Hydrofobe Salt gemodificeerde Nafion voor enzym immobilisatie en stabilisatie

Het algemene doel van deze procedure is het synthetiseren van een polymeer voor enzymimmobilisatie en -stabilisatie. Om dit te bereiken, combineert u eerst de nafion-suspensie met het ammoniumbromidezout en vortexde het mengsel om de geprotoneerde vorm van nafion uit te wisselen voor ammoniumzouten. De tweede stap is het drogen van het resulterende polymeer door het mengsel in een weegbootje te gieten en de oplosmiddelen te laten verdampen.

Week vervolgens het polymeer in gedeïoniseerd water gedurende 12 tot 24 uur om overtollig zout te verwijderen. Spoel na de zoutextractie het polymeer af met water en laat het polymeer vervolgens volledig drogen door verdamping. De laatste stap is om het polymeer over te brengen naar een schoon vial en het opnieuw op te lossen in oplosmiddel voor gebruik bij enzymimmobilisatie. Uiteindelijk wordt dit polymeer voor enzymimmobilisatie gebruikt om de stabiliteit van enzymen in activiteitsassays te verbeteren.

Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben omdat deze procedure uiterst eenvoudig lijkt, maar de droogprocedure is cruciaal voor de fabricage van een functioneel polymeer. De procedure zal worden gedemonstreerd door een promovendus in mijn laboratorium. Om te beginnen met de procedure voor het modificeren van nafion met Nerium-ammoniumzouten: meet een drievoudig molair overschot aan het alk-ammoniumbromide-zout ten opzichte van de sulfozuurgroepen op het nafion-polymeer af.

Breng het alk ammoniumbromide-zout krachtig over naar een glazen vial. Schud een fles met 5% gewicht per volume Nafion-suspensie gedurende ongeveer 30 seconden om te garanderen dat het Nafion uniform in de oplossing is gesuspendeerd. Pipetteer twee milliliters van het nu opnieuw gesuspendeerde Nafion en voeg dit toe aan de glazen vial met het AGU ammoniumbromide-zout.

Vortex het flaconnetje gedurende 10 tot 15 minuten op 900 RPM. Giet vervolgens de viskeuze oplossing in een plastic weegschaaltje en gebruik een pipet om eventuele resterende oplossing vanuit het flaconnetje naar het weegschaaltje over te brengen. In dit voorbeeld is het weegschaaltje gedeeltelijk afgedekt en op de laboratoriumbank geplaatst, zodat de oplosmiddelen volledig uit het weegschaaltje kunnen verdampen met een verdampingssnelheid die meer dan zes uur in beslag neemt.

Volledige verdamping van alle oplosmiddel bij de juiste verdampingssnelheid moet een geel of bruin transparante film achterlaten op de bodem van de weegschaalbak, zoals hier getoond. Als het oplosmiddel te snel verdampt, vormt zich in plaats van een transparante film een korstig of kristallijn materiaal, wat aangeeft dat de micellaire structuur van het polymeer is vernietigd. Als de verdamping van het oplosmiddel te traag verloopt of als het ammoniumzout te lang reageert en te veel waterdamp opneemt, vormt zich ofwel een kleverige oranje gel ofwel een wit kristallijn materiaal.

In beide gevallen moet de procedure opnieuw worden gestart. Nadat al het oplosmiddel met de juiste verdampingssnelheid is verdampt, vult u de weegschaalbak met 10 tot 20 milliliters 18 mega ohm centimeter gedeïoniseerd water en laat u het 12 tot 24 uur weken om overtollige ammoniumbromidezouten en HBR te verwijderen. Pipetteer na 12 tot 24 uur het water weg en voeg voldoende gedeïoniseerd water toe om de bak te vullen. Let erop dat u altijd weg van de polymeerfilm pipetteert om te voorkomen dat er materiaal verloren gaat.

Spoel in totaal drie keer na de spoelbeurten. Laat het weegschaaltje onbedekt staan totdat het polymeer volledig is gedroogd. Wanneer het volledig is gedroogd, moet het polymeer een heldere en enigszins brosse plastic film zijn.

In tegenstelling hiertoe zullen polymeren die niet correct zijn gedroogd een zeer ander uiterlijk hebben na zoutextractie, zoals hier wordt getoond. Verwijder met een spatel voorzichtig de gedroogde film uit de weegschaalbak en breng deze over in een schoon glazen vial. Voeg twee milliliters ethanol en drie keramische mengkralen toe en vortex vier uur lang of totdat de polymeerfilm volledig is geresuspendeerd.

De met alkylammonium gemodificeerde nanostructuur in oplossing is nu klaar voor gebruik voor enzymimmobilisatie. Als het te immobiliseren enzym een droog enzym is, weeg dan één milligram van het enzym af in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en voeg één milliliter van een honderd millimolaire fosfaatbuffer bij pH 7 toe om een enzymoplossing van één milligram per milliliter te maken. Overbreng 120 microliters van de enzymoplossing van één milligram per milliliter naar een nieuwe buis.

Voeg 60 µL van de ALK ammonium gemodificeerde nafion-oplossing toe en vortex gedurende 10 seconden. De verhouding tussen enzym en polymeeroplossing moet twee op één blijven indien dit mengsel moet worden opgeschaald voor een groot aantal herhalingen. Pipetteer ten slotte 60 µL van de enzympolymeeroplossing op de bodem van elk van de drie afzonderlijke cuvetten van één vierkante centimeter en laat deze gedurende de nacht drogen.

De stabiliteit van het enzym binnen de polymeerfilm kan vervolgens worden beoordeeld door middel van enzymatische activiteitsassays, zoals gedemonstreerd. Om deze assay te starten, voegt u de volgende reagentia toe aan de kuvet waarin de gemodificeerde Nafion-polymeer en het NAD-afhankelijke dehydrogenase-enzym zijn gegoten: 1,3 milliliter 50 millimolaire natriumpyrofosfaat, 1,5 milliliter vers bereide 15 millimolaire nicotinamide-adenine-dinucleotide of NAD en 0,1 milliliter water.

Plaats de cuvet in een UV-Vis spectrophotometer die is ingesteld op een golflengte van 340 nanometer en nulal this. Voeg 0,1 milliliter ethanol toe aan de cuvet en meng de reagentia door de oplossing vijf keer voorzichtig met de pipet op en neer te zuigen; gebruik voor een blanco 0,1 milliliter extra water in plaats van de 0,1 milliliter ethanol. Registreer vijf minuten na het toevoegen van de reagentia aan de cuvet de absorptie bij 340 nanometer.

Meet de absorbentie opnieuw 20 minuten na het toevoegen van reagentia aan de qve; deze twee datapunten worden uitgezet om een helling te verkrijgen die kan worden gebruikt voor activiteitsberekeningen om de enzymatische specifieke activiteit van geïmmobiliseerde pq te bepalen. PQQ-afhankelijke dehydrogenases pipetteer deze reagentia in de qve die is gegoten met het gemodificeerde Nafion-polymeer en PQQ-afhankelijk dehydrogenase: 1,5 milliliters natriumfosfaat en 200 microliters 600 micromolaire pH methylsulfaat of PMS.

Plaats de cuvet in een UV-vis spectrophotometer die is ingesteld op een golflengte van 600 nanometer en nul deze. Voeg aan de spectrometer 100 microliter toe van een mengsel van 700 microliter six chloro endemol of DCIP en 200 microliter van het betreffende substraat. Meng de reagentia door de oplossing voor een blanco vijf keer voorzichtig op en neer te pipetteren.

Gebruik 200 µL water in plaats van het betreffende substraat. Vijf minuten nadat de reagentia zijn toegevoegd, wordt de absorbentie bij 600 nm geregistreerd.

Meet de absorbantie opnieuw 20 minuten na het toevoegen van de reagentia om deze assay te starten. Voeg toe aan de Q VET co-gecoat met het gemodificeerde nafion-polymeer en glucose-oxidase. Twee milliliter van een oplossing die het volgende bevat: 0,2 molair para-hydroxybenzoëzuur, 0,02% natriumazide, 128 units peroxidase, 0,3 millimolair 4-amino-antipyrine, 1 molair kaliumfosfaat en 50 millimolair glucose.

Maak de oplossing door vijf keer op en neer te pipetteren. Plaats de Q vet in een UV-Vis spectrofotometer die is ingesteld op een golflengte van 510 nanometers. Vijf minuten nadat de reagentia aan de qve waren toegevoegd.

Noteer de absorbentie bij 510 nanometer. Noteer vervolgens de absorbentie opnieuw 20 minuten na toevoeging van de reagentia. Deze tabel toont de assayresultaten van NAD-afhankelijke glucose-dehydrogenase-activiteit geïmmobiliseerd op geselecteerde gemodificeerde nafion-polymeren.

Er werd waargenomen dat geïmmobiliseerde NAD-afhankelijke glucose-dehydrogenase een lagere specifieke activiteit vertoonde dan de enzym- en bufferoplossing. Dit komt doordat polymeermembranen het transport van grote moleculen verminderen; hoewel glucose, het substraat voor de assay, klein is, moet het co-enzym NAD door het membraan diffunderen. Voor NAD-afhankelijke dehydrogenase vermindert de transportbeperking als gevolg van immobilisatie in het polymeer de waargenomen enzymatische activiteit.

De volgende tabel toont de assayresultaten van de PQQ-afhankelijke glucose-dehydrogenase-activiteit geïmmobiliseerd op geselecteerde gemodificeerde nafion-polymeren. Het is hier belangrijk op te merken dat de enzymen geïmmobiliseerd op de meeste nafion-films een hogere activiteit vertonen vergeleken met de enzymen in bufferoplossing. Aangezien PQQ-afhankelijk glucose-dehydrogenase een membraangeassocieerd eiwit is, biedt het hydrofoob gemodificeerde micellaire nafion een meer membraanachtige omgeving dan buffer voor de stabilisatie van het actieve PQQ-afhankelijk glucose-dehydrogenase, waardoor de activiteit van het enzym wordt verhoogd.

Ten slotte worden de representatieve assayresultaten van de specifieke activiteit van glucose-oxidase weergegeven. De geïmmobiliseerde en geselecteerde gemodificeerde nafion-polymeren staan in deze tabel. De enzymatische assays voor elk van de polymeren met elk van de drie enzymen laten zien dat de trends in relatieve specifieke activiteit vergeleken met het enzym en de oplossing een functie zijn van het enzymsysteem.

Bijgevolg moet het exacte polymeer dat nodig is voor elk enzym worden geoptimaliseerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de droogstap cruciaal is voor deze specifieke procedure.