Name: Bioluminescentie beeldvorming van NADPH-oxidase activiteit in verschillende diermodellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Leer een minimaal invasieve methode voor real-time monitoring van NADPH-oxidase-afgeleide ROS in levende muizen. Deze techniek wordt toegepast in drie inflammatoire muismodellen om ROS-dynamiek in vivo te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door NIH RO1 AI079253 en Department of Veterans Affairs.

1. Diermodellen <ol><li> Muizen: Gebruik p47 phox / - muizen en leeftijd en geslacht gematchte C57BL6/DBA muizen. Goedkeuring verkrijgen voor experimenten van Institutionele Animal Care en gebruik Comite. </li><li> Anesthesie: Gebruik een continue isofluraan administratie systeem is om anesthesie te induceren. De verdamper-systeem (VetEquip) is gevuld met isofluraan (2-3%). Bevestig dat muizen volledig verdoofd door het observeren van de ademhaling, beweging en cornea reflex als reactie op externe prikkels. </li><li> Chirurgische ingrepen: Schrob de chirurgische gebied (tafelmodel) met 70% ethanol. Draag steriele handschoenen en een schone chirurgische toga en masker. Bereid de muizen door het knippen van de haren en de toepassing betadine afgewisseld met 70% ethanol om het gebied waar de incisie wordt gemaakt. Voer een operatie op een steriel oppervlak en het gebruik van steriele instrumenten. Monitor muizen post-operatief tot wakker en vrij bewegen. </li><li> Intratracheale zymosan administratie <ol><li> Dien anesthesiezoals beschreven in 1.2. </li><li> Desinfecteer chirurgische gebied (nek) met betadine en 70% ethanol en bloot de luchtpijp door chirurgische dissectie. </li><li> Pierce trachea met een 27-gauge naald en injecteer zymosan (St. Louis, MO) in een dosis van 1 ug / g met een 0,5 ug / ul oplossing (totaal volume 50 ui voor een 25 g muis) opgelost in steriele PBS. </li><li> Sluiten muizen nek gewikkeld met 5-0 steriele zijden hechtdraden onder aseptische omstandigheden. </li><li> Afbeelding na 4 uur en 24 uur. </li></ol></li><li> Cecal ligatie en punctie <ol><li> Dien anesthesie, zoals beschreven in 1.2. </li><li> Clip haar in het operatiegebied (buik) en desinfecteren met betadine en 70% ethanol. </li><li> Voer een middellijn laparotomie en identificeren van de blindedarm. </li><li> Ligeren van het distale 50% van de blootgestelde blindedarm met 4-0 zijden hechtdraad en punctie blindedarm distaal van de ligatie met een passage van een 21-gauge naald. </li><li> Sluit de incisie met 4-0 steriele zijde hechtingen. </li><li> Afbeelding na 4 uur en24 hr. </li></ol></li><li> Orale tetrachloorkoolstof (CCl 4) administratie <ol><li> Dien anesthesie, zoals beschreven in 1.2. </li><li> Dien CCl4 (2 ug / g, St. Louis, MO) opgelost in maïsolie met orale sondevoeding. De procedure van CCl4 toediening moet worden uitgevoerd in een aangewezen gebied in overeenstemming met de IBC / EHS-beleid. </li><li> Afbeelding na 4 uur en 24 uur. </li></ol></li></ol> 2. Het verwerven van een Bioluminescent Afbeelding <ol><li> Initialiseer de IVIS 200 (Xenogen Corporation, Alameda, Californië) Imaging System, ingesteld op luminescentie-modus, en wacht tot de charge-coupled device (CCD) temperatuur te vergrendelen. </li><li> Selecteer belichtingstijd, binning (gemiddeld) en F / Stop (8) instellingen. </li><li> Place muizen in rugligging in de beeldkamer op een verwarmde stadium normale lichaamstemperatuur. Dien anesthesie, zoals beschreven in 1.2 via neuskegel, terwijl muizen zijn in de IVIS beeldvorming kamer. </li><li> Dien L-012<html> (20 ug / g) opgelost in steriel PBS (10 ug / ul) intraveneus via retro-orbitale injectie op elk tijdstip geselecteerd voor imaging. </li><li> Fotograferen begint bij 2 min na injectie L-012. Wij gebruiken meestal een 40 sec belichting. </li></ol> 3. Data-analyse met behulp van Region of Interest <ol><li> Analyseer gegevens met behulp van Living Image software V.4.2 (Xenogen Corporation, Alameda, CA). </li><li> Open een afbeelding en selecteer het meten van Region of Interest tools. </li><li> Selecteer het gebied van belang vorm en grootte op de borst en / of buik na overlay een pseudo-gekleurde digitaal beeld (vertegenwoordiger van foton detectie) over een fotografisch beeld van de muis. </li><li> Kwantificeren signaalintensiteit (foton flux) van het gebied van belang. </li></ol> 4. Statistische gegevens <ol><li> Gebruik statistische analyse software pakket om twee-weg ANOVA uit te voeren met Bonferroni post-test op sommige tijdstippen. </li></ol>TLE &quot;&gt; 5. Representatieve resultaten Zymosan is een pro-inflammatoire gistschillen product en een krachtige activator van NADPH oxidase 3. We toonden eerder aan dat intratracheale zymosan induceert een sterkere neutrofiele longontsteking en pro-inflammatoire cytokine productie p47 phox / - in vergelijking met wildtype muizen 1. Hier, ons doel was om ROS generatie vergelijken in de longen van wildtype en p47 phox / - muizen na zymosan uitdaging. Op 4 uur na zymosan intratracheale toediening we een aanzienlijke toename in fotonemissie op de borst in wildtype muizen vergeleken met de uitgangswaarde en een toename van fotonemissie in wildtype p47 vergeleken met phox / - muizen 4 uur en 24 uur. Daarentegen bioluminescentie signalen in p47 phox / - muizen bleven uitgangswaarden na 4 uur na zymosan behandeling (Fig.1 AB). Zo NADPH oxidase lijkt be de belangrijkste bron van ROS generatie in de longen na zymosan administratie. Vervolgens hebben we onderzocht ROS productie in de CLP-geïnduceerde sepsis model. Sepsis is een levensbedreigende syndroom geassocieerd met eind-orgaan schade, met inbegrip van acute longbeschadiging (ALI) en acute respiratory distress syndrome (ARDS) 4, 5. ROS-gemedieerde schade is beschouwd als een belangrijke factor sepsis geïnduceerde meervoudig orgaanfalen zijn. We vonden dat ROS significant verhoogd op de borst (4 uur) en de buik (24 uur) na CLP in wildtype muizen vergeleken met de uitgangswaarde. Echter ROS levels in p47 phox / - muizen waren vergelijkbaar met de uitgangswaarden op beide tijdstippen (Fig.2 AC). Deze resultaten laten zien dat ROS productie in de CLP geïnduceerde sepsis muismodel NADPH oxidase-afhankelijk. Ten slotte hebben we gebruikt bioluminescente beeldvorming de productie van ROS te detecteren in een CCl 4-geïnduceerde leverbeschadiging modusl. CCl4 veroorzaakt hepatocellulaire necrose, en is gebruikt om zowel acute leverbeschadiging en leverfibrose 6 model. In tegenstelling tot de eerder beschreven modellen voor ontsteking en schade, vonden we dat ROS productie in de buik bescheiden was (ongeveer 35%) ten opzichte van baseline in p47 phox / - muizen 4 uur na toediening CCl4. De omvang van CCl4 geïnduceerde ROS productie significant groter in wildtype muizen dan in p47 phox / - muizen (Fig.3 AB). Deze gegevens suggereren dat zowel p47 phox bevattende NADPH oxidase-afhankelijke en-onafhankelijke ROS productie optreden in acute CCl4 geïnduceerde leverbeschadiging. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3925/3925fig1.jpg" /> Figuur 1. ROS productie in longen na zymosan behandeling. A) Vertegenwoordiger bioluminescence beeldvorming van ROS productie. Merk op dat naast de borst, luminescentie detecteerbaar over de buik in wildtype en p47-phox / - muizen en abdominale luminescentie onveranderd door zymosan behandeling. B) foton tellen vanaf de borst van wildtype en p47 phox / - muizen na een enkele intratracheale (IT) injectie van zymosan. Bioluminescentie beeldvorming werd uitgevoerd bij aanvang, 4 uur, en 24 uur. Lichtemissie van het gebied van belang op de borst werd geïdentificeerd met de aangegeven pseudo-kleurschaal. De resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde ± SE, n = 6 tot 9 per groep, * = p &lt;0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3925/3925fig2.jpg" /> Figuur 2. ROS detectie na CLP. A) Vertegenwoordiger bioluminescentie beeldvorming van ROS productie, B) Foton telt van de borst, en C) foton telt uit de buik van wildtype en p47 phox / - muizen bij aanvang, 4 uur, en 24 uur na de CLP. Resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde ± SE, n = 4-5 per groep, * = p &lt;0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig2large.jpg" target="_blank">hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3925/3925fig3.jpg" /> Figuur 3. ROS productie in de buik na CCl 4-geïnduceerde leverbeschadiging. A) Vertegenwoordiger bioluminescentie beeldvorming van ROS productie en B) foton tellen vanaf de buik van wildtype en p47 phox / - muizen bij aanvang, 4 uur, en 24 uur na de orale CCl 4 behandeling. Resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde ± SE;. N = 4-5 per groep, * = p &lt;0,05 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere afbeelding</a> </a&gt;.

<ol><li>Segal, B., Han, W., Bushey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+limits+innate+immune+response+in+the+lungs+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase limits innate immune response in the lungs in mice.</a> PLoS ONE. 5, e9631(2010).</li>
<li>Jackson, S., Gallin, J., Holland, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p47phox+mouse+knock-out+model+of+chronic+granulomatous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The p47phox mouse knock-out model of chronic granulomatous disease.</a> J. Exp. Med. 182, 751-758 (1995).</li>
<li>Gantner, B. N., Simmons, R. M., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+induction+of+inflammatory+responses+by+dectin-1+and+Toll-like+receptor+2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Collaborative induction of inflammatory responses by dectin-1 and Toll-like receptor 2.</a> J. Exp. Med. 197, 1107-1117 (2003).</li>
<li>Dejager, L., Pinheiro, I., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cecal+ligation+and+puncture%3A+the+gold+standard+model+for+polymicrobial+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis.</a> Trends Microbiol. 19, 198-208 (2011).</li>
<li>Tsiotou, A. G., Sakorafas, G. H., Bramis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septic+shock%3B+current+pathogenetic+concepts+from+a+clinical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+Monit%22%5BJournal%5D)">Septic shock; current pathogenetic concepts from a clinical perspective.</a> Med. Sci. Monit. 11, 76-85 (2005).</li>
<li>Fujii, T., Fuchs, B. C., Tanabe, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+carbon+tetrachloride+induced+liver+fibrosis%3A+Histopathological+changes+and+expression+of+CD133+and+epidermal+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mouse model of carbon tetrachloride induced liver fibrosis: Histopathological changes and expression of CD133 and epidermal growth factor.</a> BMC Gastroenterology. 10, 79-90 (2010).</li>
<li>Kubo, H., Morgensterm, D., Doerschuk, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+complement-induced+lung+injury+in+mice+with+deficiency+of+NADPH+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Preservation of complement-induced lung injury in mice with deficiency of NADPH oxidase.</a> J. Clin. Invest. 97, 2680-2684 (1996).</li>
<li>Segal, B., Sakamoto, N., Bulkley, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xanthine+oxidase+contributes+to+host+defense+against+Burkholderia+cepacia+in+the+p47%28phox-%2F-%29+mouse+model+of+chronic+granulomatous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Xanthine oxidase contributes to host defense against Burkholderia cepacia in the p47(phox-/-) mouse model of chronic granulomatous disease.</a> Infect Immun. 68, 2374-2378 (2000).</li>
<li>Droge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+in+the+physiological+control+of+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Free radicals in the physiological control of cell function.</a> Physiological reviews. 82, 47-95 (2002).</li>
<li>Jones, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radical-free+biology+of+oxidative+stress.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Radical-free biology of oxidative stress. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 295, C849-C868 (2008).</li>
<li>Hubbard, W. J., Choudhry, M., Chaudry, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cecal+ligation+and+puncture%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Cecal ligation and puncture.</a> Shock. 24, 52-57 Forthcoming.</li>
<li>Wardman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+and+luminescent+probes+for+measurement+of+oxidative+and+nitrosative+species+in+cells+and+tissues%3A+progress%2C+pitfalls%2C+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosative species in cells and tissues: progress, pitfalls, and prospects.</a> Free Radic. Biol. Med. 43, 995-1022 (2007).</li>
<li>Pollock, J. D., Williams, D. A., Gifford, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+X-linked+chronic+granulomatous+disease%2C+an+inherited+defect+in+phagocyte+superoxide+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mouse model of X-linked chronic granulomatous disease, an inherited defect in phagocyte superoxide production.</a> Nat. Genet. 9, 202-209 (1995).</li>
<li>Aramaki, Y., Y,, Yoshida, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+sensitive+chemiluminescence+probe%2C+L-012%2C+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 554-559 (1993).</li>
<li>Daiber, A., Oelze, M., August, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+superoxide+and+peroxynitrite+in+model+systems+and+mitochondria+by+the+luminol+analogue+L-012%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012.</a> Free Radic. Res. 38, 259-269 (2004).</li>
<li>Kielland, A., Blom, T., Nandakumar, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+inflammation+using+the+luminescent+probe+L-012%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012.</a> Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

&quot;Real-time&quot; meting van reactieve zuurstof species (ROS) in levende dieren kan worden bereikt door gebruik van fluorescerende en chemiluminescerende probes. Terwijl fluorescerende probes last hebben van zwak signaal-ruisverhoudingen 12, de beschreven beeldvormende techniek is gevoelig voor detectie van lichtemissie na een chemische reactie van ROS met luminol gebaseerde ondergrond L-012. Zoals alle bioluminescent beeldvormingstechnieken, is deze werkwijze beperkt door golflengte afhankelijke licht ab...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> L-012 </td><td> Wako Chemicals USA, Inc </td><td> 120-04.891 </td><td></td></tr><tr><td> Zymosan </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> Z4250 </td><td></td></tr><tr><td> tetrachloorkoolstof </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> 289116 </td><td></td></tr></tbody></table>

bioluminescentie beeldvorming van nadph-oxidase activiteit in verschillende diermodellen

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

NADPH oxidase is een essentieel enzym dat antibacteriële en antifungale afweer medieert. Naast zijn rol in antimicrobiële afweer, NADPH oxidase verregaande signaalfuncties dat de ontstekingsreactie 1 moduleren. Aldus wordt de ontwikkeling van een meetmethode in &quot;real-time&quot; de kinetiek van NADPH oxidase afgeleide ROS productie verwacht een waardevol onderzoeksinstrument mechanismen relevant defensie, ontsteking en schade gastheer begrijpen. Chronische granulomateuze ziekte (CGD) is een erfelijke aandoening van het NADPH oxidase gekenmerkt door ernstige infecties en overmatige ontsteking. Activering van de fagocyt NADPH oxidase heeft translocatie van de cytosolische subeenheden (p47 phox, p67 phox en p40 phox) en Rac een membraangebonden flavocytochrome (bestaande uit een Gp91 phox en p22 heterodimeer phox). Verliesvan functie mutaties in een van deze NADPH oxidase componenten resulteren in CGD. Vergelijkbaar met patiënten met CGD, Gp91 phox deficiënte muizen en p47 phox deficiënte muizen defect fagocyt NADPH oxidase activiteit en verminderde afweer 13, 14. Naast fagocyten die de NADPH oxidase bovenbeschreven componenten bevatten, een verscheidenheid aan andere celtypen expressie verschillende isovormen van NADPH oxidase. Hier beschrijven we een werkwijze voor ROS productie kwantificeren levende muizen en de bijdrage van NADPH oxidase van ROS productie in modellen voor ontsteking en schade bakenen. Deze methode is gebaseerd op ROS reactie met L-012 (een analoog van luminol) om luminescentie die wordt geregistreerd door een charge-coupled device (CCD) uitstoten. In de oorspronkelijke beschrijving van de L-012 probe, werd L-012-afhankelijke chemiluminescentie afgeschaft door superoxide dismutase, wat aangeeft dat de voornaamste ROS gedetecteerd in deze reactie was superoxide anion 15. Latere studies hebben aangetoond dat L-012 kunnen andere vrije radicalen, inclusief reactieve stikstofverbindingen 16, 17 detecteren. Kielland et al. 17. Aangetoond dat topicale toediening van forbolmyristaatacetaat, een potente activator van NADPH oxidase, tot oxidase-afhankelijke ROS generatie die kon worden gedetecteerd in muizen met de luminescerende probe L-012 NADPH. In dit model toonden ze aan dat L-012-afhankelijke luminescentie werd afgeschaft phox p47 deficiënte muizen. We vergeleken ROS productie in wildtype muizen en NADPH oxidase-deficiënte p47 phox / - muizen 2 in de volgende drie modellen: 1) intratracheale toediening van zymosan, een pro-inflammatoire schimmelcelwand afgeleid product dat NADPH oxidase kan activeren, 2) cecal ligatie en punctie (CLP), een model van intra-abdominale sepsis met secundaire acute longontsteking en de schade, en 3) orale tetrachloorkoolstof(CCl 4), een model van ROS-afhankelijke leverschade. Deze modellen zijn speciaal geselecteerd om NADPH oxidase-afhankelijke ROS productie evalueren in de context van niet-infectieuze ontsteking, sepsis polymicrobiële en toxine-geïnduceerde orgaanschade respectievelijk. Vergelijking bioluminescentie in wildtype muizen p47 phox / - muizen kunnen we bakenen de specifieke bijdrage van ROS gegenereerd door p47 phox bevattende NADPH oxidase de bioluminescent signaal in deze modellen. Bioluminescentie resultaten die verhoogde niveaus ROS in wildtype muizen aangetoond vergeleken met p47 phox / - muizen aan dat NADPH oxidase is de belangrijkste bron van ROS productie in reactie op inflammatoire stimuli. Deze methode biedt een minimaal invasieve benadering voor &quot;real-time&quot; monitoring van ROS generatie tijdens ontsteking in vivo.

NADPH oxidase is de belangrijkste bron van reactieve zuurstof species (ROS) in fagocyten. Vanwege de vluchtigheid van ROS is moeilijk te meten en te controleren ROS levels in levende dieren. Een minimaal invasieve methode voor seriële kwantificering van ROS in levende muizen beschreven.

Bioluminescentie beeldvorming van NADPH-oxidase activiteit in verschillende diermodellen

NADPH-oxidase is een cruciaal enzym dat de antibacteriële en antifungale afweer van de gastheer medieert. Naast zijn rol in de antimicrobiële gastheerafweer, [speelt] NADPH ...

Het algemene doel van deze procedure is om een minimaal invasieve benadering te bieden voor real-time monitoring van de generatie van reactieve zuurstofsoorten of ROS, afgeleid van N-A-D-P-H-oxidase, in drie verschillende inflammatoire muismodellen. Het eerste model is intratracheale toediening van Xan, waarbij het pro-inflammatoire molecuul Xan in de trachea van geanestheseerde muizen wordt geïnjecteerd. Xan is een product afgeleid van de schimmelcelwand dat N-A-D-P-H-oxidase kan activeren.Het tweede model is een ligatie en punctie of CLP. Hierbij wordt de buikholte van de muis geopend en wordt het caecum afgebonden met een zijden hechtdraad, waarna het met een naald wordt gepuncteerd om intra-abdominale sepsis en secundaire acute longontsteking en -beschadiging op te wekken. Het derde model is de toediening van koolstoftetrachloride via orale gavage.Kooltetrachloride veroorzaakt hepatocellulaire necrose en kan worden gebruikt om zowel acute leverschade als hepatische fibrose te modelleren. Bioluminescente beeldvorming wordt uitgevoerd op modelmuizen om de productie van ROS te beoordelen. De resulterende gegevens wijzen uit dat N-A-D-P-H oxidase de belangrijkste bron is van ROS-generatie als reactie op inflammatoire stimuli.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de Florence-probe, is dat deze methode een minimaal invasieve benadering biedt voor real-time monitoring van RS-generatie tijdens in vivo ontsteking. Deze methode kan ons helpen om kernvragen over ontsteking en letsel na de afweerreactie te beantwoorden, zoals de rol van RS bij longontsteking en longletsel. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we onderzoek startten naar de rol van reactieve zuurstofspecies bij de gastheerdefensie voor alle drie de in deze video getoonde diermodellen van ROS-generatie.Gebruik P 47 Fox null-muizen en op leeftijd en geslacht afgestemde C 57 BL six DBA-muizen. Verkrijg goedkeuring voor de experimenten van de institutionele commissie voor dierenwelzijn en -gebruik ter voorbereiding op de intratracheale toediening van xin. Steriliseer het chirurgische platform met 70% ethanol en bedek dit met een steriel verband.De chirurgische procedure moet worden uitgevoerd met een schone chirurgische jas, handschoenen, een masker en onder gebruik van steriele instrumenten voor anesthesie. Vul de vaporizer van een systeem voor continue toediening van isofluraan met 2 tot 3% isofluraan en zet deze aan. Plaats de muizen vervolgens na twee tot drie minuten in de anesthesiekamer en bevestig dat de muizen volledig verdoofd zijn door een knijptest bij de teen uit te voeren en de ademhaling en beweging te observeren.De ademhalingsfrequentie moet met ongeveer 50% zijn afgenomen. Scheer vervolgens met een trimmer de incisieplaats aan de voorzijde van de nek van de muis. Plaats de muis in een rechte positie op het operatieplatform en plaats een neuskegel om de anesthesie te handhaven. Breng Betadine en 70% ethanol drie keer afwisselend aan op de nek.Knip vervolgens met een rechte, scherpe schaar ongeveer 0,5 centimeter van de huid bij de voorkant van de nek door. Dissekeer daarna met gebogen pincetten de spier rond de trachea om deze bloot te leggen voor de intratracheale toediening van Xan. Gebruik een spuit met een naald van 27 gauge om de trachea in het middenstuk tussen de kraakbeenringen door te prikken.Richt de naald vervolgens anterieur en injecteer langzaam één microgram per gram lichaamsgewicht Xan. Sluit de incisie postoperatief met vijf steriele nylon hechtingen. Plaats de muis in een herstelkooi bedekt met plat papier en plaats de helft van de herstelkooi op een warmtemat.Houd de muizen in de gaten totdat ze wakker zijn en zich vrij kunnen bewegen. Om een tweede ligatie en punctie uit te voeren, scheert u de buik van een geanestheseerde muis met een trimmer en plaatst u de muis in rugligging op een chirurgisch platform. Desinfecteer vervolgens het operatiegebied met Betadine en 70% ethanol.Maak, zoals eerder gedaan met een scalpel, een incisie van 1,5 centimeter in de huid van de abdominale middenlijn met een schaar. Snijd het peritoneum door en open de buikholte met een retractor; lokaliseer en leg het caecum vrij, dat zich aan de linkerzijde van de buikholte bevindt. Exterioriseer dit met behulp van niet-traumatische forceps.Ligate vervolgens het distale deel van 50% van het blootgestelde caecum met vier zijden hechtdraden. Gebruik een naald van 21 gauge om het caecum distaal van de ligatie te puncteren. Plaats het caecum terug in de buikholte.Gebruik vier steriele nylon hechtingen van 4-0 om de buikwand te sluiten. Sluit vervolgens de incisie met vijf steriele nylon hechtingen. Dien 0,5 milliliters fysiologische zoutoplossing met 2,5 micrograms buprenorfine subcutaan toe en voer de postoperatieve observatie uit zoals voorheen.Oraal kooltetrachloride is een model voor leverbeschadiging die afhankelijk is van reactieve zuurstofverbindingen. Dien kooltetrachloride toe via orale gavage door de gesuffeerde en geanestheseerde muis zo vast te houden dat de kop in een verticale lijn met de slokdarm staat. Plaats vervolgens de punt van een 22 gauge voedings- en doseernaald met kooltetrachloride achter de snijtanden, richt deze naar de achterkant van de keel en door de slokdarm, en druk op de zuiger om het kooltetrachloride toe te dienen. Houd de muis in de gaten tijdens het herstel. Bioluminescente beelden dienen te worden verkregen vóór de inductie en vier en twintig uur na de inductie van de ROS-productie.Open hiervoor de software Live Image 4.2. Initialiseer vervolgens het IVIS 200 beeldvormingssysteem. Klik op 'initialize' en zet het systeem in de luminescentiemodus.Wacht tot de temperatuur van de charge-coupled device is gestabiliseerd, wat op het scherm in de software zal worden aangegeven. Stel de belichtingstijd in op 40 seconden. Stel vervolgens de Binning in op medium en het diafragma op één achtste.Plaats een geanestheseerde muis in de beelduitsnedekamer met de temperatuurgecontroleerde tafel en positioneer deze in rugligging. Plaats een neusmasker om twee minuten voor elke beeldopname anesthesie toe te dienen, zoals voorheen. Gebruik een spuit van 1 ml met een naald van 27 gauge om 50 µL van het luminale derivaat L 0 1 2 intraveneus toe te dienen.Voer een retro-orbitale injectie uit. Neem tot slot beelden op en analyseer deze zoals beschreven. Analyseer in het volgende gedeelte van de video de verzamelde gegevens met behulp van Living Image software versie 4.2 in de software.Open een afbeelding en klik op ROI-tools in het gereedschapspalet. Selecteer vervolgens in het menu ROI-tools de optie ROI-vorm en klik op de cirkel in de vervolgkeuzelijst. Selecteer het aantal ROI's dat aan de afbeelding zal worden toegevoegd.Pas de positie van de ROI over de borstkas en/of buik aan in het ROI-toolsmenu om de signaalintensiteit of fotonenflux van het interessegebied te kwantificeren. Klik op de meetknop om de tabel met ROI-metingen te openen, waarin de gegevens voor alle in de beelden gecreëerde ROI's worden weergegeven. Gebruik een softwarepakket voor statistische analyse om een twee-weg ANOVA uit te voeren met Bonferroni-posthoc-testen op individuele tijdstippen om de ROS-generatie in de longen van wild-type en N-A-D-P-H-oxidasdeficiënte muizen te vergelijken.P 47 Fox-null muizen na Xan-challenge. Xan werd toegediend zoals beschreven in deze video bij de nulmeting en na 4 en 24 uur. De muizen werden afgebeeld zoals hier getoond.Er was een significante toename in foto-emissie over de borst bij wild-type, maar niet bij P 47. Fox sno-muizen na vier uur en 24 uur vergeleken met de nulmeting. Dit suggereert dat N-A-D-P-H oxidas de belangrijkste bron is van ROS-generatie in de longen na toediening van XUS Sand.Vervolgens werd de productie van ROS beoordeeld in het CLP-geïnduceerde sepsismodel. Sepsis is een levensbedreigend syndroom dat geassocieerd wordt met schade aan eindorganen, waaronder acute longbeschadiging en het acute respiratoire distresssyndroom. ROS-gemedieerde schade wordt beschouwd als een belangrijke factor die bijdraagt aan sepsis-geïnduceerd multi-orgaanfalen.Zoals in deze grafiek te zien is, waren ROS significant verhoogd boven de borstkas vier uur na CLP en boven de buik 24 uur na CLP bij wild-type muizen. Echter waren de ROS-niveaus bij P 47 Fox-null muizen op beide tijdstippen vergelijkbaar met de baseliniveaus. Deze resultaten tonen aan dat de generatie van ROS in het door CLP geïnduceerde sepsis-muismodel afhankelijk is van N-A-D-P-H oxidase.Ten slotte werd bioluminescente beeldvorming gebruikt om de productie van ROS te detecteren in een model van leverbeschadiging geïnduceerd door koolstoftetrachloride. In tegenstelling tot de eerder beschreven modellen van ontsteking en letsel, was de productie van ROS in het abdomen bij P 47, Fox-null muizen vier uur na toediening van koolstoftetrachloride bescheiden verhoogd, ongeveer 35% boven de baseline. De omvang van de door koolstoftetrachloride geïnduceerde ROS-generatie was echter significant groter bij wildtype muizen dan bij P 47 Fox-null muizen.Deze gegevens suggereren dat zowel P 47 Fox-bevattende N-A-D-P-H oxidase-afhankelijke als onafhankelijke ROS-generatie optreden bij acute carte chloride-geïnduceerde leverschade. Bioluminescentie-beeldresultaten die een verhoogd ROS-niveau in wildtype muizen aantoonden vergeleken met P 47-knock-out muizen, gaven aan dat N-A-D-P-H oxidase een belangrijke bron is van ROS-generatie als reactie op een inflammatoire stimulus.Deze methode biedt een minimaal invasieve benadering voor real-time monitoring van de generatie van RS tijdens inflammatie in vivo.

bioluminescence-imaging-nadph-oxidase-activity-different-animal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Gua Sha, de traditionele Chinese therapeutische huid schrapen, veroorzaakt onderhuidse microvasculaire bloed extravasatie. Wij rapporteren een protocol van bioluminescentie beeldvorming van...

Bioluminescentie beeldvorming van heem oxygenase-1 opregulatie in de Gua Sha Procedure

Hierin beschrijven we de methoden om te bouwen, visualiseren en kwantificeren van de bioluminescente reacties van zowel vuurvlieg en Renilla luciferase enzymen uitgedrukt in gemetastaseerde borstkanker cellen tijdens hun groei en...

In vivo Dual ondergrond Bioluminescent Imaging

Bioluminescent Bacteriële Imaging<em&gt; In Vivo</em

Source: de Vries, C. R., et al., A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates a bioluminescent imaging technique to monitor bacterial infection progression in a live mouse model. Pathogenic bacteria engineered with the luxABCDE reporter system emit light at the infection site, allowing visualization of metabolically active bacteria. By imaging the mouse over time, researchers can non-invasively track infection...

Bioluminescence Imaging of Bacterial Infections in Mice

Source: Valentine, M. E., et al., Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the use of a bioluminescence-based imaging approach to monitor bacterial infection in a live mouse model. Sequential bioluminescent and X-ray imaging enables real-time visualization and anatomical localization of infection spread throughout the host.

Real-Time Imaging of Bacterial Infection in a Mouse Model Using Bioluminescence

Source: Weber, R. Z., et al., Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the method for in vivo bioluminescence imaging of genetically modified human neural progenitor cells injected in a mouse brain. The process involves luciferin injection, imaging preparation, and detection of bioluminescent signals from the transplanted cells at the injection site.

In Vivo Bioluminescence Imaging of Human Neural Progenitor Cells in a Mouse Brain

We beschrijven een niet-invasieve beeldvorming methode voor het onderscheiden van inflammatoire fasen. Systemische toediening van luminol onthult gebieden van acute ontsteking afhankelijk MPO-activiteit in neutrofielen. Daarentegen injectie lucigenine maakt visualisatie van chronische inflammatie afhankelijk Phox activiteit in macrofagen.

In vivo beeldvorming methode om acute en chronische ontsteking Onderscheid

Een protocol wordt beschreven voor in vivo detectie van effecten van mitochondriale remmers in het modelorganisme Caenorhabditis elegans en voor identificatie van potentiële versterkende verbindingen. Dit protocol kan worden gebruikt om geneesmiddelenbibliotheken te screenen op verbindingen die de mitochondriale functie moduleren.

Een Screenbare<em&gt; In Vivo</em&gt; Test voor Mitochondriale Modulators gebruik van Transgene Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Hier presenteren we een nieuwe Ca 2+ -Imaging aanpak met behulp van een bioluminescente reporter. Deze benadering maakt gebruik van een gefuseerde construct GFP-aequorine dat bindt aan Ca2 + en licht emitteert, waardoor de noodzaak voor excitatie licht. Aanzienlijk deze methode maakt het mogelijk lange doorlopende beeldvorming, de toegang tot diepe hersenstructuren en hoge tijdsresolutie.

In vivo Functional Brain Imaging aanpak op basis van Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorine

Neurale stam/voorlopercellen vertonen verschillende expressie dynamiek van Inkeping signalering componenten die leiden tot verschillende uitkomsten van cellulaire gebeurtenissen. Een dergelijke dynamische uitdrukking kan worden onthuld door real-time monitoring, niet door statische analyse, met behulp van een zeer gevoelig bioluminescentie beeldvormings systeem dat visualisatie van snelle veranderingen in genexpressies mogelijk maakt.

Real-time bioluminescentie beeldvorming van Inkeping signalering dynamiek tijdens Murine neurogenese

Bioluminescentie - licht uitgezonden door een luciferase-enzym dat een substraat met kleine moleculen oxideert, een luciferine - kan worden gebruikt om fotosensorische eiwitten te activeren, waardoor een andere dimensie wordt toegevoegd aan lichtstimulatie en de manipulatie van een veelheid aan lichtgemedieerde functies in cellen op temporele en ruimtelijke schalen mogelijk wordt.

Bioluminescente optogenetica 2.0: Bioluminescentie benutten om fotosensorische eiwitten in vitro en in vivo te activeren

Leer een minimaal invasieve methode voor real-time monitoring van NADPH-oxidase-afgeleide ROS in levende muizen. Deze techniek wordt toegepast in drie inflammatoire muismodellen om ROS-dynamiek in vivo te bestuderen.

Bioluminescentie beeldvorming van NADPH-oxidase activiteit in verschillende diermodellen

Meer video's verkennen