Name: Chromatine Isolatie door RNA-zuivering (Chirp) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Leer de ChIRP-methode om DNA-regio's te identificeren die geassocieerd zijn met lange niet-coderende RNA's. Deze techniek biedt genoombrede kaarten met hoge resolutie voor onderzoek naar chromatindynamica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken T. Hung, MC. Tsai, O. Manor, E. Segal, M. Kuroda, T. Swigut, en ik Shestopalov voor discussies. Ondersteund door het Agentschap van Wetenschap, Technologie en Onderzoek van Singapore (CC), NIH R01-CA118750 en R01-HG004361 (HYC), en Californië Instituut voor Regeneratieve Geneeskunde (HYC). HYC is een Early Career wetenschapper van het Howard Hughes Medical Institute.

1. Probe-ontwerp Ontwerp anti-sense DNA-tegels probes voor selectieve ophalen van RNA-doelwit door Chirp. <ol><li> Ontwerp anti-sense oligo-probes met behulp van de online sonde ontwerper bij <a href="http://singlemoleculefish.com">singlemoleculefish.com</a> 18. </li><li> Gebruik deze parameters: aantal sondes = 1 probe / 100 bp van RNA lengte, 2) Target GC% = 45, 3) Oligonucleotide lengte = 20; 4) Afstand lengte = 60-80. Breek RNA in segmenten als er te lang voor de ontwerper. Laat gebieden herhaalt of uitgebreide homologie. </li><li> Bestel anti-sense DNA-probes met BiotinTEG op 3-prime end. </li><li> Label probes volgens de posities langs het RNA. Scheid ze in twee zwembaden, zodat de &quot;even&quot; pool bevat alle sondes nummering 2, 4, 6, etc. en de &quot;oneven&quot; pool bevat sondes nummering 1, 3, 5, enz. verdunnen pool van de sondes op 100 uM concentratie en Bewaar bij -20 ° C. </li><li> Alle experimenten worden uitgevoerd metbeide groepen, die als interne controle elkaar. Real RNA-afhankelijke signaal aanwezig zou zijn van beide zwembaden, terwijl de probe-specifieke geluiden zou uniek zijn voor elk zwembad. Dit geldt zowel voor Chirp-qPCR en Chirp-seq. </li></ol> 2. Harvest Cellen Verzamelen cellen die worden gebruikt voor Chirp experiment. <ol><li> Groei cellen in weefselkweek platen of kolven tot confluentie. Spoel met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voor eens en trypsinize. Quench trypsine met&gt; 2x volume van de media, pipet op en neer naar de cellen los te maken en in enkele celsuspensie mengen. Breng alle media en geresuspendeerde cellen in 50 ml Falcon buizen. 20 miljoen cellen zijn gewoonlijk voldoende voor een Chirp monster. </li><li> Spin cellen 800RCF 4 min. Zuig media en hersuspenderen 40 miljoen cellen in 40 ml PBS, combineren buizen indien nodig. Spin cellen 800RCF 4 min. Giet PBS, zorgvuldig te zuigen op een hoek de resterende vloeistof. </li></ol&gt; 3. Cross-link Cellen en Collect celpellet Crosslink verzamelde cellen met glutaaraldehyde op RNA-chromatine interacties te bewaren en voor te bereiden celpellet. <ol><li> Voer alle stappen bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid 1% glutaaraldehyde bij kamertemperatuur PBS. Doe in 10 ml per 10 miljoen cellen (0,4 ml 25% glutaaraldehyde voorraad + 9,6 ml PBS). Glutaraldehyde moet worden gebruikt fris. </li><li> Tik onderkant van Falcon buizen aan pellets te verwijderen. Resuspendeer celpellet in 1% glutaaraldehyde, te beginnen met een klein volume te brokken te vermijden, dan herladen tot vol volume. Omkeren om te mengen. Crosslink 10 min. bij kamertemperatuur op een eind-tot-eind schudapparaat of rotator. </li><li> Doof het verknopingsreactie met 1/10e volume van 1,25 M glycine bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Spin op 2000RCF gedurende 5 minuten. Zuig supernatant en was pellet met 20 ml koud PBS een keer, het spinnen op 2000RCF gedurende 5 minuten. </li><li> Zuig en resuspendeer de wverast, cross-linked pellet met 1 ml gekoelde PBS per 20 miljoen cellen. Breng elke ml aan een Eppendorf buis en draaien op 2000RCF gedurende 3 minuten bij 4 C. Verwijder zoveel mogelijk met PBS pipetpunt nauwkeurig. </li><li> De cel pellets in vloeibare stikstof en opslaan Flash-invriezen bij -80 ° C voor onbepaalde tijd. </li></ol> 4. Cell Lysis Lyseren verknoopt cellen cellysaat bereiden. <ol><li> Ontdooi bevroren celpellets bij kamertemperatuur. Tik op moeilijk te verjagen en meng de cel pellet. Draai beneden de pellet bij 2000RCF gedurende 3 minuten bij 4 ° C. Gebruik een scherpe 10 pl pipetpunt om de resterende PBS te verwijderen. </li><li> Op een elektronische weegschaal (nauwkeurig tot op 1 mg) tarra de massa van een lege eppendorfbuisje (onze buizen wegen 1,060 gram zeer consequent). Weeg elke pellet en opnemen zijn gewicht. Een volledige 15 cm schotel van verknoopt HeLa cellen weegt meestal 100 mg. </li><li> Supplement Lysis Buffer (10x de massa van de pellet, bijvoorbeeld 1 ml voor 100 mg) met FRESh Proteaseremmer, PMSF en Superase-in (zie bijgevoegde buffer lijst). Meng goed. </li><li> Voeg 10X volume aangevuld Lysis Buffer aan elke buis en resuspendeer de pellet. Voor kleine pellets &lt;25 mg, opnieuw in suspensie in 250 ul aangevuld lysis buffer. Schorsing moet glad zijn. Zo niet, dan verdeelt de schorsing in 500 pi porties en gebruik een gemotoriseerde pellet mixer te breken bosjes. Ga onmiddellijk naar ultrasoonapparaat. </li></ol> 5. Sonicatie Shear DNA door sonicatie verknoopt cellysaten. <ol><li> Bewerk met ultrasone trillingen cellysaat in Bioruptor in 15 ml Falcon buizen. Gebruik &lt;1,5 ml lysaat in elke buis, en een snellere sonicatie niet meer dan twee buizen ultrasone trillingen per keer. </li><li> Ultrasone trillingen in een 4 ° C waterbad hoogste stand van 30 seconden, 45 seconden OFF puls intervallen. Controleer lysaat elke 30 minuten. Verder sonicatie tot het cellysaat niet meer troebel. Dit kan slechts 30 minuten en liefst 4 uur. Het aantalvan buizen, zal het monster volume, het bad temperatuur, en de periode van ultrasoonapparaat tijd invloed hebben op hoe lang het proces duurt. Buizen zal waarschijnlijk ultrasone trillingen met verschillende snelheden, dus bundelen ze samen om de 30 min en herverdelen in de originele buizen om homogeniteit te garanderen. Let op: glutaaraldehyde-verknoopt cellen nemen aanzienlijk langer aan ultrasone trillingen dan de formaldehyde-equivalenten. </li><li> Bij het lysaat duidelijk wordt, over te dragen 5 pi lysaat een nieuwe Eppendorf buis. Voeg 90 uL DNA Protease K (PK) Buffer (zie buffer lijst) en 5 ul PK. Vortex te mengen en even spin down. Incubeer 45 min bij 50 ° C. </li><li> Pak DNA met PCR Qiagen zuivering kit. Elueer DNA in 30 pi Qiagen elutiebuffer (EB) en controleer DNA grootte van 1% agarose gel. Als grootste deel van de DNA-uitstrijkje is 100-500 bp, sonicatie is voltooid. Zo niet, dan blijven ultrasone trillingen. </li><li> Centrifugeer gesoniceerd monsters 16100RCF gedurende 10 min bij 4 ° C. Combineer supernatanten, aliquot in 1 ml monsters en flash-vries in vloeibare nitrogen. Bewaren bij -80 ° C. </li></ol> 6. Chirp Hybridiseren gebiotinyleerde DNA probes om RNA te isoleren gebonden chromatine. <ol><li> Ontdooien buizen van chromatine bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid hybridisatiebuffer (zie de lijst van buffers, voor te bereiden 2 ml per ml van het chromatine). Vortex om te mengen. </li><li> Voor een typische Chirp monster door 1 ml van lysaat, verwijder dan 10 pi voor RNA-INPUT en 10 ul voor DNA-INPUT en plaats in Eppendorf buizen. Houd op het ijs tot verder gebruik. </li><li> Breng 1 ml chromatine tot 15 ml Falcon buis. Voeg 2 mL hybridisatiebuffer aan elke buis. Voor het totale volume &lt;1,5 ml, gebruik Eppendorf buizen. </li><li> Ontdooi sondes bij kamertemperatuur. NanoDrop sondes te bedragen controleren of u niet gebruikt in een lange tijd (100 uM sondes moeten spec ~ 500-600 ng / ul met behulp van enkele streng DNA-instelling). Voeg het juiste volume van de sondes aan specifieke buizen (100 pmol sonde per 1 ml chromatine, 1 pl van 100 pmol / ul sonde per 1 ml chromatine).Meng goed. Incuberen bij 37 ° C gedurende 4 uur onder schudden. </li><li> Met 20 min resterende hybridisatie bereiden C1 magnetische kralen (bewaard bij 4 ° C). Gebruik 100 ul per 100 pmol van de sondes. Wassen met 1 ml unsupplemented Lysis Buffer drie keer, met behulp van de DynaMag-2 magneetstrip te scheiden kralen uit buffer. </li><li> Resuspendeer kralen in oorspronkelijke volume van Lysis Buffer, te vullen met verse PMSF, PI en Superase-in. Na 4 uur hybridisatie reactie voltooid worden 100 ul kralen aan elk buisje. Meng goed. Incuberen bij 37 ° C gedurende 30 min onder schudden. </li><li> Bereid Was Buffer (5 ml per monster). Vortex om te mengen. Voorverwarmen tot 37 ° C. Voeg PMSF voor gebruik. </li><li> Was kralen met 1 ml wasbuffer vijf keer. Op de eerste wasbeurt, gebruik DynaMag-15 magneetstrip om aparte kralen, giet, en resuspendeer in 1 ml wasbuffer. Breng volume 1,5 mL Eppendorf buis. Incuberen bij 37 ° C met schudden gedurende 5 minuten. </li><li> Bij volgende wasbeurten, spin down elke buis op een minicentrifuge, Stel monster op DynaMag-2 magnetische strip gedurende 1 minuut. Giet monster, veegt alle druppels met een Kimwipe, opnieuw in suspensie in 1 ml wasbuffer. Incuberen bij 37 ° C met schudden gedurende 5 minuten. Herhaal dit voor in totaal vijf wasbeurten. </li><li> Eindelijk wassen, goed mengen van de kralen. Verwijder 100 ul en zet ze opzij voor RNA isolatie. Reserve 900 ul DNA voor fractie. Plaats alle buizen op DynaMag-2 magnetische strip en verwijder wasbuffer. Draai alle buizen naar beneden kort, leg ze op de magneet strip. Volledig verwijderen van de laatste beetje wasbuffer met een scherp 10 pl pipetpunt. </li></ol> 7. RNA isolatie Uittreksel RNA fractie van Chirp monsters te kwantificeren door qRT-PCR. <ol><li> Neem 100 ul kraal monsters en 10 pl RNA INPUT monster. Voeg 85 uL RNA PK Buffer pH 7,0 tot INPUT RNA. Resuspendeer kralen in 95 ul RNA PK Buffer pH 7,0. Voeg 5 ul Proteinease K en incuberen bij 50 ° C gedurende 45 min met end-to-end schudden. </li><li> In het kort spin down alle buizen enkook monsters gedurende 10 min op verwarmingsblok bij 95 ° C. </li><li> Chill monsters op ijs, krachtig toe te voegen 500 pL TRIzol, vortex gedurende 10 sec. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Bewaren bij -80 ° C of ga naar stap 4. </li><li> Voeg 100 ul chloroform TRIzol behandelde monsters. Vortex krachtig gedurende 10 sec. Spin op 16100RCF op een benchtop centrifuge gedurende 15 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder ~ 400 pL waterige supernatans, het vermijden van organische en interface. </li><li> Voeg 600 ul (1,5 volume) 100% ethanol en meng goed. Spin monster door MIRNeasy mini-kolommen. Was 1x met RWT (MIRNeasy mini-kit), 2x met RPE per protocol van de fabrikant. Elueren met 30 pi nuclease vrij H2O (NFH 2 O). </li><li> Behandel de RNA eluaat met DNA-free per protocol van de fabrikant. Nadat de reactie is voltooid, verwarmen van het monster gedurende 15 minuten bij 65 ° C volledig te inactiveren resterende DNase. </li><li> Gebruik 1 pl RNA isolaat per goed voor qRT-PCR analyse lncRNA te bevestigenophalen. GAPDH wordt vaak gebruikt als een negatieve controle. </li></ol> 8. DNA isolatie Uittreksel DNA-fractie van Chirp monsters te herkennen aan sequencing of door qPCR kwantificeren. <ol><li> Bereid DNA elutiebuffer (zie buffer lijst), 150 ul per monster, met inbegrip van DNA INPUT. </li><li> Voeg 1 0μL RNase A (10 mg / ml) en 10 pi RNase H (10 U / pl) per ml DNA elutiebuffer en vortex te mengen. </li><li> Resuspenderen elk monster korrels in 150 ul DNA elutiebuffer met RNAses. (Hersuspenderen DNA INPUT in 140 pi) Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min onder schudden. </li><li> Aparte kralen en supernatant op DynaMag-2 magnetische strip. Verwijder supernatant en gelabeld aan buizen. </li><li> Bereid een tweede hoeveelheid van DNA elutiebuffer met 10 pi RNase A (10 mg / ml) en RNaseH (10 U / ul) precies zoals gedaan 8.2). Voeg 150 ul aan elk monster (met inbegrip van DNA INPUT), incubeer en verwijder supernatant. Verzamel alle supernatant (schouderd te zijn ~ 300 pi). </li><li> Voeg 15 ul PK aan elk monster. Incubeer bij 50 ° C gedurende 45 min met schudden. </li><li> Pre-spin down geel phase-lock gel buizen (5PRIME). Overdracht DNA-monsters aan phase-lock gel buizen, en voeg 300 ul PhOH: Chloroform: Isoamyl per monster. Schudden gedurende 10 minuten en spin neer op een tafelmodel centrifuge bij 16100RCF gedurende 5 min bij 4 ° C. Neem waterige vanaf de top (~ 300 pi). Voeg 3 ul GlycoBlue, 30 pi NaOAc en 900 ul 100% EtOH. Meng goed en bewaar bij -20 ° C gedurende de nacht. </li><li> Spin monsters 16100RCF gedurende 30 minuten bij 4 ° C. </li><li> Giet supernatant voorzichtig. Voeg 1 ml 70% EtOH en vortex te mengen. Spin op 16100RCF gedurende 5 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof met een pipet. Air drogen 1min. Resuspenderen in 30 pi EB. </li><li> DNA-monsters zijn klaar voor analyse door qPCR of het bereiden van high-throughput sequencing bibliotheken per Illumina-protocol. </li></ol> 10. Representatieve resultaten Figuur 1 </strong&gt; toont de Chirp workflow. Een succesvolle Chirp experiment verrijkt typisch significant meer doel-RNA-specifieke RNAs. Figuur 2 verrijking van de menselijke telomerase RNA (TERC) van HeLa cellen over GAPDH een overvloed van cellulaire RNA dat als een negatieve controle. De meerderheid van TERC RNA&#39;s (~ 88%) in de cel aanwezig zijn naar beneden getrokken door het uitvoeren van tjilpen, terwijl slechts 0,46% van de GAPDH RNA werd teruggehaald, aantonen dat er een verrijking factor van ~ 200 maal. Aspecifieke probes zoals probes gericht LacZ RNA, die niet wordt uitgedrukt in zoogdiercellen (figuur 2) kan worden gebruikt als additionele negatieve controles. DNA-regio&#39;s verwacht dat de doelgroep lncRNA te binden zijn meestal verrijkt over negatieve regio&#39;s, gemeten door qPCR. Figuur 3 toont qPCR validatie van vier Hotair-gebonden sites in primaire humane voorhuid fibroblasten dat we bepaald door het uitvoeren van Chirp-seq in dezelfde cel lijn, terwijl TERC en GAPDH DNA websites seRVE als negatieve controle regio&#39;s. Zowel de &quot;even&quot; en &quot;oneven&quot; probe sets leverde vergelijkbare verrijking van de verwachte Hotair-gebonden sites over negatieve regio&#39;s, een kenmerk van echte lncRNA-bindende sites. High-throughput sequencing van Chirp verrijkte DNA levert een globale kaart van lncRNA-bindingsplaatsen. De Drosophila lncRNA roX2 bekend is de X-chromosoom interactie op een wijze die nodig is voor dosering vergoeding. Figuur 4 toont roX2 bindingsprofiel over een gedeelte van het X-chromosoom. Zowel de &quot;even&quot; en &quot;oneven&quot; monsters zijn gesequenced en hun unieke geluiden zijn geëlimineerd om een ​​track van overlappende signalen te produceren. Elke &quot;piek&quot; geeft hier een sterke site van roX2 bindend. De volledige baan en de lijst van roX2 genen zijn beschreven in Chu et al.. 2011 17. <img alt="Figuur 1." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig1.jpg" /> Figuur 1. Stroomdiagram van de Chirp proceduredure voorschrijft. Chromatine wordt verknoopt aan lncRNA: eiwitadducten in vivo Biotinylated tegelwerk probes gehybridiseerd aan lncRNA richten, en chromatine complexen worden gezuiverd met behulp van magnetische streptavidine kralen, gevolgd door strenge wasbeurten.. We elueren lncRNA gebonden DNA of eiwitten met een cocktail van RNase A en H. Een vermoedelijke lncRNA bindende sequentie wordt schematisch voorgesteld in de kleur oranje. Eerder verschenen in Chu et al.. 2011. 17 <img alt="Figuur 2." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig2.jpg" /> Figuur 2. Chirp verrijkt voor menselijke TERC RNA. TERC-asDNA sondes op te halen ~ 88% van de cellulaire TERC RNA en niet op te sporen GAPDH. LacZ-asDNA probes worden gebruikt als negatieve controles en ophalen niet RNAs. De gemiddelde + sd worden weergegeven. Eerder verschenen in Chu et al.. 2011. 17 <img alt="Figuur 3." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig3.jpg" /> Figuur 3. Hotair Chirp-qPCR in het primair mens voorEskin fibroblasten. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 en ABCA2 zijn regio&#39;s die samenwerken met Hotair. TERC en GAPDH dienden als negatieve controles. De gemiddelde + sd worden weergegeven. Eerder verschenen in Chu et al.. 2011. 17 <img alt="Figuur 4." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig4.jpg" /> Figuur 4. Chirp volgende gegevens roX2 RNA in Sl2 Drosophila cellen. &quot;Even&quot; en &quot;oneven&quot; werden afzonderlijk gesequenced, hun gegevens samen te voegen tot enige gemeenschappelijke pieken weerspiegelen in beide. De samengevoegde traject wordt weergegeven. Eerder verschenen in Chu et al.. 2011. 17

<ol><li>Koziol, M. J., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+traffic+control+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">RNA traffic control of chromatin complexes.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 142-148 (2010).</li>
<li>Mercer, T. R., Dinger, M. E., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNAs%3A+insights+into+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNAs: insights into functions.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 155-159 (2009).</li>
<li>Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+demarcation+of+active+and+silent+chromatin+domains+in+human+HOX+loci+by+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs.</a> Cell. 129, 1311-1323 (2007).</li>
<li>Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+proteins+targeted+by+a+short+repeat+RNA+to+the+mouse+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome.</a> Science. 322, 750-756 (2008).</li>
<li>Kelley, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+spreading+of+the+Drosophila+dosage+compensation+complex+from+roX+RNA+genes+into+flanking+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenetic spreading of the Drosophila dosage compensation complex from roX RNA genes into flanking chromatin.</a> Cell. 98, 513-522 (1999).</li>
<li>Pandey, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kcnq1ot1+antisense+noncoding+RNA+mediates+lineage-specific+transcriptional+silencing+through+chromatin-level+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Kcnq1ot1 antisense noncoding RNA mediates lineage-specific transcriptional silencing through chromatin-level regulation.</a> Mol. Cell. 32, 232-246 (2008).</li>
<li>Wang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long+noncoding+RNA+maintains+active+chromatin+to+coordinate+homeotic+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A long noncoding RNA maintains active chromatin to coordinate homeotic gene expression.</a> Nature. 472, 120-124 (2011).</li>
<li>Khalil, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 11667-11672 (2009).</li>
<li>Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol. Cell. 40, 939-953 (2010).</li>
<li>Meller, V. H., Wu, K. H., Roman, G., Kuroda, M. I., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((roX1+RNA+paints+the+X+chromosome+of+male+Drosophila+and+is+regulated+by+the+dosage+compensation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">roX1 RNA paints the X chromosome of male Drosophila and is regulated by the dosage compensation system.</a> Cell. 88, 445-457 (1997).</li>
<li>Franke, A., Baker, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rox1+and+rox2+RNAs+are+essential+components+of+the+compensasome%2C+which+mediates+dosage+compensation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The rox1 and rox2 RNAs are essential components of the compensasome, which mediates dosage compensation in Drosophila.</a> Mol. Cell. 4, 117-122 (1999).</li>
<li>Gupta, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNA+HOTAIR+reprograms+chromatin+state+to+promote+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis.</a> Nature. 464, 1071-1076 (2010).</li>
<li>Tsai, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNA+as+modular+scaffold+of+histone+modification+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes.</a> Science. 329, 689-693 (2010).</li>
<li>Zappulla, D. C., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+as+a+flexible+scaffold+for+proteins%3A+yeast+telomerase+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol.%22%5BJournal%5D)">RNA as a flexible scaffold for proteins: yeast telomerase and beyond.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol.. 71, 217-224 (2006).</li>
<li>Nagano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Air+noncoding+RNA+epigenetically+silences+transcription+by+targeting+G9a+to+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Air noncoding RNA epigenetically silences transcription by targeting G9a to chromatin.</a> Science. 322, 1717-1720 (2008).</li>
<li>Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+chromatin+regulatory+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-range chromatin regulatory interactions in vivo.</a> Nature. 32, 623-626 (2002).</li>
<li>Chu, C., Qu, K., Zhong, F. L., Artandi, S. E., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Maps+of+Long+Noncoding+RNA+Occupancy+Reveal+Principles+of+RNA-Chromatin+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genomic Maps of Long Noncoding RNA Occupancy Reveal Principles of RNA-Chromatin Interactions.</a> Mol. Cell. , (2011).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).</li>
</ol>

C. Chu en HY Chang worden genoemd als uitvinders van een octrooiaanvraag op basis van deze methode.

Hier hebben we beschreven Chirp-seq, een methode in kaart brengen van in-vivo lncRNA bindingsplaatsen genoom-breed. De belangrijkste parameters voor succes zijn de splitsing poelen van tiling oligonucleotideprobes en glutaaraldehyde verknoping. Het ontwerp van affiniteit-probes is eenvoudig, gezien de RNA-sequentie en vereist geen voorkennis van de structuur van het RNA&#39;s of functionele domeinen. Ons succes met roX2, TERC en Hotair - drie in plaats van verschillende RNA&#39;s in twee soorten - suggereert dat Chirp-seq waarschijnlijk generaliseerbaar veel lncRNAs. Zoals met alle experimenten, zijn zorg en de juiste controles nodig zijn om de resultaten te interpreteren. Verschillende lncRNA kan titratie van omstandigheden en oordeelkundige verandering van omstandigheden, zoals selectie van verschillende affiniteit probes of verknopingsmiddelen vereisen, kunnen belichten verschillende aspecten van RNA-interacties chromatine. Net als ChIP-seq, niet alle bindende gebeurtenissen zijn noodzakelijkerwijs functioneel, en bijkomende studies nodig zijn om de biologische gevolgen van RNA-o vast te stellenccupancy op chromatine. Toch voorzien we vele interessante toepassingen van deze technologie voor onderzoekers van andere chromatine-geassocieerde lncRNAs, die nu in de duizenden 8,9. Net zoals ChIP-seq heeft de deur geopend voor genoom-brede verkenningen van DNA-eiwit interacties, kan Chirp-seq studies van de &quot;RNA interactoom&quot; onthullen vele nieuwe mogelijkheden van de biologie.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Bufferlijst:</td></tr><tr><td colspan="4">Los een pellet volledige protease-remmer op in 1 ml water als 50x stock. Maak 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in wordt gebruikt als 200x stock. Bewaar alles bij -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Lysisbuffer:</td></tr><tr><td colspan="4">50 mM Tris-Cl pH 7,0&lt;br/&gt;10 mM EDTA&lt;br/&gt;1% SDS&lt;br/&gt;Voeg PMSF, P.I. en Superase-in altijd vers toe voor gebruik, behalve bij het wassen van beads</td></tr><tr><td colspan="4">Proteinase K-buffer (voor DNA)</td></tr><tr><td colspan="4">100 mM NaCl&lt;br/&gt;10 mM TrisCl pH 8,0 (gebruik pH 7,0 voor RNA)&lt;br/&gt;1 mM EDTA&lt;br/&gt;0,5% SDS&lt;br/&gt;Voeg vers 5% volume Proteinase K (Ambion AM2546 20 mg/ml) toe voor gebruik</td></tr><tr><td colspan="4">Hybridisatiebuffer</td></tr><tr><td colspan="4">750 mM NaCl&lt;br/&gt;1% SDS&lt;br/&gt;50 mM Tris-Cl pH 7,0&lt;br/&gt;1 mM EDTA&lt;br/&gt;15% formamide (donker bewaren bij 4 &amp;deg;C)&lt;br/&gt;Voeg PMSF, P.I. en Superase-in altijd vers toe voor gebruik</td></tr><tr><td colspan="4">Wasbuffer</td></tr><tr><td colspan="4">2x NaCl en natriumcitraat (SSC) (verdund vanuit 20x SSC Invitrogen stock)&lt;br/&gt;0,5% SDS&lt;br/&gt;Voeg PMSF altijd vers toe voor gebruik</td></tr><tr><td colspan="4">DNA-elutiebuffer</td></tr><tr><td colspan="4">50 mM NaHCO3&lt;br/&gt;1% SDS</td></tr><tr><td colspan="4">Tabel met specifieke reagentia en apparatuur:</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde (EM-grade)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-10x10ml</td><td></td></tr><tr><td>Gemotoriseerde pelletmixer</td><td>VWR international</td><td>V8185-904</td><td></td></tr><tr><td>Protease-remmer</td><td>Roche Group</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Superase-in</td><td>Ambion</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?AM2696">AM2696&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td><td></td></tr><tr><td>Falcon-buisjes (voor sonicatie)</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>PCR-zuiveringskit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>C-1 magnetische beads</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-25G</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-15 magneet</td><td>Invitrogen</td><td>123-01D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 magneet</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>MIRNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Rnase H</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>R0601K</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy</td><td>5 PRIME</td><td>2302810</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:chloroform:isoamylalcohol</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Ricca</td><td>RSOC0020-1C</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>JT Baker</td><td>4057-06</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Invitrogen</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Elutiebuffer (EB)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Invitrogen</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15553-027</td><td></td></tr><tr><td>DNA-&lt;em&gt;vrij&lt;/em&gt;</td><td>Ambion</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>Bufferkit</td><td>Ambion</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Invitrogen</td><td>15515-026</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatine isolatie door rna-zuivering (chirp)

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Lang niet-coderende RNA&#39;s zijn belangrijke regulatoren van chromatine staten voor belangrijke biologische processen, zoals de dosering compensatie, imprinting, en ontwikkelingsstoornissen genexpressie 1,2,3,4,5,6,7. De recente ontdekking van duizenden lncRNAs in samenwerking met specifieke chromatine modificatie complexen, zoals Polycomb Repressieve Complex 2 (PRC2) die bemiddelt histon H3 lysine 27 trimethylering (H3K27me3), brede rollen voor tal van lncRNAs in het beheren van chromatine staten in een gen-specifieke suggereert mode 8,9. Terwijl sommige lncRNAs worden verondersteld om te werken in cis op naburige genen, andere lncRNAs werken in trans naar de verte gelegen genen reguleren. Bijvoorbeeld, Drosophila lncRNAs roX1 en roX2 binden tal van regio&#39;s op het X-chromosoom van mannelijke cellen, en zijn van cruciaal belang voor de dosering compensatie 10,11. Echter, de exacte locaties van hun bindingsplaatsen niet bekend met een hoge resolutie. Ook de menselijke lncRNA Hotair kan PRC2 bezetting van invloed zijn op hundreds van genen genoom-brede 3,12,13, maar hoe specificiteit wordt bereikt, is onduidelijk. LncRNAs kan ook dienen als modulaire steigers voor de samenstelling van verschillende eiwitcomplexen te werven. De klassieke trans-werkende RNA-steiger is de TERC RNA dat dient als de sjabloon en steiger voor het telomerase complex 14; Hotair kan ook dienen als een platform voor PRC2 en een H3K4 demethylase complex 13. Eerdere studies mapping RNA bezettingsgraad van chromatine gebleken aanzienlijke inzichten 15,16, maar alleen op een locus met genen voor een. De bezettingsgraad sites van de meeste lncRNAs zijn niet bekend, en de rollen van lncRNAs in chromatine verordening zijn vooral afgeleid uit de indirecte effecten van de lncRNA verstoring. Net zoals chromatine immunoprecipitatie gevolgd door middel van microarray of diep-sequencing (chip-chip of chip-seq, respectievelijk) is sterk ons ​​begrip van eiwit-DNA interacties op een genomische schaal verbeterd, hier hebben we illustreren een recentgevoerd gepubliceerde strategie op de lange RNA genoom-brede bezetting in kaart te brengen met een hoge resolutie 17. Deze methode, chromatine Isolatie van RNA-zuivering (Chirp) (figuur 1), is gebaseerd op affiniteit vangst van de beoogde lncRNA: chromatine complex door tegels antisense-oligo&#39;s, die vervolgens een kaart van genomische bindingsplaatsen genereert met een resolutie van enkele honderden bases met hoge gevoeligheid en weinig achtergrond. Chirp is voor vele lncRNAs omdat het ontwerp van affiniteit-probes is eenvoudig aangezien de RNA sequentie en vereist geen kennis van de structuur van de RNA of functionele domeinen.

Chirp is een nieuwe en snelle techniek om genomische bindingsplaatsen van niet-coderende RNA&#39;s lang (lncRNAs) in kaart te brengen. De methode maakt gebruik van de specificiteit van anti-sense oligonucleotiden tegels aan de lijst van lncRNA-gebonden genomische locaties mogelijk te maken.

Chromatine Isolatie door RNA-zuivering (Chirp)

Lange niet-coderende RNA's zijn sleutelregulatoren van chromatinetoestanden voor belangrijke biologische processen zoals dosiscompensatie, imprinting en ontwikkeling...

Het algemene doel van het volgende experiment is om DNA-regio's te bepalen die geassocieerd zijn met een specifiek niet-coderend RNA met behulp van QPCR of high-throughput sequencing. Dit wordt bereikt door cellen te crosslinken om native DNA-RNA-interacties in vivo vast te leggen. Als tweede stap worden de cellen gelyseerd en onderworpen aan sonicatie om het cellysaat te solubiliseren en het chromatine in kleine fragmenten te sheareren.Vervolgens worden gebiotinyleerde antisense-oligo's toegevoegd aan het cellysaat om specifiek te verrijken voor de R-N-A-D-N-A-complexen van belang; de resultaten die worden verkregen, verduidelijken de identiteit van genomische sites die gebonden zijn aan niet-coderend RNA op basis van qPCR of high-throughput sequencing. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals R-N-A-D-N-A FISH, is dat CHIRP genoombrede kaarten van bindingsplaatsen van niet-coderend RNA mogelijk maakt met een resolutie die bijna op basepaar-niveau ligt. Deze methode kan ons helpen cruciale vragen in het vakgebied van niet-coderend RNA te beantwoorden, zoals de manier waarop roX RNA's in mannelijke vliegen dosiscompensatie bewerkstelligen.De implicaties van deze techniek reiken tot therapieën voor ziekten gerelateerd aan niet-coderend RNA, omdat het een beter begrip mogelijk maakt van hoe niet-coderend RNA chromatinetoestanden en genexpressie reguleren. Voor dit experiment voor chromatine-isolatie door RNA-zuivering of chirp worden 40 miljoen cellen geoogst na centrifugatie; schenk het PBS af en verwijder de resterende vloeistof door voorzichtig onder een hoek te aspireren. Los de celpellet los door tegen de bodem van de falcon-buis te tikken. Voeg vers bereide 1% glutaraldehyde toe, beginnend met een klein volume, resuspendeer de celpellet, vul aan tot het volledige volume en keer de buis vervolgens om om te mengen. Crosslink gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een end-to-end shaker of rotator. Stop de crosslinking-reactie met één tiende volume 1,25 molair glycine en laat dit vijf minuten op een shaker bij kamertemperatuur staan; de cellen zullen feloranje kleuren.Centrifuge vervolgens 5 minuten bij 2000 RCF, schenk het supernatant af, aspireer dit en was het pellet met 20 milliliters gekoelde PBS. Centrifugeer opnieuw, aspireer het supernatant en resuspendeer het gewassen, gecrosslinkte pellet in gekoelde PBS. Transfer elke milliliter cellen naar een eppendorfbuis en centrifugeer 3 minuten bij 2000 RCF bij 4 °C. Verwijder na centrifugatie met een pipetpunt voorzichtig zoveel mogelijk PBS.Bevries alle celpellets snel in vloeibare stikstof en bewaar deze onbepaald bij -80 °C. Om cellysaat voor chirp voor te bereiden, ontdooi de bevroren gecrosslinkte celpellets bij kamertemperatuur. Tik stevig tegen het buisje om de celpellet los te maken en te mengen.Centrifugeer de pellets en gebruik een scherpe 10 µL pipetpunt om eventueel resterend PBS te verwijderen op een elektronische balans met een nauwkeurigheid van 1 mg. Noteer de massa van een lege eppendorfbuis. Weeg elke pellet en noteer het gewicht.Voeg 10 x het volume lysisbuffer, aangevuld met verse protease-remmer PMSF en super ace, toe aan elke buis en resuspendeer het pellet. Het cellysaat moet direct na bereiding worden gebruikt. Breng maximaal 1,5 milliliter lysaat over naar elke 15 milliliter Falcon-buis en plaats de sonicatieprobes door ze stevig aan te draaien.Plaats de buisjes vervolgens in een bio rupture en soniceer bij 4 °C op de hoogste stand met pulsintervallen van 30 seconden aan en 45 seconden uit. Controleer het lysaat elke 30 minuten. Ga door met soniceren totdat het cellysaat niet langer troebel is.Dit kan 30 minuten tot vier uur duren, afhankelijk van het aantal buisjes, het monstervolume, de badtemperatuur en de duur van de sonicatie. Wanneer het lysaat helder wordt, brengt u vijf µL over naar een nieuw eppendorfbuisje. Voeg DNA protease K-buffer en protease K toe, vortex om te mengen en centrifugeer kort; incubeer vervolgens 45 minuten bij 50 °C, waarna het DNA wordt geëxtraheerd met een PCR-zuiveringskit.Controleer de DNA-grootte op een 1% agarosegel. Het grootste deel van de DNA-smear moet tussen de 100 en 500 baseparen liggen, wat duidt op een volledige sonicatie. Centrifugeer aliquots van 1 ml van de gesoniceerde monsters bij 16.100 RCF gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, breng het supernatant over naar nieuwe eppendorf-buisjes en vries deze snel in met vloeibare stikstof om de procedure voor ChIRP te starten. Ontdooi de buisjes met chromatine bij kamertemperatuur voor een typisch ChIRP-monster.Gebruik één milliliter lysaat, neem 10 µL weg voor de RNA-input en 10 µL voor de DNA-input en plaats deze in einor-buisjes. Bewaar deze op ijs tot later gebruik. Breng één milliliter van elk chromatine-monster over naar een 15 ml Falcon-buis.Voeg twee milliliter hybridisatiebuffer toe aan elke buis. Ontdooi vervolgens de probes bij kamertemperatuur. Deze gebiotineerde tiling-oligos zijn gelabeld volgens hun posities langs het RNA en verdeeld over twee pools.De even pool bevat alle probes met even nummers. De odd pool bevat probes met oneven nummers. Alle experimenten worden uitgevoerd met beide pools, die als interne controles voor elkaar dienen.Een van de meest uitdagende aspecten van het eigenlijke protocol is dat alle hybridisatie- en wasstappen bij 37 °C moeten worden uitgevoerd. Om een consistente experimentele temperatuur te garanderen, dienen alle stappen in of nabij een incubatieoven te worden uitgevoerd. Voeg het juiste volume probes toe aan specifieke buisjes. Meng goed en incubeer gedurende vier uur bij 37 °C onder schudding, waarbij de incubatie 20 minuten voor het voltooien van de hybridisatie wordt gestopt.Bereid de C one magnetische korrels voor. Gebruik 100 µL per 100 pmol probes. Was drie keer met 1 mL niet-gesupplementeerde lysisbuffer, waarbij de Dyna mag two strip magneet wordt gebruikt om de korrels van de buffer te scheiden.Resuspendeer na de laatste wasbeurt de beads in het oorspronkelijke volume lysisbuffer en voeg verse PMSF en protease-remmer toe. Wanneer de hybridisatiereactie van vier uur is voltooid, voegt u 100 µL beads toe aan elke buis en mengt u dit. Incubeer 30 minuten bij 37 °C onder schudding; was de beads bij de eerste wasbeurt met 1 mL wasbuffer die is voorverwarmd tot 37 °C.Gebruik een DynaMag 15 magnetische strip om de kraaltjes te scheiden, schenk het supernatant af en resuspendeer in 1 ml wasbuffer, waarna het geheel wordt overgebracht naar een 1,5 ml EOR-buisje. Incubeer vijf minuten bij 37 °C onder schudding; herhaal dit voor de volgende wasstappen. Centrifugeer elk buisje kort in een minicentrifuge en plaats de monsters gedurende één minuut op een DynaMag 2 magnetische strip alvorens het monster af te gieten. Verwijder eventuele druppels met een Kimwipe en resuspendeer in 1 ml.Wasbuffer, incuberen bij 37 °C onder schudden gedurende vijf minuten. Herhaal dit voor in totaal vijf wasbeurten. Suspendeer de kraaltjes bij de laatste wasbeurt goed, neem 100 µL op en zet dit apart voor RNA-isolatie; reserveer 900 µL voor de DNA-fractie.Plaats alle buisjes op de dyna mag tube magnetische strip en verwijder de wasbuffer. Na een korte centrifugatie wordt het buisje opnieuw op de magnetische strip geplaatst, waarna met een scherpe 10 µL pipetpunt de resterende wasbuffer volledig uit elk buisje wordt verwijderd.RNA- en DNA-fracties worden vervolgens geïsoleerd uit de chirp-monsters voor kwantificering en sequencing. Deze figuur toont de verrijking van menselijk telomerase, RNA of Turk uit HELOC-cellen ten opzichte van GA dh. Een overvloedig cellulair RNA dat dient als negatieve controle.Het grootste deel van het Turk RNA dat in de cel aanwezig was, ongeveer 88%, werd neergeslagen door middel van chirp, terwijl slechts 0,46% van het GA DH RNA werd teruggewonnen, wat een verrijkingsfactor van ongeveer 200-voudig aantoont. Aspecifieke probes, zoals probes gericht op LAC ZRNA, dat normaal gesproken niet tot expressie komt in zoogdiercellen, kunnen als aanvullende negatieve controles worden gebruikt. DNA-regio's waarvan wordt verwacht dat ze aan het doelwit binden. Lange niet-coderende RNA's zijn doorgaans verrijkt ten opzichte van negatieve regio's wanneer ze via QPCR worden gemeten.Deze figuur toont de QPCR-validatie van vier hot air-bindingsplaatsen in primaire fibroblasten uit de menselijke voorhuid, bepaald door chirp SSE uit te voeren in dezelfde cellijn, waarbij Turk- en GA DH DNA-plaatsen dienen als negatieve controlegebieden. Zowel de even als de oneven probesets leverden een vergelijkbare verrijking op van de verwachte hot air-bindingsplaatsen ten opzichte van de negatieve gebieden. Dit is een kenmerk van echte bindingsplaatsen voor lncRNA (long non-coding RNA).Een wereldkaart van bindingsplaatsen voor lang niet-coderend RNA kan worden verkregen door middel van high-throughput sequencing van chirp-verrijkt DNA, zoals geïllustreerd door deze gegevens van het trla lang niet-coderend RNA Rocks two, waarvan bekend is dat het op een voor dosiskompensatie vereiste wijze interageert met het X-chromosoom. Zowel even als oneven monsters werden afzonderlijk gesequenced en hun unieke ruis werd geëlimineerd om een track van overlappende signalen te produceren, waarbij elke piek een sterke bindingsplaats van rocks two aangeeft. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een correcte RNase-vrije techniek toe te passen. Volg deze procedure.Andere methoden, zoals protein dot blotting, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke eiwitten interageren met het niet-klinische DRNA van belang na de ontwikkeling ervan. CHI plaveide de weg voor onderzoekers in het veld van de RNA-biologie om het RNA-act in kweekcellen en gefixeerde weefsels in kaart te brengen.

chromatin-isolation-by-rna-purification-chirp

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier presenteren we een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) procedure voor genoom-brede locatie analyse van eiwit-isovormen die verschillen in een histon-bindend domein. We zijn toe te passen op ChIP-Seq analyse om de doelstellingen van het KDM5A/JARID1A/RBP2 histon demethylase te identificeren.

Genoom-brede analyse met behulp van chip Isoform-specifieke Gene targets te identificeren

Chromatine Interactie Analyse door Gekoppeld-End Tag Sequencing (Chia-PET) is een methode...

Chromatine Interactie Analyse met gepaarde-End Tag Sequencing (Chia-PET) voor het in kaart brengen van chromatine Interacties en begrijpen Transcriptie Verordening

We beschrijven een robuuste methode voor het chromatine immunoprecipitatie met primaire T-cellen. De methode is gebaseerd op standaard methoden, maar gebruikt een specifieke set van omstandigheden en reagentia die de efficiëntie van een beperkte hoeveelheid cellen verbeteren. Belangrijk is een gedetailleerde beschrijving van de data analysefase gepresenteerd.

Efficiënte Chromatine immunoprecipitatie behulp Beperking hoeveelheden biomassa

De combinatie van chromatine immunoprecipitatie en ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) kan identificeren en in kaart eiwit-DNA-interacties in een bepaald weefsel of cellijn. Geschetst is hoe je een hoge kwaliteit ChIP sjabloon voor de daaropvolgende sequencing, met ervaring met de transcriptiefactor TCF7L2 als een voorbeeld te genereren.

Generatie van hoge kwaliteit Chromatine immunoprecipitatie DNA Template voor High-throughput sequencing (ChIP-seq)

Door de combinatie van inheemse en verknopen van chromatine immunoprecipitatie met een hoge-resolutie massaspectrometrie, ChroP benadering stelt aan de samengestelde proteomics architectuur van histonmodificaties, varianten en niet-histonic eiwitten synergizing op functioneel verschillende chromatinedomeinen ontleden.

De ChroP aanpak combineert chip en massaspectrometrie te ontleden Locus-specifieke Proteomic Landschappen van Chromatin

De identificatie van moleculen die geassocieerd zijn met specifieke genomische regio's van belang is vereist om de mechanismen van regulatie van de functies van deze regio's te begrijpen. Dit protocol beschrijft procedures om geëngineerde DNA-bindende molecuul-gemedieerde chromatine immunoprecipitatie (enChIP) uit te voeren voor de identificatie van eiwitten en RNA's die geassocieerd zijn met een specifiek genoomgebied.

Isolatie van specifieke genomische regio en identificatie van geassocieerde moleculen door enChIP

Hier beschrijven we een chromatine immunoprecipitation (ChIP) en ChIP-seq de protocol van de voorbereiding van de bibliotheek voor het genereren van wereldwijde epigenomic profielen van lage-overvloed kip embryonale monsters.

Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) Protocol voor lage-overvloed embryonale monsters

We beschrijven een stapsgewijze protocol voor tandem chromatine immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) waarmee de analyse van cel-type-specifieke genoom-brede Histon wijziging.

TChIP-Seq: Cell-Type-specifieke Epigenome profilering

Dit protocol richt zich op chromatinepreparatie uit snap bevroren weefsels en is geschikt voor Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) gevolgd door kwantitatieve PCR-analyse (X-ChIP-qPCR) of next generation sequencing-benaderingen (X-ChIP-seq).

Chromatine-extractie uit bevroren chimere leverweefsel voor chromatine-immunoprecipitatieanalyse

Hier presenteren we een protocol om RNA-geassocieerde chromatine DNA-DNA interacties vast te leggen voor het in kaart brengen van RNA-gerelateerde driedimensionale genoomorganisatie.

RNA-geassocieerde chromatine DNA-DNA interactie methode

Leer de ChIRP-methode om DNA-regio's te identificeren die geassocieerd zijn met lange niet-coderende RNA's. Deze techniek biedt genoombrede kaarten met hoge resolutie voor onderzoek naar chromatindynamica.

Chromatine Isolatie door RNA-zuivering (Chirp)

Meer video's verkennen