Werkwijze voor het isoleren en identificeren van mRNAs, microRNA en eiwitcomponenten van ribonucleoproteïne complexen uit celextracten met RIP-Chip

Het doel van deze video is om de methode voor de isolatie en identificatie van RNA's en eiwitcomponenten van ribonucleoproteïnecomplexen uit celextracten met behulp van immunoprecipitatiemethoden te demonstreren. Hallo, mijn naam is Garrett Dom en ik ben een promovendus bij de afdeling Molecular and Microbiology and immunology aan de University of Missouri, waar ik onderzoek doe onder begeleiding van Dr. Eli sso. Door de vooruitgang in high-throughput sequencing en efficiënte microarray-analyse is globale genexpressie en -analyse een eenvoudige en gemakkelijk toegankelijke vorm van gegevensverzameling geworden in veel onderzoeks- en ziekteplafonds.

De steady-state niveaus van het mRNA van het doelgen correleren echter niet altijd direct met de steady-state proteïneniveaus. Post-transcriptionele genregulatie is een waarschijnlijke verklaring voor het verschil tussen beide, gedreven door de interacties van RNA-bindende eiwitten.

Post-transcriptionele regulatie beïnvloedt de lokalisatie, stabiliteit en translatie van mRNA door het vormen van een ribonucleoproteïnecomplex met doel-mRNA's. Het identificeren van deze onbekende de novo mRNA-doelen uit cellulaire extracten in dit complex is essentieel voor het begrijpen van de mechanismen en functies van het RNA-bindende eiwit en het daaruit voortvloeiende effect op de eiwitproductie. Dit protocol beschrijft een methode genaamd ribonucleoproteïne-immunoprecipitatie, of RIP, waarmee specifieke mRNA's die geassocieerd zijn met het ribonucleoproteïnecomplex kunnen worden geïdentificeerd.

Voordat u aan het experiment begint, is het essentieel dat alle reagentia, containers en instrumenten aanwezig zijn. Behandel glaswerk om het RNase-vrij te maken met een RNase-remmer, zoals RNA ZAP van Ambion, gevolgd door spoelen met DEPC-behandeld water; zorg ervoor dat alle reagentia zijn bevestigd als RNase-vrij. De eerste stap van de procedure is het oogsten van het ribonucleoproteïnecomplex uit het cellulair lysaat; oogst exponentieel groeiende weefselcellen om tussen de 2 mg en 5 mg totaal eiwit per gebruikt monster te produceren, waarbij gewoonlijk twee P150-kweekschalen voldoende zijn.

Hier oogsten we de menselijke borstkankercellijnen MB 231 en MC 7 en onderzoeken we de ribonucleïne-interacties van het RNA-bindend eiwit. Het is belangrijk om op te merken dat voor elk onderzocht RNA-bindend eiwit het totale aantal cellen en de eiwithoeveelheden moeten worden geoptimaliseerd om de passende interacties tussen het doel-mRNA en het RNA-bindende eiwit te maximaliseren. Pellet de cellen via centrifugatie bij 1000 RPM gedurende ongeveer 8 tot 10 minuten bij 4 °C, en was vervolgens drie keer met ijskoud PBS. Tik na de laatste wasbeurt voorzichtig tegen de onderkant van de buis en resuspendeer de celpellet in gelijke volumes van de bereide polysomale lysisbuffer met RNAse- en protease-remmers.

Het wordt aanbevolen om het exacte volume van de celpellet af te meten, het mengsel voorzichtig te pipetteren om celklonten op te breken en het lysaat vijf minuten op ijs te incuberen. Centrifugeer 20 minuten bij 13,000 G en 4 °C om het lysaat te klaren van debris; breng het geklaarde supernatant onmiddellijk over naar voorkoelde RNAse-vrije microcentrifugebuisjes, houd deze op ijs en bewaar ze bij -80 °C.

Dit lysaat kan tot zes maanden worden bewaard bij -80 °C. Vermijd herhaalde vries-dooi-cycli, aangezien dit kan leiden tot degradatie van eiwitten en/of mRNA. Het is raadzaam om de IP onmiddellijk uit te voeren.

Voer een snelle kwantificatie uit van de eiwitconcentratie in het lysaat met behulp van een standaard Bradford-eiwitassay. Vervolgens bereiden we de materialen voor voor de isolatie van ons specifieke doeleiwit. Laat de eiwitten eerst preventief zwellen.

Incubeer de Sphero-beads een nacht in NT2-buffer aangevuld met 5% BSA en bewaar deze bij 4 °C. Gebruik NT2-buffer in een verhouding van 4:1 met PAS-beads. Langdurige bewaring tot meerdere maanden bij 4 °C is mogelijk.

Wanneer er vóór gebruik 0,1% natriumazide is toegevoegd, dient het overtollige NT2-buffer te worden verwijderd zodat de uiteindelijke verhouding tussen beads en buffer één-op-één is. Gebruik RNA-vrije microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter om 100 microliters SRO speed slurry te verwijderen en voeg 30 microgrammen antilichaam toe voor elke individuele IP-reactie. In ons experiment gebruiken we bijvoorbeeld een who are-antilichaam, wat een muis IgG1-antilichaam is.

Daarom is ons controle-antilichaam ook een IgG 1. Voeg vervolgens 100 tot 200 µL NT 2-buffer toe aan het mengsel van antilichamen en beads. Daarnaast moet een isotype-overeenkomstig antilichaam of normaal volledig serum van dezelfde soort parallel worden gebruikt als antilichaamcontrole tegen achtergrond-RNA.

Voeg het geschikte antilichaam toe aan het kraalmengsel en incubeer dit een nacht onder langzame rotatie (tumbling) bij 4 °C. Bereid de met antilichamen gecoate kralen vlak voor gebruik door deze vijf keer te wassen met 1 mL ijskoude NT 2-buffer; was de kralen door centrifugatie bij 13.000 G gedurende 1 tot 2 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant voorzichtig met een handpipetteur of aspirator.

Deze wasstap helpt om ongebonden antilichamen en RNA-verontreinigingen uit het antilichaamsmengsel te verwijderen. Zodra de laatste wasstap is voltooid, worden de beads opnieuw gesuspendeerd in 700 µL ijskoude NT2-buffer, gevolgd door een behandeling met diverse RNA-remmers om de doel-mRNAs te beschermen, waaronder 10 µL RNase-out, 10 µL 100 mM DTT en 15 µL EDTA. Vul het volume aan tot 900 µL met NT2-buffer.

Vervolgens zullen we het doelcomplex immunoprecipiteren. We raden ten zeerste aan om een pre-clear stap uit te voeren om het achtergrondsignaal in uw RNA-analyse na de RIP-procedure te verminderen; pre-clear met 15 micrograms isotypecontrole gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Voeg 50 microliters vooraf gezwollen, niet met antilichamen gecoate PAS-beads toe.

Incubeer 30 minuten bij 4 °C met rotatie en centrifugeer vervolgens bij 10,000 G bij 4 °C. Centrifugeer tot een pellet wordt gevormd. Bewaar het supernatant voor IP.

Voeg vervolgens 100 µL van het geïsoleerde, geklaarde lysaat met ongeveer twee tot vijf mg eiwit toe aan de bereide antilichaammengsel. Het verdunnen van het lysaat helpt de achtergrondruis te verminderen; sluit de buis af met parafilm om een luchtdichte afsluiting te garanderen en incubeer vier uur lang bij 4 °C terwijl de buis wordt gekanteld. Pellet daarna de beads door centrifugatie bij 5.000 ×g gedurende vijf minuten bij 4 °C en bewaar het supernatant voor eventuele analyse bij -80 °C, zoals eerder beschreven. Was de beads vijf keer met 1 mL ijskoude TNT-buffer gevolgd door centrifugatie.

Verwijder vervolgens het supernatant met een handpipetteur of een aspirator. Om de achtergrondruis verder te verminderen, kunnen striktere methoden worden toegepast door de NT2-buffer aan te vullen met natriumdesoxycholaat, ureum of SDS. Houd de monsters zoveel mogelijk op ijs en werk snel om degradatie van het doel-mRNA te minimaliseren.

Ten slotte gebruiken we DNAse- en proteinase K-behandelingen gevolgd door RNA-precipitatie om de ribonucleoproteïne-RNA's te isoleren. Resuspendeer de kralen na het wassen in 100 µL N NT twee buffer aangevuld met 5 µL RNAse-vrije DNAse I. Bewaar de monsters gedurende 5 tot 10 minuten bij 37 °C. Voeg 1 mL N NT twee buffer toe en centrifugeer bij 5.000 ×g gedurende vijf minuten.

Verwijder de supernatant na het centrifugeren van het eiwit en resuspendeer de pellet in 100 µL NT2-buffer met 5 µL proteinase K (10 mg/mL) en 1 µL 10% SDS. Incubeer het geresuspendeerde kraalmengsel 30 minuten in een waterbad van 55 °C, waarbij elke 10 minuten voorzichtig wordt getikt. Proteinase K bevordert de vrijgave van de ribonucleoproteïnecomponenten. Centrifugeer de kralen tot een pellet.

Centrifugeer vijf minuten bij 5 000 G bij kamertemperatuur en verzamel de supernatant, waarvan het volume ongeveer 100 µL moet zijn. Voeg vervolgens 200 µL NT2-buffer toe aan de beads en centrifugeer twee minuten bij 5 000 G. Verzamel ongeveer 200 µL van de supernatant en gooi de beads weg.

Combineer de supernatant en voeg 300 µL van de onderste laag zuurfenol toe en vortex. Meng één minuut bij kamertemperatuur en centrifugeer op maximale snelheid bij kamertemperatuur gedurende één minuut. Verzamel 250 µL van de bovenste laag.

Wees zeer voorzichtig om de interface niet te verstoren, omdat dit tot contaminatie zal leiden. Voeg aan het RNA-monster 25 µL natriumacetaat bij een pH van 5,2, 625 µL gekoelde, 100% ethanol en 5 µL glyco blue mix toe. Meng goed en bewaar dit gedurende de nacht bij -20 °C.

Om bovendien een goede terugwinning van RNA te garanderen, zal de toevoeging van glyco blue de zichtbaarheid van het RNA-pellet vergroten door als dragermolecuul te fungeren. Meng de volgende dag de buisjes door drie tot vijf keer om te keren, centrifugeer vervolgens op 12,000 G bij four degrees Celsius gedurende 30 minuten en verwijder het supernatant. Voeg 1 mL gekoelde, 70% ethanol toe aan het blauwe pellet en meng door te inverteren of te vortexen; centrifugeer vervolgens.

Centrifuge het monster bij 12,000 G gedurende twee minuten bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en centrifugeer opnieuw bij 12,000 G gedurende één minuut bij vier graden Celsius. Verwijder eventuele resten 70%ethanol met een pipet en laat het pellet aan de lucht drogen.

Laat vijf minuten op kamertemperatuur staan. Los opnieuw op in 20 tot 40 µL RNAse- en DNA-vrij water. Het monster is nu klaar voor kwantificering via NanoDrop-spectrometrie en verdere downstream-toepassingen zoals kwantitatieve real-time PCR of microarray-analyse. Na RNA-isolatie werden microarray en kwantitatieve real-time PCR uitgevoerd om de mRNA-targets van het RNA-bindende eiwit who are te onthullen, evenals de daaruit resulterende verrijking uit de immunoprecipitatie.

Bevestiging via western blot onthult een zuivere isolatie van who are proteïnen. Kwantitatieve PCR demonstreert de fold-verrijking van het mRNA-doelwit beta actin in vergelijking met IgG one controles. Hoewel microarray-analyse unieke genetische profielen onthult tussen MC seven en MB 2 31, borstkankercellijnen in het algemeen, is ribonucleoproteïne-immunoprecipitatie door onze groep, evenals door vele andere onderzoeksgroepen, gevestigd als een uitstekend hulpmiddel om de interacties tussen RNA-bindende proteïnen en hun MR.A-doelwitten te isoleren en te bestuderen; ondanks de gevoeligheid van de aard en praktijk, zal een correcte uitvoering van deze procedure leiden tot de isolatie van deze ribonucleoproteïnecomplexen, die tot voor kort ontoegankelijk waren voor ontdekking en analyse.