocktail (opgelost volgens fabrikant) </td></tr><tr><td> 10 pl 200 mM VRC (ten tijde van gebruik) </td></tr><tr><td> NT2 Buffer </td></tr><tr><td> 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 150 mM NaCl </td></tr><tr><td> 1 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> 0,05% NP40 </td></tr><tr><td> 1 L van NT2 Buffer </td></tr><tr><td> 50 ml Tris (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 30 ml 5 M NaCl </td></tr><tr><td> 1 ml 1 M MgCl <sub&gt; 2 </td></tr><tr><td> 500 pi NP40 </td></tr><tr><td> 820 ml RNase-vrij DNase-H 2 O </td></tr></tbody></table>

werkwijze voor het isoleren en identificeren van mrnas, microrna en eiwitcomponenten van ribonucleoproteïne complexen uit celextracten met rip-chip

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

Als gevolg van de ontwikkeling van high-throughput sequencing en efficiënte microarray analyse, globale genexpressie analyse een gemakkelijk en direct beschikbare vorm van gegevensverzameling. In veel onderzoek en ziektemodellen echter steady state niveaus van mRNA doelwitgen niet altijd rechtstreeks verband met steady state eiwitniveaus. Post-transcriptionele genregulatie is een waarschijnlijke verklaring van het verschil tussen de twee. Aangedreven door de binding van RNA-bindende eiwitten (RBP), post-transcriptionele regulatie beïnvloedt mRNA lokalisatie, stabiliteit en vertaling vormen van een ribonucleoproteïne (RNP) complex met doelwit mRNA. Identificeren deze onbekende de novo mRNA targets van cellulaire extracten in het RNP complex is cruciaal om te begrijpen mechanismen en functies van de RBP en de daaruit voortvloeiende effect op eiwit output. Dit protocol beschrijft een werkwijze genoemd RNP immunoprecipitatie-microarray (RIP-Chip), waardoor voor de identificatie van sPECIFIEKE mRNA&#39;s betrokken bij de ribonucleoproteïne complex, onder veranderende experimentele omstandigheden, samen met opties om verder te optimaliseren een experiment voor de individuele onderzoeker. Met deze belangrijke experimentele instrument, kunnen de onderzoekers verkennen de ingewikkelde mechanismen geassocieerd met post-transcriptionele genregulatie en andere ribonucleoproteïne interacties.

Een stap voor stap-protocol om het isoleren en identificeren van RNA bijbehorende complexen door middel van RIP-Chip.

Werkwijze voor het isoleren en identificeren van mRNAs, microRNA en eiwitcomponenten van ribonucleoproteïne complexen uit celextracten met RIP-Chip

Als gevolg van de ontwikkeling van high-throughput sequencing en efficiënte microarray-analyse is globale genexpressieanalyse een eenvoudige en ...

Het doel van deze video is om de methode voor de isolatie en identificatie van RNA's en eiwitcomponenten van ribonucleoproteïnecomplexen uit celextracten te demonstreren met behulp van immunoprecipitatiemethoden. Hallo, mijn naam is Garrett Dom en ik ben een promovendus bij de afdeling Moleculaire Microbiologie en Immunologie aan de University of Missouri, waar ik onderzoek doe onder begeleiding van Dr. Eli sso. Door de vooruitgang in high-throughput sequencing en efficiënte microarray-analyse is globale genexpressie en -analyse een eenvoudige en gemakkelijk toegankelijke vorm van gegevensverzameling geworden in veel onderzoeks- en ziektemodellen.Echter, de steady-state niveaus van het mRNA van het doelgen correleren niet altijd direct met de steady-state eiwitniveaus. Post-transcriptionele genregulatie is een waarschijnlijke verklaring voor de divergentie tussen deze twee, aangestuurd door de interacties van RNA-bindende eiwitten.Post-transcriptionele regulatie beïnvloedt de lokalisatie, stabiliteit en translatie van mRNA door het vormen van een ribonucleoproteïnecomplex met doel-mRNA's. Het identificeren van deze onbekende de novo mRNA-doelen uit cellulaire extracten binnen dit complex is essentieel voor het begrijpen van de mechanismen en functies van het RNA-bindend eiwit en het daaruit voortvloeiende effect op de eiwitproductie. Dit protocol beschrijft een methode genaamd ribonucleoproteïne-immunoprecipitatie, of RIP, waarmee specifieke mRNA's die geassocieerd zijn in het ribonucleoproteïnecomplex kunnen worden geïdentificeerd.Voordat u met het experiment begint, is het essentieel dat alle reagentia, containers en benodigdheden aanwezig zijn. Behandel glaswerk om het RNase-vrij te maken met een RNase-remmer zoals RNA ZAP van Ambion, gevolgd door spoelen met DEPC-behandeld water; zorg ervoor dat alle reagentia zijn bevestigd als RNase-vrij. De eerste stap van de procedure is het oogsten van het ribonucleoproteïnecomplex uit het cellysaat; oogst exponentieel groeiende weefselcellen om tussen de 2 mg en 5 mg totaal eiwit per gebruikt monster te produceren, waarbij gewoonlijk twee P150-kweekschalen volstaan.Hier oogsten we de menselijke borstkankercellijnen MB 2 31 en MC seven en onderzoeken we de ribonucleïne-interacties van het RNA-bindende eiwit. Het is belangrijk om op te merken dat voor elk onderzocht RNA-bindend eiwit het totale aantal cellen en de eiwithoeveelheden geoptimaliseerd moeten worden om de passende interacties tussen het doel-mRNA en het RNA-bindende eiwit te maximaliseren. Pelleteer de cellen via centrifugatie bij 1000 RPM gedurende ongeveer 8 tot 10 minuten bij 4 °C en was vervolgens drie keer met ijskoud PBS. Tik na de laatste wasbeurt voorzichtig tegen de onderkant van de buis en resuspendeer de celpellet in gelijke volumes van de bereide polysomale lysisbuffer met RNase- en protease-remmers.Het wordt aanbevolen om het exacte volume van het celpellet af te meten, het mengsel voorzichtig te pipetteren om celklonten te verbreken en het lysaat vijf minuten op ijs te incuberen. Centrifugeer 20 minuten bij 13 000 G en 4 °C om het lysaat te zuiveren van debris; breng het geklaarde supernatant onmiddellijk over in voorkoelde RNAse-vrije microcentrifugebuisjes, houd deze op ijs en bewaar ze bij -80 °C.Dit lysaat kan tot zes maanden worden bewaard bij -80 °C. Vermijd herhaalde vries-dooi-cycli, omdat dit kan leiden tot degradatie van eiwitten en/of mRNA. Het is aanbevolen om de IP direct uit te voeren.Bepaal snel de eiwitconcentratie van het lysaat met behulp van een standaard Bradford-eiwitassay. Vervolgens moeten de materialen worden voorbereid voor de isolatie van ons specifieke doeleiwit. Laat het eiwit eerst voorswellen.Incubeer de Sphero-beads een nacht in NT2-buffer aangevuld met 5% BSA bij 4 °C. Gebruik NT2-buffer in een verhouding van 4:1 met PAS-beads. Langdurige bewaring tot enkele maanden bij 4 °C is mogelijk.Wanneer er voorafgaand aan gebruik wordt aangevuld met 0,1% natriumazide, dient het overtollige NT2-buffer te worden verwijderd zodat de uiteindelijke verhouding tussen beads en buffer één-op-één is. Gebruik RNA-vrije microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter, verwijder 100 microliters SRO speed slurry en voeg 30 microgrammen antilichaam toe voor elke individuele IP-reactie. In ons experiment gebruiken we bijvoorbeeld een who are-antilichaam, wat een muis IgG1-antilichaam is.Daarom is onze controle-antilichaam ook een IgG1. Voeg vervolgens 100 tot 200 µL NT2-buffer toe aan het mengsel van antilichamen en beads. Daarnaast dient een isotype-gematcht antilichaam of normaal volledig serum van dezelfde soort parallel te worden gebruikt als antilichaamcontrole tegen achtergrond-RNA.Voeg het juiste antilichaam toe aan het kraalmengsel en incubeer dit een nacht onder endTime-rotatie bij vier graden Celsius. Bereid de met antilichamen gecoate kralen vlak voor gebruik door ze vijf keer te wassen met één milliliter ijskoud NT twee buffer; was de kralen door centrifugatie bij 13.000 G gedurende één tot twee minuten bij vier graden. Verwijder het supernatant voorzichtig met een handpipetteur of aspirator.Deze wasstap helpt om ongebonden antilichamen en RNA-contaminanten uit het antilichaamenmengsel te verwijderen. Zodra de laatste wasbeurt is voltooid, worden de beads opnieuw gesuspendeerd in 700 µL ijskoude NT2-buffer, gevolgd door behandeling met diverse RNA-remmers om de doel-mRNAs te beschermen, waaronder 10 µL RNase-out, 10 µL 100 mM DTT en 15 µL EDTA. Vul het volume aan tot 900 µL met NT2-buffer.Vervolgens zullen we het doelcomplex immunoprecipiteren. We raden ten zeerste aan om een pre-clear stap uit te voeren om het achtergrondsignaal in uw RNA-analyse na de RIP-procedure te verminderen; pre-clear met 15 micrograms isotype controle gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Voeg 50 microliters vooraf gezwollen PAS-beads toe die niet zijn gecoat met antilichamen.Incubeer 30 minuten bij 4 °C met rotatie en centrifugeer vervolgens bij 10.000 G bij 4 °C. Centrifugeer tot een pellet is gevormd. Bewaar het supernatant voor IP.Voeg vervolgens 100 µL van het geïsoleerde, geklaarde lysaat met ongeveer twee tot vijf mg eiwit toe aan de bereide antilichaammix. Het verdunnen van het lysaat helpt om de achtergrondruis te verminderen; sluit de buis af met parafilm om een goede afsluiting te garanderen en incubeer vier uur lang bij 4 °C onder rollende beweging. Pellet vervolgens de beads door centrifugatie bij 5.000 ×g gedurende vijf minuten bij 4 °C en bewaar het supernatant voor eventuele analyse door dit, zoals eerder beschreven, op te slaan bij -80 °C. Was de beads vijf keer met 1 mL ijskoude TNT-buffer gevolgd door centrifugatie.Verwijder vervolgens het supernatant met een handpipetteur of een aspirator. Om de achtergrondruis te verminderen, kunnen stringentere methoden worden toegepast door de NT twee-buffer aan te vullen met natriumdeoxycolaat, ureum of SDS. Houd de monsters zoveel mogelijk op ijs en werk snel om degradatie van het doel-mRNA te minimaliseren.Ten slotte gebruiken we DNase- en proteinase K-behandelingen gevolgd door RNA-precipitatie om de ribonucleoproteïne-RNA's te isoleren; resuspendeer de kralen na het wassen in 100 µL N NT 2-buffer aangevuld met 5 µL RNAse-vrije DNase I. Bewaar de monsters gedurende 5 tot 10 minuten bij 37 °C. Voeg 1 mL N NT 2-buffer toe en centrifugeer bij 5.000 ×g gedurende vijf minuten.Verwijder de supernatant na het centrifugeren, resuspendeer de SRO-pellet in 100 µL NT2-buffer met 5 µL proteinase K (10 mg/mL) en 1 µL 10% SDS. Incubeer het geresuspendeerde kralenmengsel gedurende 30 minuten in een waterbad van 55 °C, waarbij elke 10 minuten voorzichtig wordt getikt. Proteinase K helpt bij het vrijmaken van de ribonucleoproteïnecomponenten. Centrifugeer de kralen tot een pellet.Centrifugeer 5 minuten bij 5 000 G bij kamertemperatuur en verzamel de supernatant, die een volume van ongeveer 100 µL zou moeten hebben. Voeg vervolgens 200 µL NT2-buffer toe aan de beads en centrifugeer 2 minuten bij 5 000 G. Verzamel ongeveer 200 µL van de supernatant en gooi de beads weg.Combineer de supernatant en voeg 300 µL van de zure fenollagen toe en vortex. Eén minuut op kamertemperatuur en centrifugeer op maximale snelheid bij kamertemperatuur gedurende één minuut. Verzamel 250 µL van de bovenlaag.Zorg ervoor dat de interface niet wordt verstoord, omdat dit tot contaminatie zal leiden. Voeg aan het RNA-monster 25 µL natriumacetaat bij een pH van 5,2, 625 µL gekoelde, 100% ethanol en 5 µL glyco blue mix toe. Meng goed en bewaar dit gedurende de nacht bij -20 °C.Om bovendien een goede terugwinning van RNA te garanderen, wordt glyco blue toegevoegd; dit dient als dragermolecuul om de zichtbaarheid van de RNA-pellet de volgende dag te vergroten. Meng de buisjes door deze drie tot vijf keer om te keren, centrifugeer vervolgens op 12.000 G bij 4 °C gedurende 30 minuten en verwijder de supernatant. Voeg 1 mL gekoelde 70% ethanol toe aan de blauwe pellet en meng door omkering of vortexen, gevolgd door centrifugatie.Centrifuge het monster bij 12, 000 G gedurende twee minuten bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en centrifugeer opnieuw bij 12, 000 G gedurende één minuut bij vier graden Celsius. Verwijder eventueel resterend 70% ethanol met een pipet en laat het pellet aan de lucht drogen.Laat vijf minuten lang op kamertemperatuur komen. Los opnieuw op in 20 tot 40 µL RNAse- en DNA-vrij water. Het monster is nu klaar voor kwantificering via NanoDrop-spectrometrie en verdere downstream-toepassingen, zoals kwantitatieve real-time PCR of microarray-analyse. Na RNA-isolatie werden microarray- en kwantitatieve real-time PCR uitgevoerd om de mRNA-targets van het RNA-bindende eiwit who are te onthullen, evenals de daaruit voortvloeiende verrijking vanuit de immunoprecipitatie.Bevestiging via western blot onthult een zuivere isolatie van who are proteïnen. Kwantitatieve PCR demonstreert de verrijkingsfactor van het mRNA-doelwit beta actin in vergelijking met IgG one controles. Hoewel microarray-analyse unieke genetische profielen onthult tussen MC seven en MB 2 31, borstkanker-cellijnen, is ribonucleoproteïne-immunoprecipitatie door onze groep, evenals door vele andere onderzoeksgroepen, gevestigd als een uitstekend instrument om de interacties tussen RNA-bindende proteïnen en hun mRNA-doelwitten te isoleren en te bestuderen; hoewel de procedure inherent gevoelig is, zal een correcte uitvoering leiden tot de isolatie van deze ribonucleoproteïnecomplexen, die tot voor kort ontoegankelijk waren voor ontdekking en analyse.

method-for-isolation-identification-mrnas-micrornas-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Vanwege het tijdelijke karakter van de pre-mRNA, kan het moeilijk zijn te isoleren en te...

Een snelle High-throughput Methode voor Mapping Ribonucleoproteins (RNP&#39;s) op de menselijke pre-mRNA

Genexpressie analyse van een subset van cellen in een specifiek weefsel vormt een grote uitdaging. In dit artikel wordt beschreven hoe u een hoge kwaliteit totaal RNA van een specifieke cel populatie te isoleren door het combineren van een snelle immunolabeling methode met lasermicrodissectie.

RNA isolatie van de Cel specifieke subpopulaties met behulp van laser-capture Microdissection Gecombineerd met Rapid immunolabeling

Dit manuscript beschrijft een aanpak om selectieve cognate RNP's te isoleren die in eukaryote cellen worden gevormd via een specifieke oligonucleotide-gestuurde verrijking. We tonen de toepasbaarheid van deze aanpak door een cognate RNP te isoleren die gebonden is aan het retrovirale 5' niet-vertaalde gebied dat is samengesteld uit DHX9/RNA-helicase A.

Isolatie van Cognate RNA-eiwitcomplexen van cellen met behulp van oligonucleotide-gerichte Elution

RNA-eiwitinteracties liggen aan de basis van veel cellulaire processen. Hier beschrijven we een in vivo methode om specifiek RNA te isoleren en nieuwe eiwitten te identificeren die ermee geassocieerd zijn. Dit kan nieuw licht werpen op hoe RNA's in de cel worden gereguleerd.

Novel-RNA-bindende eiwitten Isolatie door de snelle Methodologie

Dit verslag wordt een snelle en betrouwbare methode voor het valideren van mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs beschreven. Het gebruik van de methode synthetische biotinyleerd vergrendeld nucleïnezuur LNA gebaseerde miRNA bootst te vangen target mRNA. Vervolgens daar beklede magnetische kralen pulldown worden gebruikt de doelstelling mRNA voor kwantificering van qPCR polymerase-kettingreactie.

Biotine gebaseerde Pulldown Assay te valideren mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs

Een tandem RNA isolatie procedure (reis) voor herstel van endogeen gevormde mRNA-eiwitcomplexen wordt beschreven. Specifiek, RNA-eiwitcomplexen kruisverwijzende in vivo, polyadenylated RNAs zijn geïsoleerd uit extracten met oligo(dT) kralen en bepaalde mRNAs met gemodificeerde RNA antisense oligonucleotides worden vastgelegd. Eiwitten gebonden aan mRNAs worden gedetecteerd door analyse van de immunoblot.

Een Oligonucleotide gebaseerde Tandem RNA isolatie Procedure om te herstellen van eukaryotische mRNA-eiwitcomplexen

Een gedetailleerd protocol voor de toepassing van de klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vastleggen (CARIC) strategie ter identificatie van eiwitten bindende naar beide taalcode-instellingen en noncoding RNAs wordt gepresenteerd.

Vastleggen en identificatie van RNA-bindende proteÃ¯nen met behulp van klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vangen (CARIC) strategie

Hier beschrijven we een stapsgewijze strategie voor het isoleren van kleine Rna's, verrijkend voor Microrna's en het voorbereiden van samples voor sequentiëren met hoge doorvoer. Vervolgens beschrijven we hoe u de volgorde leest en lijnt u deze uit op microRNAs met behulp van open source tools.

Een complete pijplijn voor het isoleren en Sequentiëren van Microrna's en het analyseren ervan met open source tools

Hier presenteren we een protocol om endogene RNA binding sites of "Footprints" van RNA: proteïne (RNP) complexen uit zoogdiercellen te verrijken. Deze aanpak omvat twee immunoprecipitaties van RNP-subeenheden en wordt daarom nagesynchroniseerde RNA-immunoprecipitatie in tandem (RIPiT).

Identificatie van voetafdrukken van RNA: eiwitcomplexen via RNA-immunoprecipitatie in tandem gevolgd door sequencing (RIPiT-SEQ)

Hier beschrijven we de immunopreciatie van riosomen en bijbehorend RNA uit geselecteerde populaties volwassen mannelijke muizenkiemcellen met behulp van het RiboTag-systeem. Strategische veredeling en zorgvuldige immunoneerslag resulteren in schone, reproduceerbare resultaten die informeren over het vertalen van de kiemcel en inzicht geven in de mechanismen van gemuteerde fenotypes.

RiboTag immunoprecipitatie in de kiemcellen van de mannelijke muis

Leer RIP-Chip voor het isoleren van ribonucleoproteïnecomplexen uit cellysaten. Deze methode identificeert mRNA-doelen van RNA-bindende eiwitten voor post-transcriptionele genregulatieonderzoek.

Werkwijze voor het isoleren en identificeren van mRNAs, microRNA en eiwitcomponenten van ribonucleoproteïne complexen uit celextracten met RIP-Chip (Video) | JoVE Journal

Werkwijze voor het isoleren en identificeren van mRNAs, microRNA en eiwitcomponenten van ribonucleoproteïne complexen uit celextracten met RIP-Chip

Meer video's verkennen