Werkwijze voor het isoleren en identificeren van mRNAs, microRNA en eiwitcomponenten van ribonucleoproteïne complexen uit celextracten met RIP-Chip

Het doel van deze video is om de methode voor de isolatie en identificatie van RNA's en eiwitcomponenten van ribonucleoproteïnecomplexen uit celextracten te demonstreren met behulp van immunoprecipitatiemethoden. Hallo, mijn naam is Garrett Dom en ik ben een afgestudeerde student in de afdeling Moleculaire en Microbiologie en Immunologie aan de Universiteit van Missouri, studerend onder Dr. Eli sso. Door de vooruitgang in high-throughput sequencing en efficiënte microarray-analyse is wereldwijde genexpressie en -analyse een eenvoudige en direct beschikbare vorm van gegevensverzameling geworden in veel onderzoeks- en ziektemodellen.

Echter, het bestuderen van de toestand van het doelgen-mRNA doet niet altijd direct correleren met stabiele eiwitniveaus. Posttranscriptionele genexpressieregulatie is een waarschijnlijke verklaring voor de divergentie tussen de twee. Aangedreven door de interacties van RNA-bindende eiwitten.

Posttranscriptionele regulatie beïnvloedt mRNA-lokalisatie, stabiliteit en translatie door een ribonucleoproteïnecomplex te vormen met doel-mRNA's. Het identificeren van deze onbekende Denovo mRNA-doelen uit cellulaire extracten in dit complex is cruciaal voor het begrijpen van de mechanismen en functies van het RNA-bindende eiwit en hun resulterende effect op de eiwitoutput. Dit protocol beschrijft een methode genaamd riboproteïne, immuno-immunoprecipitatie, of rip, die de identificatie van specifieke mRNA's mogelijk maakt die geassocieerd zijn met het ribonucleoproteïnecomplex.

Voordat u met het experiment begint, is het van cruciaal belang om alle reagentia, containers en gebruiksvoorwerpen te hebben. Glaswerk vrij van RNA's met R nase-remmer zoals RNA ZAP van Ambion, gevolgd door spoelen met dpci-behandeld water, zorg ervoor dat alle reagentia zijn bevestigd als RNA's-vrij. De eerste stap van de procedure is het oogsten van het ribonucleoproteïnecomplex uit de cellulaire lysaal. Oogst exponentieel groeiende weefselcellen om tussen de twee tot vijf milligram totaal eiwit voor elk gebruikte monster te produceren, meestal zijn twee P een 50-kweekschotels voldoende.

Hier oogsten we MB 2 31 en MC zeven menselijke borstkankercellijnen en onderzoeken de ribonucleaire interacties van het RNA-bindende eiwit. Het is belangrijk om op te merken dat voor elk RNA-bindend eiwit dat wordt onderzocht, het totale aantal cellen en de eiwithoeveelheid moeten worden geoptimaliseerd om de juiste doel-mRNA en RNA-bindende eiwitinteracties te maximaliseren. Pellet cellen via centrifugatie bij 1000 RPM gedurende ongeveer acht tot tien minuten bij vier graden Celsius, was vervolgens drie keer met ijskoud PBS. Na de laatste wasbeurt, sla de bodem van de buis voorzichtig en suspendeer de celpellet in gelijke volumes van bereide polysomale lysebuffer met RNA's en proteaseremmers.

Het wordt aanbevolen om het exacte volume van de celpellet te meten, mengen voorzichtig met de pipet om klonten cellen te breken en het lysaal gedurende vijf minuten op ijs te incuberen. Centrifugeer bij 13.000 G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius om het lysaal van puin te verwijderen, breng onmiddellijk het verdunde supernatant over naar voorgekoelde, RNA's-vrije microcentrifugebuizen, bewaar op ijs en bewaar bij min 80 graden Celsius.

Dit lysaal kan tot zes maanden worden bewaard bij min 80 graden Celsius. Vermijd herhaalde vries-dooi-cycli, omdat dit kan leiden tot eiwit- en/of mRNA-degradatie. Het is het beste om de IP onmiddellijk uit te voeren.

Doe een snelle kwantitatieve bepaling van de eiwitconcentratie en het lysaal met behulp van een standaard Bradford-eiwittest. Vervolgens moeten we de materialen voorbereiden voor de isolatie van ons specifieke eiwit van belang. Eerst pre-swell-eiwit.

Een Sfero-kralen overnacht in N NT twee buffer aangevuld met 5%BSA, bewaar bij vier graden Celsius. Gebruik NT twee buffer in een vier-op-een-verhouding met PAS-kralen. Langdurige opslag gedurende enkele maanden bij vier graden Celsius is mogelijk.

Wanneer aangevuld met 0,1% natrium-azi vóór gebruik, verwijder overtollig NT twee buffer zodat de uiteindelijke kralen-naar-bufferverhouding één-op-één is. Gebruik 1,5 milliliter RNA-vrije microcentrifugebuizen, verwijder 100 microliter SRO-snelheidsslurry en voeg 30 microgram antilichaam toe voor elke individuele IP-reactie. In ons experiment gebruiken we bijvoorbeeld een who-are-antilichaam, dat een muis IgG een-antilichaam is.

Daarom is ons controle-antilichaam ook IgG een. Voeg vervolgens 100 tot 200 microliter NT twee buffer toe aan het antilichaamkralenmengsel. Daarnaast moet een isotype-overeenkomend antilichaam of heel normaal serum van dezelfde soort parallel worden gebruikt als antilichaamcontrole tegen achtergrond-RNA.

Voeg het juiste antilichaam toe aan het kralenmengsel en incubeer overnacht tijdens het rollen in over end bij vier graden Celsius. Bereid de antilichaam-gecoate kralen onmiddellijk voor gebruik door te wassen met één milliliter ijskoud NT twee buffer vijf keer. Was de kralen door centrifugatie bij 13.000 G gedurende één tot twee minuten bij vier graden. Verwijder voorzichtig het supernatant met een handspuit of aspirator.

Dit wassen helpt bij het verwijderen van ongebonden antilichamen en RNA's-contaminanten uit het antilichaammenging. Zodra de laatste wasbeurt is voltooid, resuspendeer de kralen en 700 microliter ijskoud T twee buffer, gevolgd door behandeling met verschillende RNA's-remmers om de doel-mRNA's te beschermen, inclusief 10 microliter RNA's, 10 microliter 100 millimolair DTT en 15 microliter EDTA. Breng het volume op 900 microliter met NT twee buffer.

Vervolgens zullen we het doelcomplex immunoprecipiteren. We raden sterk aan een pre-clear-stap te gebruiken om achtergrondsignalen in uw RNA-analyse na de rip-procedure te verminderen. Pre-clear met 15 microgram isotype-controle gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Voeg 50 microliter pre-zwollende PAS-kralen toe die niet zijn gecoat met antilichaam.

Incubeer 30 minuten bij vier graden Celsius met rotatie en