Chromatine Isolatie door RNA-zuivering (Chirp)

Het algemene doel van het volgende experiment is om DNA-regio's te bepalen die geassocieerd zijn met een specifiek niet-coderend RNA met behulp van QPCR of high-throughput sequencing. Dit wordt bereikt door cellen te crosslinken om native DNA-RNA-interacties in vivo vast te leggen. Als tweede stap worden de cellen gelyseerd en onderworpen aan sonicatie om het cellysaat te solubiliseren en het chromatine in kleine fragmenten te sheareren.

Vervolgens worden gebiotinyleerde antisense-oligo's toegevoegd aan het cellysaat om specifiek te verrijken voor de R-N-A-D-N-A-complexen van belang; de resultaten die worden verkregen, verduidelijken de identiteit van genomische sites die gebonden zijn aan niet-coderend RNA op basis van qPCR of high-throughput sequencing. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals R-N-A-D-N-A FISH, is dat CHIRP genoombrede kaarten van bindingsplaatsen van niet-coderend RNA mogelijk maakt met een resolutie die bijna op basepaar-niveau ligt. Deze methode kan ons helpen cruciale vragen in het vakgebied van niet-coderend RNA te beantwoorden, zoals de manier waarop roX RNA's in mannelijke vliegen dosiscompensatie bewerkstelligen.

De implicaties van deze techniek reiken tot therapieën voor ziekten gerelateerd aan niet-coderend RNA, omdat het een beter begrip mogelijk maakt van hoe niet-coderend RNA chromatinetoestanden en genexpressie reguleren. Voor dit experiment voor chromatine-isolatie door RNA-zuivering of chirp worden 40 miljoen cellen geoogst na centrifugatie; schenk het PBS af en verwijder de resterende vloeistof door voorzichtig onder een hoek te aspireren. Los de celpellet los door tegen de bodem van de falcon-buis te tikken. Voeg vers bereide 1% glutaraldehyde toe, beginnend met een klein volume, resuspendeer de celpellet, vul aan tot het volledige volume en keer de buis vervolgens om om te mengen. Crosslink gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een end-to-end shaker of rotator. Stop de crosslinking-reactie met één tiende volume 1,25 molair glycine en laat dit vijf minuten op een shaker bij kamertemperatuur staan; de cellen zullen feloranje kleuren.

Centrifuge vervolgens 5 minuten bij 2000 RCF, schenk het supernatant af, aspireer dit en was het pellet met 20 milliliters gekoelde PBS. Centrifugeer opnieuw, aspireer het supernatant en resuspendeer het gewassen, gecrosslinkte pellet in gekoelde PBS. Transfer elke milliliter cellen naar een eppendorfbuis en centrifugeer 3 minuten bij 2000 RCF bij 4 °C. Verwijder na centrifugatie met een pipetpunt voorzichtig zoveel mogelijk PBS.

Bevries alle celpellets snel in vloeibare stikstof en bewaar deze onbepaald bij -80 °C. Om cellysaat voor chirp voor te bereiden, ontdooi de bevroren gecrosslinkte celpellets bij kamertemperatuur. Tik stevig tegen het buisje om de celpellet los te maken en te mengen.

Centrifugeer de pellets en gebruik een scherpe 10 µL pipetpunt om eventueel resterend PBS te verwijderen op een elektronische balans met een nauwkeurigheid van 1 mg. Noteer de massa van een lege eppendorfbuis. Weeg elke pellet en noteer het gewicht.

Voeg 10 x het volume lysisbuffer, aangevuld met verse protease-remmer PMSF en super ace, toe aan elke buis en resuspendeer het pellet. Het cellysaat moet direct na bereiding worden gebruikt. Breng maximaal 1,5 milliliter lysaat over naar elke 15 milliliter Falcon-buis en plaats de sonicatieprobes door ze stevig aan te draaien.

Plaats de buisjes vervolgens in een bio rupture en soniceer bij 4 °C op de hoogste stand met pulsintervallen van 30 seconden aan en 45 seconden uit. Controleer het lysaat elke 30 minuten. Ga door met soniceren totdat het cellysaat niet langer troebel is.

Dit kan 30 minuten tot vier uur duren, afhankelijk van het aantal buisjes, het monstervolume, de badtemperatuur en de duur van de sonicatie. Wanneer het lysaat helder wordt, brengt u vijf µL over naar een nieuw eppendorfbuisje. Voeg DNA protease K-buffer en protease K toe, vortex om te mengen en centrifugeer kort; incubeer vervolgens 45 minuten bij 50 °C, waarna het DNA wordt geëxtraheerd met een PCR-zuiveringskit.

Controleer de DNA-grootte op een 1% agarosegel. Het grootste deel van de DNA-smear moet tussen de 100 en 500 baseparen liggen, wat duidt op een volledige sonicatie. Centrifugeer aliquots van 1 ml van de gesoniceerde monsters bij 16.100 RCF gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, breng het supernatant over naar nieuwe eppendorf-buisjes en vries deze snel in met vloeibare stikstof om de procedure voor ChIRP te starten. Ontdooi de buisjes met chromatine bij kamertemperatuur voor een typisch ChIRP-monster.

Gebruik één milliliter lysaat, neem 10 µL weg voor de RNA-input en 10 µL voor de DNA-input en plaats deze in einor-buisjes. Bewaar deze op ijs tot later gebruik. Breng één milliliter van elk chromatine-monster over naar een 15 ml Falcon-buis.

Voeg twee milliliter hybridisatiebuffer toe aan elke buis. Ontdooi vervolgens de probes bij kamertemperatuur. Deze gebiotineerde tiling-oligos zijn gelabeld volgens hun posities langs het RNA en verdeeld over twee pools.

De even pool bevat alle probes met even nummers. De odd pool bevat probes met oneven nummers. Alle experimenten worden uitgevoerd met beide pools, die als interne controles voor elkaar dienen.

Een van de meest uitdagende aspecten van het eigenlijke protocol is dat alle hybridisatie- en wasstappen bij 37 °C moeten worden uitgevoerd. Om een consistente experimentele temperatuur te garanderen, dienen alle stappen in of nabij een incubatieoven te worden uitgevoerd. Voeg het juiste volume probes toe aan specifieke buisjes. Meng goed en incubeer gedurende vier uur bij 37 °C onder schudding, waarbij de incubatie 20 minuten voor het voltooien van de hybridisatie wordt gestopt.

Bereid de C one magnetische korrels voor. Gebruik 100 µL per 100 pmol probes. Was drie keer met 1 mL niet-gesupplementeerde lysisbuffer, waarbij de Dyna mag two strip magneet wordt gebruikt om de korrels van de buffer te scheiden.

Resuspendeer na de laatste wasbeurt de beads in het oorspronkelijke volume lysisbuffer en voeg verse PMSF en protease-remmer toe. Wanneer de hybridisatiereactie van vier uur is voltooid, voegt u 100 µL beads toe aan elke buis en mengt u dit. Incubeer 30 minuten bij 37 °C onder schudding; was de beads bij de eerste wasbeurt met 1 mL wasbuffer die is voorverwarmd tot 37 °C.

Gebruik een DynaMag 15 magnetische strip om de kraaltjes te scheiden, schenk het supernatant af en resuspendeer in 1 ml wasbuffer, waarna het geheel wordt overgebracht naar een 1,5 ml EOR-buisje. Incubeer vijf minuten bij 37 °C onder schudding; herhaal dit voor de volgende wasstappen. Centrifugeer elk buisje kort in een minicentrifuge en plaats de monsters gedurende één minuut op een DynaMag 2 magnetische strip alvorens het monster af te gieten. Verwijder eventuele druppels met een Kimwipe en resuspendeer in 1 ml.

Wasbuffer, incuberen bij 37 °C onder schudden gedurende vijf minuten. Herhaal dit voor in totaal vijf wasbeurten. Suspendeer de kraaltjes bij de laatste wasbeurt goed, neem 100 µL op en zet dit apart voor RNA-isolatie; reserveer 900 µL voor de DNA-fractie.

Plaats alle buisjes op de dyna mag tube magnetische strip en verwijder de wasbuffer. Na een korte centrifugatie wordt het buisje opnieuw op de magnetische strip geplaatst, waarna met een scherpe 10 µL pipetpunt de resterende wasbuffer volledig uit elk buisje wordt verwijderd.

RNA- en DNA-fracties worden vervolgens geïsoleerd uit de chirp-monsters voor kwantificering en sequencing. Deze figuur toont de verrijking van menselijk telomerase, RNA of Turk uit HELOC-cellen ten opzichte van GA dh. Een overvloedig cellulair RNA dat dient als negatieve controle.

Het grootste deel van het Turk RNA dat in de cel aanwezig was, ongeveer 88%, werd neergeslagen door middel van chirp, terwijl slechts 0,46% van het GA DH RNA werd teruggewonnen, wat een verrijkingsfactor van ongeveer 200-voudig aantoont. Aspecifieke probes, zoals probes gericht op LAC ZRNA, dat normaal gesproken niet tot expressie komt in zoogdiercellen, kunnen als aanvullende negatieve controles worden gebruikt. DNA-regio's waarvan wordt verwacht dat ze aan het doelwit binden. Lange niet-coderende RNA's zijn doorgaans verrijkt ten opzichte van negatieve regio's wanneer ze via QPCR worden gemeten.

Deze figuur toont de QPCR-validatie van vier hot air-bindingsplaatsen in primaire fibroblasten uit de menselijke voorhuid, bepaald door chirp SSE uit te voeren in dezelfde cellijn, waarbij Turk- en GA DH DNA-plaatsen dienen als negatieve controlegebieden. Zowel de even als de oneven probesets leverden een vergelijkbare verrijking op van de verwachte hot air-bindingsplaatsen ten opzichte van de negatieve gebieden. Dit is een kenmerk van echte bindingsplaatsen voor lncRNA (long non-coding RNA).

Een wereldkaart van bindingsplaatsen voor lang niet-coderend RNA kan worden verkregen door middel van high-throughput sequencing van chirp-verrijkt DNA, zoals geïllustreerd door deze gegevens van het trla lang niet-coderend RNA Rocks two, waarvan bekend is dat het op een voor dosiskompensatie vereiste wijze interageert met het X-chromosoom. Zowel even als oneven monsters werden afzonderlijk gesequenced en hun unieke ruis werd geëlimineerd om een track van overlappende signalen te produceren, waarbij elke piek een sterke bindingsplaats van rocks two aangeeft. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een correcte RNase-vrije techniek toe te passen. Volg deze procedure.

Andere methoden, zoals protein dot blotting, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke eiwitten interageren met het niet-klinische DRNA van belang na de ontwikkeling ervan. CHI plaveide de weg voor onderzoekers in het veld van de RNA-biologie om het RNA-act in kweekcellen en gefixeerde weefsels in kaart te brengen.