Name: Een Parasiet Rescue and Transformation Assay voor antileishmania Screening tegen intracellulaire Leishmania donovani Amastigoten in THP1 Human acute monocytische leukemiecellijn (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Leer een geoptimaliseerde parasiet-rescue en transformatie-assay voor antileishmaniale screening met THP1-cellen geïnfecteerd met Leishmania donovani. Deze methode kwantificeert levende intracellulaire amastigoten voor nauwkeurige bepaling van geneesmiddelwerking.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De NCNPR-USDA-ARS Wetenschappelijk overeenkomst No 58-6408-2-0009; CDMRP subsidie ​​Award # W81XWH-09-2-0093 door het Amerikaanse leger Medisch onderzoek en Materieel Command.

1. Onderhouden en Subculture THP1 Cultuur van de Cel <ol><li> Handhaven THP1 cellen in RPMI-1640 medium (met 10% FBS en pH 7,4) bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator. </li><li> Subcultuur cellen tweemaal per week cellen niet overschrijdt 1x10 6 cellen / ml. Dit is belangrijk om de transformatie vermogen. </li></ol> 2. Onderhouden en Subculture Leishmania donovani promastigoten Cultuur <ol><li> Handhaving van de L. donovani promastigoten (S1, sudan stam) in RPMI-1640 medium (zonder natriumbicarbonaat en natriumpyruvaat) met 10% FBS bij 26 ° C. </li><li> Subculture L. donovani promastigoten twee keer per week, met de hoogste concentratie cellen in het bereik van 20-25x10 6 promastigoten / ml.Caution: Alle media en oplossingen moeten worden voorgelegd aan de kamertemperatuur vóór gebruik. </li></ol> 3. Zaaien en differentiatie van de THP1 cellen in een 96-well Microplate en 16-chamber Glazen Cultuur Dia. <ol><li> Bereid een verdunde THP1 cultuur met cellen van 2.5x10 5 cellen / ml van een vier dagen oude celkweek (cellen niet meer dan 10 6 cellen / ml) in RPMI-1640 met 10% door warmte geïnactiveerd FBS. Bereid 20 ml van de cultuur voor elke 96-well plaat en 4 ml van de cultuur voor elke 16-well kamer dia. </li><li> Voeg forbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) (voor differentiatie van THP1) om verdunde celkweek suspensie (10 μl/20 ml cultuur van de stock van 50 ug / ml in DMSO) (uiteindelijke concentratie PMA in verdunde cellen cultuur worden 25 ng / ml). </li><li> Om de Digital-Image-Analysis-Direct-Tellen-test en Parasite-Rescue-Transformatie-test te vergelijken, het opzetten van de testen gelijktijdig in heldere, vlakke bodem, 96-well plaat en 16-kamer, glas, microscopische cultuur dia. </li><li> Doseer 200 ul THP1-PMA-behandelde cellen in elk putje of kamer. </li><li> Incubeer de 96-well plates en 16-well kamer slides in een 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende de nacht bijna volledige differentiatie van de cellen mogelijk. </li></ol> Opmerking: De THP1 cellen, die normaal groeien in suspensie worden gedifferentieerd in hechtende macrofagen. 4. Infectie van de getransformeerde cellen THP1 met Leishmania donovani promastigoten <ol><li> Bij infecties van gedifferentieerde THP1 celkweek met Leishmania donovani promastigoten, moet de meerderheid van de parasieten in de besmettelijke metacyclische stadium (lange cilindrische vormen, ~ 5-6 dagen oude cultuur). </li><li> Een 1:10 THP1 cel parasiet verhouding optimaal voor de infectie in zowel de Digital-Image-analyse-Direct-tel-Assay en de Promastigote-Rescue-Transformatie-Assay. </li><li> Bereid een verdunde cultuur van L. donovani promastigoten met een parasiet telling van 2.5x10 6 parasiet / ml (voor THP1 cellen: parasieten ratio = 1:10) uiteen 5 tot 6 dagen oude cultuur in RPMI-1640 medium met 2% FBS. </li><li> Uit stap 3.5 (na overnacht differentiatie van THP1 celkweek) nemen de platen en de kamer slides, verwijder het medium en een keer wassen celculturen met serumvrij RPMI-1640 medium. </li><li> Na zorgvuldige wassen van PMA-behandelde cellen met THP1 serumvrij, warm RPMI-1640 (~ 37 ° C) medium, vervangen serumvrij medium met 200 pi van de verdunde kweek van L. donovani promastigoten (2.5x10 6 parasieten / ml) uit stap 4.3. Stel de controleputjes van THP1 cellen zonder de parasiet en de parasieten zonder THP1 cellen in elk bord en 16-well kamer dia&#39;s. </li><li> Na toevoeging van de parasiet THP1 celkweek, de plaat en dia incuberen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 24 uur om de parasieten de gedifferentieerde THP1-cellen te infecteren. </li></ol> 5. Behandeling van geïnfecteerde macrofagen met Test Drugs / Verbindingen <ol><li> TestAmfotericine B, pentamidine en Miltefosine als standaard anti-leishmanial geneesmiddelen voor screening. Bereid voorraadoplossingen van de drugs / testverbindingen in water of DMSO zoals vermeld in tabel reagens. Test elke geneesmiddelverbinding op 6 concentraties. </li><li> Serieel verdund (1:5) de standaard drugs en testverbindingen in een verse 96-well plaat of 2 ml buizen (voor Kamer slides) met RPMI-1640 medium met 2% FBS. De drugs / testverbinding concentraties in deze plaat zijn van 2X eindconcentratie. </li><li> Was de kweekplaten en kamer dia&#39;s besmet met L. donovani promastigoten (uit stap 4.5) minstens 5 maal met serumvrij RPMI-1640 medium. Voeg 100 ul kweekmedium (RPMI-1640 met 2% FBS) in elk putje / kamer. De meerdere wasbeurten zijn om een ​​volledige verwijdering van niet-geïnternaliseerde promastigoten waarborgen. </li><li> Voeg 100 ul medium van serieel verdunde standaard anti-leishmanial drugs of de testverbindingen aan elk putje of kamer. Stel de infectieted THP1 cellen bestuurt zonder drugs tegelijk in elke plaat / kamer dia. </li><li> Incubeer de platen en de kamer slides bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 48 uur. </li></ol> 6. Kamer kleuring van preparaten, TL Microscoop beeldvorming en beeldanalyse voor de kwantificering van infectie en Effect van Drug Treatment <ol><li> Na 48 uur incubatie was de kamer slede 3 keer met serumvrij RPMI-1640 medium. Trek het plastic kamers van de objectglaasjes en vast de cellen door onderdompelen van de glaasjes in methanol gedurende 30 sec. Laat de dia&#39;s in bio-kap onder luchtstroom voor het drogen. </li><li> Bereid een SYBR Green I kleuroplossing (5X) door verdunning (1:2000) de stock (10.000 X) met water. </li><li> Vlekken op de dia onder donkere omstandigheden met de verdunde oplossing SYBR Green I kleuring voor 15 min bij kamertemperatuur, eenmaal wassen met water en laat de slides in de luchtstroom te drogen. </li><li> Plaats een vol glas dekglaasje over de STAIned dia met behulp van fixeermiddel. </li><li> Leg de digitale beelden van THP1 cellen: zonder infectie (blanco), met infectie (controle), geïnfecteerde cellen behandeld met verschillende standaard drugs of testverbindingen in verschillende verdunningen (figuur 3, 5 en 6)) met een Nikon Eclipse 90i vergezeld fluorescentiemicroscoop door NIS element AR 3.2-software. </li><li> Tel de macrofaag kernen (groot) en de parasiet kernen (klein met kinetoplast) met behulp van ImageJ (figuur 7), dat is een voor het publiek beschikbare, op Java gebaseerde beeldverwerking-programma ontwikkeld aan de National Institutes of Health ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsb. info.nih.gov / ij / download.html</a> ). Druk het data het aantal amastigoten per 100 getransformeerde cellen THP1. </li></ol> 7. De Parasite-Rescue-Transformatie-test: Gecontroleerde lysis van L. donovani amastigoten-geïnfecteerde macrofagen<ol><li> Was de 96-well microplaat van stap 5.5 driemaal met serum-vrij RPMI-1640 kweekmedium. </li><li> Tussen verschillende reinigingsmiddelen getest bij verschillende concentraties, 0,05% SDS behandeling van 30 sec optimaal voor gecontroleerde lysis (maximum cellysis met minimaal verlies van geredde parasieten levensvatbaarheid). </li><li> Verwijder het serumvrije medium uit elk putje na de laatste wassing en voeg 20 ul RPMI-1640 (met 0,05% SDS) aan elk putje. Schud de plaat gedurende 30 sec en voeg 180 ul compleet RPMI-1640 (met 10% FBS) in elk putje. </li><li> Incubeer de platen bij 26 ° C gedurende 48 uur voor transformatie van geredde amastigoten te promastigoten. </li></ol> 8. Kwantitatieve analyse van getransformeerde Promastigote (AlamarBlue assay) <ol><li> Na 48 uur incubatie bij 26 ° C, de geredde levende amastigoten worden omgezet in promastigoten (Figuur 1D). Voeg 10 ul van AlamarBlue in elk putje van de 96-well plates. </li><li> Incubeer de platen bij 26 ° C geroerd. </li><li> Na een nacht incubatie, lees de platen voor standaard fluorescentie op een Fluostar Galaxy fluorimeter (BMG Lab Technologies) bij 544 nm excitatie, 590nm emissie. </li><li> Bereid de dosis-respons curves (procent groei versus concentratie van het geneesmiddel of testverbinding) met ExcelFit (figuren 7-9) en bereken IC 50 / IC 90-waarden uit deze curven (tabel 1). </li></ol> 9. Standaardisatie van THP1 cellen te Parasieten Ratio <ol><li> Standaardiseren THP1 cellen parasieten verhouding gevoeligheid van de assay te bepalen. Opmerking: Laag / hoog parasieten nummers / infectie kan een compromis met de gevoeligheid en selectiviteit van de screening. </li><li> Standaardiseren van de THP1 cellen om parasieten verhouding door het volgen van het hierboven beschreven protocol voor THP1 cellen zaaien en Leishmania promastigote infectie (hoofdstuk 3 en 4), behalve het gebruik different verhoudingen van THP1 cellen parasieten 1:1,25, 1:2,5, 1:5 en 1:10. </li><li> Stel het experiment zowel in 16-kamer slide (voor beeldanalyse) en 96-well plaat (voor parasiet-rescue assay) formaten om de parasiet reddings-en beeldanalyse testen vergelijken. </li></ol> 10. Standaardisering van verschillende detergentia voor gecontroleerde cellysis <ol><li> Het primaire doel van dit experiment is om het protocol te optimaliseren voor gecontroleerde lysis van de cellen THP1 tot maximaal / volledige THP1 cellen lysis te bereiken zonder significante gevolgen voor de levensvatbaarheid van de geredde amastigoot parasieten. </li><li> Testen verschillende detergentia zoals Tween 20, Tween 80, Triton X-100, NP-40 en SDS bij verschillende concentraties en verschillende duur van de behandeling (figuur 2). </li><li> THP1 cellen parasieten verhouding 1:10 en andere voorwaarden zijn vergelijkbaar als hierboven secties 1-8. </li><li> Test de 0,05% SDS behandeling verder voor de verschillende duur van de behandelings verder optimaliseren van de gecontroleerde cellysis. </li></ol>

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Control+of+the+leishmaniasis%3A+report+of+a+meeting+of+the+WHO+Expert+Committee+on+the+Control+of+Leishmaniasis%22">Control of the leishmaniasis: report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis</a>. Xii, Geneva. 22-26 (2010).</li>
<li>Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+scenario+of+drug+development+for+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J.+Med.+Res%22%5BJournal%5D)">Current scenario of drug development for leishmaniasis.</a> Indian J. Med. Res. 123 (3), 399-410 (2006).</li>
<li>Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+Resistance+in+Leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+reviews%22%5BJournal%5D)">Drug Resistance in Leishmaniasis.</a> Clinical Microbiology reviews. 19 (1), 111-126 (2006).</li>
<li>Mikus, J., Steverding, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+colorimetric+method+to+screen+drug+cytotoxicity+against+Leishmania+using+the+dye+AlamarBlue%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+International%22%5BJournal%5D)">A simple colorimetric method to screen drug cytotoxicity against Leishmania using the dye AlamarBlue.</a> Parasitology International. 48 (3), 265-269 (2000).</li>
<li>Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Axenic+Amastigote+System+for+Drug+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">An Axenic Amastigote System for Drug Screening.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 41 (4), 818-822 (1997).</li>
<li>Seifert, K., Escobar, P., Croft, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activity+of+anti-leishmanial+drugs+against+Leishmania+donovani+is+host+cell+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro activity of anti-leishmanial drugs against Leishmania donovani is host cell dependent.</a> J. Antimicrob. Chemother. 65 (3), 508-511 (2010).</li>
<li>Kolodziej, H., Kiderlen, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antileishmanial+activity+and+immune+modulatory+effects+of+tannins+and+related+compounds+on+Leishmania+parasitized+RAW+264.7+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Antileishmanial activity and immune modulatory effects of tannins and related compounds on Leishmania parasitized RAW 264.7 cells.</a> Phytochemistry. 66 (17), 2056-2071 (2005).</li>
<li>Maia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectivity+of+five+different+types+of+macrophages+by+Leishmania+infantum%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Infectivity of five different types of macrophages by Leishmania infantum.</a> Acta Tropica. 103 (2), 150-155 (2007).</li>
<li>Neal, R. A., Croft, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+system+for+determining+the+activity+of+compounds+against+the+intracellular+amastigote+form+of+Leishmania+donovani%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">An in vitro system for determining the activity of compounds against the intracellular amastigote form of Leishmania donovani.</a> J. Antimicrob. Chemother. 14, 463-475 (1984).</li>
<li>Abdullah, S. M., Flath, B., Presber, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+staining+procedures+for+the+flow+cytometric+analysis+of+U-937+cells+infected+with+different+Leishmania-species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of different staining procedures for the flow cytometric analysis of U-937 cells infected with different Leishmania-species.</a> J. Microbiol Methods. 37 (2), 123-138 (1999).</li>
<li>Giorgio, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Detection+of+Leishmania+Parasites+in+Human+Monocyte-Derived+Macrophages%3A+Application+to+Antileishmanial-Drug+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Detection of Leishmania Parasites in Human Monocyte-Derived Macrophages: Application to Antileishmanial-Drug Testing.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44 (11), 3074-3078 (2000).</li>
<li>Mandal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening+of+Leishmania+donovani+clinical+isolates+against+drug+using+a+colorimetric+%CE%B2+Lactamase+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">High throughput screening of Leishmania donovani clinical isolates against drug using a colorimetric β Lactamase assay.</a> Indian J. Exp. Biol. 47 (6), 475-479 (2009).</li>
<li>Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate+assay+for+Leishmania+amazonensis+promastigotes+expressing+multimeric+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein.</a> Parasitol. Res. 89 (4), 266-271 (2003).</li>
<li>Buckner, F. S., Wilson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+assay+for+screening+compounds+against+Leishmania+Amastigote+Grown+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med%22%5BJournal%5D)">Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania Amastigote Grown in macrophages.</a> Am. J. Trop. Med. 72 (5), 600-605 (2005).</li>
<li>Sereno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+perspectives+in+Leishmania+cell+based+drug-screening+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Int%22%5BJournal%5D)">Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures.</a> Parasitol. Int. 56 (1), 3-7 (2007).</li>
<li>Gupta, S., Nishi, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visceral+leishmaniasis%3A+experimental+models+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J.+Med.+Res%22%5BJournal%5D)">Visceral leishmaniasis: experimental models for drug discovery.</a> Indian J. Med. Res. 133, 27-39 (2011).</li>
<li>Roy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Episomal+and+stable+expression+of+the+luciferase+reporter+gene+for+quantifying+Leishmania+spp.+Infections+in+macrophages+and+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. Infections in macrophages and in animal models.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 110 (2), 195-206 (2000).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor anti-leishmanial drug screening gebaseerd op macrofagen amastigoot modellen. Testen kunnen worden uitgevoerd met de macrofagen vanuit gastheerdieren namelijk peritoneale exudaatcellen (PEC), perifeer bloed monocyt-cellen (PBMC) 6 of beenmerg-afgeleide macrofagen (BMM) of monocytische cellijnen zoals muis (J774 en RAW264.7 ) 7 en menselijke (THP1, U937, HL-60) 8 monocytcellen. De assays, die gebruik maken van delende gastheercellen, moet ervoor zorgen dat de verstorende effecten van drugs activiteit op zowel de parasiet en de gastheer cellen nummer worden beschouwd. De gesplitste primaire macrofagen uit verschillende bronnen zoals muizen en ratten zijn niet-delende karakter, maar deze celbereidingen kunnen niet homogene celpopulaties. Monocytcellen-afgeleide cellijnen homogeen van aard zijn en een beter model voor de macrofaag-amastigoot gebaseerde screening. Uit verschillende monocytische cellijnen, differentiated THP1-cellen (menselijke acute monocytische leukemie cellijn) kunnen een niet-delende monolaag en bieden een aantrekkelijk alternatief voor primaire geïsoleerde macrofagen. De macrofaag-amastigoot gebaseerde screening kan op verschillende manieren. Klassieke microscopische evaluatie op basis van directe cel-en parasiet tellen 9 is arbeidsintensief. De afwezigheid van automatisering beperkt de bruikbaarheid van deze assay. Telling van cellen is tijdrovend en onnauwkeurig bepaling van IC50 waarden geven omdat bepaling van levensvatbaarheid door een parasiet kleuring procedure is moeilijk. Veel fluorescente kleurstoffen en monoklonale antilichamen kunnen worden gebruikt voor flowcytometrische assays 10, 11, maar deze testen zijn ook beperkt door minder gevoeligheid en beperking van tijdsinterval van geneesmiddel-behandeling slechts een dag. Er zijn verschillende reportergen testen beschikbaar voor het kwantificeren van de intracellulaire groei van amastigoten 12.13.14. Een automaated screening worden geëvalueerd door middel reportergenen, maar deze assays ook bepaalde nadelen. Eerste deel van deze tests moeten drug selectie voor behoud van de episomale expressie van de reporter genen, die niet ideaal voor de drug screening experiment. De manier waarop de reporter gen wordt geïntroduceerd kan beïnvloeden de fysiologische eigenschappen van de parasiet en invloed op de screening. Als het reportergen is het deel van een episomaal plasmide kan het relatieve vermogen van reporter afhankelijk van het aantal kopieën van de getransfecteerde plasmide (die varieert tussen cellen) dan op de activiteit van het geneesmiddel 14. Sommige reporter parasieten die worden getransformeerd parasieten niet selectieve druk om het reportergen moeten handhaven, maar er kan biologische gevolgen hetzij door verstoring van de genomische architectuur of alleen door de aanwezigheid van vreemde reporter eiwitten 15. In sommige reportergen gebaseerde assays zijn erkwesties van gevoeligheid en achtergrond activiteit 16. Het belangrijkste is dat veel van de reporter genexpressie-assays, speciaal degene met GFP reporter gene15, geen onderscheid tussen de levende en dode intracellulaire amastigoten. Bepalingen op basis van luciferase reportergen kan onderscheiden tussen levende en dode intracellulaire amastigoten, maar substraat en cellysis buffer voor deze assays zijn duur voor grootschalige screening 17. Om deze minpunten en beperkingen van eerdere macrofaag-amastigoot-gebaseerde Screeningtesten te overwinnen, hebben we ontwikkeld en geoptimaliseerd deze parasiet-rescue en transformatie test. Deze assay is gebaseerd op THP1-cellen, die goede homogeniteit hebben en niet-delende niveau, zoals gastheercellen. De Parasite-Rescue-Transformatie-Assay assay hier beschreven is vergelijkbaar met de assay gebaseerd op Digital Image-analyse-Direct-tellen van de intracellulaire amastigoten. Fluorescerende en DIC microscopie, digitale image analyses door ImageJ voor differentiële telling van de macrofaag kernen en de parasiet kernen zijn verder verfijnd de microscopische telling test. Het vastleggen van de beelden onder TL-licht filters en differentieel interferentie contrast (DIC) filters zijn verbeterd de kwaliteit van het digitale beeld voor een nauwkeurigere telling van de intracellulaire parasieten. Zowel TL-en DIC beelden kunnen worden samengevoegd om de digitale beelden te verkrijgen met duidelijke macrofaagcellijnen contouren en fluorescerende intracellulaire kernen. De macrofaag kernen en de parasiet kernen kan verschillend worden erkend met ImageJ. Daarom, zowel digitaal-Image-Analysis-Direct-Tellen-test en Parasite-Rescue-Transformatie-test hebben het potentieel voor automatisering en toepassing op grote schaal screening. De kritische stappen in de Parasite-Rescue-Transformatie-Assay zijn: (a) herhaald wassen van THP1 celculturen na blootstelling aan Leishmania promastigoten, bijna volledige verwijdering van de niet-intern waarborgenalized promastigoten en (b) gecontroleerde lysis van de geïnfecteerde cellen met SDS THP1. Zowel de stappen kunnen worden bediend met automatisering en niet compromis met doorvoer van de test. De tweede stap van waswater, na blootstelling van de Leishmania geïnfecteerde cellen THP1 de testgeneesmiddelen / verbindingen neemt het overblijvende niet-geïnternaliseerde parasieten, indien aanwezig. De Parasite-Rescue-Transformatie-assay biedt aanzienlijke voordelen boven bestaande microscopische reportergen en beeldanalyse assays. De assay is eenvoudig, robuust en reproduceerbaar kunnen worden geautomatiseerd voor grootschalige screening en daarom moeten belangrijke toepassing in het screenen van grote bibliotheken verbindingen voor nieuwe anti-leishmanial drug discovery. Verder kan de assay ook worden toegepast voor de evaluatie van klinische infectiviteit, en, laboratorium isolaten van Leishmania in vitro.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Forbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> P1585 </td><td> Vereist voor differentiatie van THP1 cellen. </td></tr><tr><td> RPMI-1640 Medium </td><td> Invitrogen </td><td> 23400021 </td><td></td></tr><tr><td> Lab-Tek Kamer Geleidingssysteem (16 kamer) </td><td> Thermo Scientific Nunc </td><td> 178599 </td><td></td></tr><tr><td> Heldere, vlakke bodem, 96-wells platen </td><td> BD Falcon </td><td> 353075 </td><td> Platen met 96 putjes analyse uit te voeren </td></tr><tr><td> Amfotericine B </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> A4888 </td><td> Standaard anti-leishmanial geneesmiddel op te lossen in DMSO (2 mg / ml) </td></tr><tr><td> Pentamidine Isothionate Salt </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> P 0547 </td><td> Standaard anti-leishmanial geneesmiddel op te lossen in DMSO (2 mg / ml) </td></tr><tr><td> Miltefosine </td><td> EMD Biosciences USA </td><td> 475841 </td><td> Standaard anti-leishmanial geneesmiddel op te lossen in serumvrij RPMI-1640 medium (vers bereid) (2 mg / ml) </td></tr><tr><td> Natrium Stibogluconate </td><td> EMD Biosciences USA </td><td> 567565 </td><td> Standaard anti-drug leishmanial bereiden in RPMI-1640 met 4% FBS. (1 mg / ml) </td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfaat </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> L 5750 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescentiemicroscoop </td><td> NIKON </td><td> ECLIPSE 90i </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescentie Microplate Reader </td><td> BMG </td><td> Polar Star Galaxy </td><td></td></tr><tr><td> Montage Medium </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> M 1289 </td><td></td></tr><tr><td> eenlamarBlue </td><td> Abd Serotec </td><td> BUF012 B </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green I </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> S 9430 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumbicarbonaat </td><td> Fisher Sci. </td><td> 523500 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumpyruvaat </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> P2256 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11050H </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> P6474 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> NP-40 </td><td> Calbiochem </td&gt; <td> 492016 </td><td></td></tr></tbody></table>

een parasiet rescue and transformation assay voor antileishmania screening tegen intracellulaire<em&gt; leishmania donovani</em&gt; amastigoten in thp1 human acute monocytische leukemiecellijn

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis is een van de meest verwaarloosde ziekten ter wereld, grotendeels die de armste van de armen, vooral in ontwikkelingslanden. Meer dan 350 miljoen mensen worden beschouwd als een risico van aanbestedende leishmaniasis, en ongeveer 2 miljoen nieuwe gevallen doen zich jaarlijks 1. Leishmania donovani is de verwekker van viscerale leishmaniasis (VL), de meest dodelijke vorm van de ziekte. De keuze van de medicijnen beschikbaar om leishmaniasis te behandelen is beperkt 2; huidige behandelingen bieden beperkte werkzaamheid en velen zijn giftig bij therapeutische doses. Bovendien hebben de meeste van de eerste lijn behandeling drugs al verloren hun bruikbaarheid door toenemende multiple drug resistance 3. De huidige pijplijn van anti-leishmanial drugs is ook sterk uitgedund. Aanhoudende inspanningen zijn nodig om een nieuwe anti-leishmanial drug discovery pijplijn te verrijken, en dit streven is gebaseerd op de beschikbaarheid van geschikte in vitro screening modellen. In vitro promastigoten 4 en axenische amastigoten assays 5 worden voornamelijk gebruikt voor anti-leishmanial drug screening kan echter niet geschikt als gevolg van belangrijke cellulaire, fysiologische, biochemische en moleculaire verschillen in vergelijking met de intracellulaire amastigoten. Assays met macrofagen amastigoten modellen worden beschouwd dichtst bij de pathofysiologische omstandigheden van leishmaniasis en zijn daarom het meest geschikt voor in vitro screening. Gedifferentieerde, niet-delende humane acute monocytische leukemiecellen (THP1) (een aantrekkelijke) alternatief voor geïsoleerde primaire macrofagen en kan worden gebruikt voor het bepalen van anti-leishmanial activiteit van verschillende verbindingen tegen intracellulaire amastigoten. Hier presenteren we een parasiet-rescue en transformatie test met gedifferentieerde THP1 cellen geïnfecteerd in vitro met Leishmania donovani voor het screenen van zuivere stoffen en natuurproducten prodducten extracten en het bepalen van de werkzaamheid tegen de intracellulaire Leishmania amastigoten. De bepaling omvat de volgende stappen: (1) differentiatie van cellen THP1 niet-delende macrofagen, (2) infectie van macrofagen met L. donovani promastigoten metacyclische, (3) behandeling van geïnfecteerde cellen met testgeneesmiddelen, (4) gecontroleerd lysis van geïnfecteerde macrofagen (5) release / redding van amastigoten en (6) verwerking van levende amastigoten te promastigoten. De assay werd geoptimaliseerd met detergent lysis gecontroleerde behandeling van Leishmania-geïnfecteerde cellen THP1 bijna volledige redding van levensvatbare intracellulaire amastigoten bereiken met minimale effecten op hun vermogen om te transformeren naar promastigoten. Verschillende macrofaag: promastigoten verhoudingen werden getest om de infectie bereiken. Kwantificering van de infectie werd uitgevoerd door middel van transformatie van levende, geredde Leishmania amastigoten om promastigoten en de evaluatie van hun groei door een alamarBlue fluorometrische assay in 96-well microtiterplaten. Deze test is vergelijkbaar met de momenteel gebruikte microscopische transgene reportergen en digitale beeldanalyse assays. Deze test is robuust en meet alleen de live intracellulaire amastigoten ten opzichte van reportergen en beeldanalyse assays, die niet kunnen onderscheid maken tussen levende en dode amastigoten. Ook is de assay gevalideerd met een huidige panel van anti-leishmanial drugs en ​​is met succes toegepast op grootschalige screening van zuivere verbindingen en een bibliotheek van natuurlijke producten fracties (Tekwani et al.. Gepubliceerd).

Een kwantitatieve analyse werd gedaan voor zowel digitale-Image-Analysis-Direct-Tellen-test en Parasite-Rescue-Transformatie-test voor 24, 48, 72 en 96 uur na de behandeling met geneesmiddelen In de directe telmethode, infectie van L. donovani-geïnfecteerde macrofagen (THP1 cellen) werd berekend met de volgende vergelijking: <img alt="Vergelijking 1" fo:content-width="3.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054eq1.jpg" /> De amastigoten (bepaald door het tellen amastigoten kernen) / 100 getransformeerde THP1-cellen (bepaald door het tellen geteld THP1 celkernen) (figuur 7) is een nauwkeurige maatstaf voor het effect van verschillende standaard of testverbindingen analyseren dan het percentage geïnfecteerde cellen THP1 , zoals gerapporteerd in eerdere documenten, omdat dit aantal is direct gerelateerd aan totale effect van verbindingen, hetzij door een afnamein parasieten in macrofaagcellen of volledige verwijdering van de parasiet macrofaag cells.Infection werd berekend uit digitale beelden van geïnfecteerde THP1 cellen behandeld met verschillende standaard drugs bij verschillende verdunningen voor verschillende tijdsintervallen (Figuur 10 en Tabel 1). De uitlezing voor de Digital-Image-Analysis-Direct-Tellen-assay werd amastigoten infection/100 getransformeerd THP1 cellen, terwijl de uitlezing voor de Parasite-Rescue-Transformatie-test werd relatieve fluorescentie-eenheden (RFU), die recht evenredig met het aantal levende Leishmania amastigoten gered uit de geïnfecteerde macrofagen en veranderen in promastigoten. De AlamarBlue test wordt routinematig gebruikt voor Leishmania promastigoten anti-leishmanial drug discovery. De test werd aanvankelijk gestandaardiseerd en geoptimaliseerd voor gecontroleerde lysis van Leishmania-geïnfecteerde cellen THP1. Het doel was om de voorwaarden te optimaliseren voor reinigingsmiddel treatment, die bijna volledige lysis van cellen THP1 leveren met minimaal effect op de levensvatbaarheid van de geredde amastigoten. Figuur 1 toont een microscopisch beeld van de volledige assay protocol. Intact THP1-cellen geïnfecteerd met Leishmania amastigoten te zien in figuur 1A. 1B toont lysis van de cellen na THP1 detergent behandeling. Figuur 1C toont gered Leishmania amastigoten, die gedeeltelijk omgezet in promastigoten en Figuur 1D toont bijna volledige omzetting van amastigoten in promastigoten en de daaropvolgende proliferatie. De groei van deze getransformeerde promastigoten kwantitatief worden gevolgd met toevoeging van AlamarBlue en meting van fluorescentie op een microplaatlezer. Behandeling met NP-40 (Figuur 2A) en Triton X-100 (Figuur 2B) gelyseerd de geïnfecteerde cellen THP1, maar het ook invloed op de levensvatbaarheid entransformatie van de geredde amastigoten. Behandeling met Tween 20 (figuur 2C) en Tween 80 (figuur 2D) veroorzaakten geen optimale lysis van THP1 cellen resulterend in een onvolledige redding van amastigoten zoals aangegeven door lage aantallen getransformeerde promastigoten. De behandeling met 0,05% SDS gedurende 30 seconden (figuur 2E) leverde bijna volledige lysis van Leishmania-geïnfecteerde THP1 cellen en had geen invloed op de levensvatbaarheid en de transformatie van geredde amastigoten. Verdere optimalisatie bleek dat behandeling van cellen met 0,05% SDS gedurende 20-30 sec leverde hoogste redding van levensvatbare Leishmania amastigoten (figuur 2F). In daaropvolgende experimenten behandeling met 0,05% SDS gedurende 30 sec werd gebruikt. Procedure voor SDS behandeling is dezelfde voor een of meerdere platen. In meerdere platen, werd SDS behandeling geïmplementeerd kolom per kolom met een meerkanaals pipet. Serumvrij medium werd verwijderd van alle 8 putjes van een kolom van de plaat en 20 &amp; mu, L 0,05% SDS toegevoegd in 8 putjes van dezelfde kolom en verdund na 30 sec met RPMI-1640 met 10% FBS. Tijdens de eerste standaardisatie van de assay werden de platen gecontroleerd onder de microscoop niet-geïnternaliseerde promastigoten. Een minimum van vijf wassingen waren nodig voor het verwijderen van parasieten voor stap 5 behandeling van geïnfecteerde macrofaag-cellen met standaard verbindingen en drie wassingen waren nodig voor stap 7 van SDS behandeling. Zo werden de cellen 8 maal gewassen en geen zichtbare niet-geïnternaliseerde promastigoten nog voordat de controle lysis van geïnfecteerde cellen THP1. Digital Image Analysis en Direct Counting De digitale beelden van Leishmania-geïnfecteerde THP1-cellen werden op Nikon Eclipse 90i fluorescentie microscoop na kleuring met SYBR Green I. Zowel macrofagen kernen en intracellulaire Leishmania kernen met karakteristieke kinetoplast DNA waargenomen bij tl filters (figuur 3). Verder werden de beelden van geïnfecteerde cellen THP1 ook gevangen onder DIC. Wanneer zowel de beelden werden samengevoegd, werden de contouren van THP1 cellen intracellulaire amastigoten duidelijker zichtbaar (figuur 4). De ImageJ software werd gebruikt om deze beelden te analyseren. ImageJ is een publiek domein, op Java gebaseerde, beeld-processing programma ontwikkeld aan de National Institutes of Health ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</a> ). ImageJ is ontworpen met een open architectuur die uitbreidbaarheid via Java plug-ins en opneembare macro&#39;s biedt. Custom acquisitie, analyse en verwerking van plugins kunnen worden ontwikkeld met behulp van ImageJ de ingebouwde editor en een Java-compiler. Voor differentiële telling van THP1 cellen kernen en parasieten kernen door ImageJ, werd het beeld geopend in ImageJ. Celgetalmeter werd gevonden in Analyze optie in plugin van de Software. Het beeld werd geïnitialiseerd en celgetalmeter type 1 werd geselecteerd voor THP1 cell kernen en celteller type 2 werd geselecteerd voor parasiet kernen (figuur 3). Differentiële telling werd gedaan gedurende 200 THP1 celkernen en het intracellulaire amastigoten in deze THP1 celkernen. Een vergelijking van parasiet-rescue assay en beeldanalyse methode werd voor de evaluatie van de infectiviteit van THP1 cellen met verschillende macrofagen:. Promastigoten verhoudingen (figuur 4) Figuur 5 geeft het verschil infectiviteit in THP1-cellen bij verschillende macrophage: promastigote verhoudingen. Beide methoden gaven vergelijkbare resultaten en de macrofaag: promastigote van 1:10 leverde optimale en reproduceerbare infectiviteit. Nadat de voorwaarden voor parasite-rescue/transformation assay en de digitale beeldanalyse werden geoptimaliseerd, werd de bruikbaarheid van deze assays geëvalueerd anti-leishmanial drug screening. De Leishmania-geïnfecteerde THP1 cellen werden behandeld met verschillende concentraties van een standaardnti-leishmanial drugs namelijk Amfotericine B, Pentamidine en Miltefosine voor verschillende tijdsintervallen van 24 tot 96 uur. Het experiment parasiet gered / transformatie test werd uitgevoerd in drievoud en de directe experiment cellen telmethode werd in tweevoud. Figuur 6 toont microscopische foto&#39;s van geïnfecteerde controle, onbehandelde controle en geïnfecteerd Leishmania-infectie behandeld THP1-cellen. De dosis-respons curves werden bereid uit de parasiet-rescue en transformatie assay (concentratie van het geneesmiddel versus getransformeerde parasieten) en beeldanalyse assay (aantal amastigotes/100 THP1 cellen) (figuren 7-9). De IC50 van de geneesmiddelen werden berekend door ExcelFit en zijn weergegeven in tabel 1. Digital-Image-Analysis-Direct-Tellen-test en Parasite-Rescue-Transformatie-test toonde vergelijkbare resultaten. Digital-Image-Analysis-Direct-Tellen-test was minder optimaal tijdens de vroege tijdstippen van 24 en 48 uur drugs treatments, terwijl de Parasite-Rescue-Transformatie-test toonde resultaten meer in overeenstemming met de gerapporteerde waarden op alle tijdstippen tijdens de 24 tot 96 uur na behandeling met geneesmiddelen. Dit verschil in resultaten met Digital-Image-Analysis-Direct-Tellen-test en Parasite-Rescue-Transformatie-test kan door de aanwezigheid van niet-levensvatbare amastigoten zijn tijdens de vroege periodes van behandeling met geneesmiddelen in Digitale-Image-Analysis-Direct-tellen -Assay. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig1.jpg" /> Figuur 1. Een microscopisch beeld van de Leishmania donovani amastigoten reddings-en transformatie naar promastigoten. A - Hechtende THP1-cellen geïnfecteerd met Leishmania amastigoten, B - aanhanger, geïnfecteerde cellen THP1 na gecontroleerde lysis C - Getransformeerde Leishmania donovani promastigoten van de amastigoten geïnfecteerde gered uit THP1 macrofaagcellen D - groei en proliferatie van transformed Leishmania donovani promastigoten. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig2.jpg" /> Figuur 2. Optimalisatie van gecontroleerde lysis van geïnfecteerde cellen THP1 maximum redding van levende Leishmania donovani amastigoten en hun transformatie bereiken promastigoten. Analyse van lysis van cellen en THP1 redding van amastigoten van de Leishmania-geïnfecteerde cellen met THP1 verschillende reinigingsmiddelen. Twee concentraties (0,05% en 0,1%) van detergent en twee perioden (30 sec en 60 sec) voor behandeling werden getest. RFU = relatieve fluorescentie-eenheden. Elke staaf stelt het gemiddelde van dubbele waarnemingen. [A] NP-40 behandeling veroorzaakte lysis van cellen en THP1 ook invloed op de levensvatbaarheid van de geredde amastigoot parasieten. [B] Triton X-100 treatment veroorzaakt lysis van cellen en THP1 ook invloed op de levensvatbaarheid van de geredde amastigoot parasieten [C] Tween 80 veroorzaakt gedeeltelijke lysis van cellen THP1 de amastigoten redden. [D] Tween 80 veroorzaakt gedeeltelijke lysis van cellen THP1 de amastigoten redden. [E ] SDS behandeling veroorzaakt bijna volledige lysis van THP1 cellen en heeft levensvatbaarheid van de geredde amastigoten geen invloed op 0,05% / 30 sec. [F] De behandeling met 0,05% SDS gedurende 20-30 sec veroorzaakt bijna volledige lysis van THP1 cellen en gered levensvatbare parasiet amastigoten om te zetten in promastigoten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4054/4054fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig3.jpg" /> Figuur 3. Fluorescent digitaal beeld van een gedifferentieerde cel die is geïnfecteerd THP1 in vitro met Leishmanieen donovani amastigoten. De karakteristieke kDNA kan ook worden gezien met elke parasiet kern. De macrofaag nucleus (mN) (1) en de parasiet kernen (pN) (2) kan differentieel worden gemerkt en differentieel geteld ImageJ analyse software voor kwantitatieve evaluatie van de infectie. De kwantificering werd gedaan aantal amastigotes/100 THP1-cellen. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig4.jpg" /> Figuur 4. Vergelijking tussen Digital-Image-Analysis-Direct-Counting-test (onderste paneel) en Parasite-Rescue-Transformatie-test (bovenste paneel). De macrofaag: promastigote van 1:10 leverde optimale infectie. Beide gaf vergelijkbare resultaten. De parasiet-rescue assay toonde enkele achtergrondwaarden. Elke staaf geeft gemiddelde van dubbele waarden. <img alt="Figuur 5" src = &quot;/ files/ftp_upload/4054/4054fig5.jpg&quot; /&gt; Figuur 5 THP1-cellen geïnfecteerd met Leishmania promastigoten door verschillende THP1:. Promastigote ratio. De kwantitatieve resultaten aantal amastigotes/100 THP1 cellen zijn weergegeven in Figuur 4. <img alt="Figuur 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig6.jpg" /> Figuur 6. Digitale beelden (TL + DIC) van THP1-cellen geïnfecteerd met Leishmania donovani amastigoten na behandeling met standaard anti-leishmanial geneesmiddelen voor verschillende perioden. De resultaten werden gekwantificeerd als het aantal amastigotes/100 THP1-cellen en gebruikt om het percentage groei berekenen vergeleken met onbehandelde en de IC50 waarden te bepalen. <img alt="Figuur 7" fo: Content-width = &quot;4.75in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/4054/4054fig7highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4054/4054fig7.jpg&quot; /&gt; Figuur 7. Vergelijking van Digital-Image-Analysis-Direct-Tellen-test en Parasite-Rescue-Transformatie-test voor anti-leishmanial drug screening (Amophotericin B). De geïnfecteerde macrofagen behandeld met verschillende concentraties van standaard anti-leishmanial geneesmiddel voor verschillende perioden. IC 50 (pg / ml) waarden werden berekend op basis van de dosis-respons curve van Excelfit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4054/4054fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 8" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig8.jpg" /> Figuur 8. Vergelijking van Digital-Image-Analysis-Direct-Tellen-test en Parasite-Rescue-Transformatie-Assay voor eennti-leishmanial drug screening (Pentamidine). De geïnfecteerde macrofagen behandeld met verschillende concentraties van standaard anti-leishmanial geneesmiddel voor verschillende perioden. IC50 (ug / ml) waarden werden berekend uit de dosis respons curven Excelfit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4054/4054fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier om groter bedrag bekijken</a> . <img alt="Figuur 9" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig9.jpg" /> Figuur 9. Vergelijking van Digital-Image-Analysis-Direct-Tellen-test en Parasite-Rescue-Transformatie-test voor anti-leishmanial drug screening (Mitefosine). De geïnfecteerde macrofagen behandeld met verschillende concentraties van standaard anti-leishmanial geneesmiddel voor verschillende perioden. IC50 (ug / ml) waarden werden berekend uit de dosis respons curven Excelfit.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4054/4054fig9large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"> Test Drug </td><td colspan="2"> 24 uur een </td><td colspan="2"> 48 hr een </td><td colspan="2"> 72 uur een </td><td colspan="2"> 96 uur een </td></tr><tr><td> IACA b </td><td> PRTA c </td><td> IACA b </td><td> PRTA c </td><td> IACA b </td><td> PRTA c </td><td> IACA b </td><td> PRTA c </td></tr><tr><td> Amfotericine B </td><td> 0,24 ± 0,03 </td><td> 0,17 ± 0,01 * </td><td> 0,12 ± 0,04 </td><td> 0,20 ± 0,07 </td><td> 0,06 ± 0,01 </td><td> 0,06 ± 0,01 </td><td> 0,11 ± 0,03 </td><td> 0,10 ± 0,03 </td></tr><tr><td> Pentamidine </td><td> &gt; 10 </td><td> 2,55 ± 1,16 * </td><td> 2,88 &amp; plusmn; 0,58 </td><td> 1,43 ± 0,91 </td><td> 1,24 ± 0,35 </td><td> 1,52 ± 0,16 </td><td> 0,71 ± 0,63 </td><td> 0,98 ± 0,33 </td></tr><tr><td> Miltefosine </td><td> 0,38 ± 0,02 </td><td> 0,19 ± 0,08 * </td><td> 0,24 ± 0,06 </td><td> 0,30 ± 0,08 </td><td> 0,36 ± 0,02 </td><td> 0,16 ± 0,06 </td><td> 0,21 ± 0,15 </td><td> 0,17 ± 0,10 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Vergelijking van de Digital-Image-Analysis-Direct-Tellen-test en Parasite-Rescue-Transformatie-test voor anti-leishmanial drug discovery. De geïnfecteerde macrofagen behandeld met verschillende concentraties van standaard anti-leishmanial geneesmiddel voor verschillende perioden. IC50 (ug / ml) waarden werden berekend uit de dosis respons curven Excelfit (figuren 7-9) een uur na behandeling met geneesmiddelen;. IACA b = Image Analysis and Direct CountingAssay, c PRTA = Parasiet-Rescue en Transformatie Assay. Opgegeven waarden zijn IC50 (concentratie van het geneesmiddel die 50% inhibitie in parasiet groei) ug / ml en zijn het gemiddelde ± SD van ten minste drie experimenten. * Statistisch verschillend (&lt;0,05) vergeleken met IC 50-waarden met IACA.

Een parasiet-rescue en transformatie test met geïnfecteerde cellen THP1<em&gt; In vitro</em&gt; Met<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Is geoptimaliseerd voor anti-leishmanial drug discovery. De bepaling omvat differentiatie van cellen THP1, infectie met promastigoten behandeling met testgeneesmiddelen, gecontroleerde lysis van de geïnfecteerde macrofagen, redding van amastigoten, transformatie naar promastigoten en controle promastigote groei en proliferatie met een fluorometrische assay.

Een Parasiet Rescue and Transformation Assay voor antileishmania Screening tegen intracellulaire<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoten in THP1 Human acute monocytische leukemiecellijn

Leishmaniasis is een van de meest verwaarloosde ziekten ter wereld die grotendeels de armste van de armen treft, voornamelijk in ontwikkelingslanden. Meer dan 350 miljoen ...

Het algemene doel van de hier gedemonstreerde experimentele technologie is het screenen van verbindingen tegen de groei en proliferatie vanHet intracellulaire amastigoot-stadium van Leishmania donovani, het veroorzakende agens van viscerale leishmaniasis, met als hoofddoel het ontdekken van nieuwe geneesmiddelen voor de behandeling van leishmaniasis. Eerst worden THP-1 menselijke acute monocytaire leukemiecellen in vitro gedifferentieerd tot adherente macrofagen; de gedifferentieerde THP-1 cellen worden vervolgens geïnfecteerd met promastigoten van de Leishmania donovani-parasieten, wat de invasie van de promastigoten in de THP-1 macrofagen, hun transformatie naar amastigoten en intracellulaire proliferatie mogelijk maakt. Vervolgens worden de met Leishmania geïnfecteerde THP-1 macrofagen blootgesteld aan testverbindingen en standaardgeneesmiddelen, waarna ze ondergaan aan gecontroleerde lysis, herstel van amastigoten, transformatie van residuele amastigoten naar promastigoten en kwantificering van promastigoten via colorimetrische celgroeianalyses.Verkregen resultaten die het anti-mania effect van testverbindingen en standaardgeneesmiddelen op intracellulaire groei en proliferatie tonen, gebaseerd op kwantificering van intracellulaire am master goats. Lemanis is een grote wereldwijde bedreiging voor de gezondheid, vooral in tropische gebieden ter wereld. Er is dringend behoefte aan nieuwe geneesmiddelen met betere therapeutische profielen om deze ziekte te behandelen.Wij bij het National Center for Natural Products Research hebben een multidirectionaal programma gestart voor de ontdekking van nieuwe behandelingen voor tropische parasitaire ziekten. In tegenstelling tot de Rogen- en microscopische beeldanalyse-assays, die mogelijk geen onderscheid maken tussen levende en dode msst-goederen, meet deze SA alleen de levende intracellulaire MST-goederen. We hebben een assay voor parasietredding en -transformatie geoptimaliseerd met gedifferentieerde TP-one-cellen die in vitro zijn geïnfecteerd met de liman, voor het screenen van zuivere verbindingen en extracten van natuurproducten en het bepalen van de effectiviteit tegen intracellulaire limania.De experimentele details van deze assay worden gedemonstreerd door dhr. Ra, de onderzoeks- en ontwikkelingsbioloog in mijn laboratorium die deze assay uitvoert, en dhr. RA Sahu, die eveneens als onderzoeks- en ontwikkelingsbioloog in mijn laboratorium werkt. De assay bestaat uit vier basisstappen. Stap één is het uitplaten en de terminale differentiatie van THP one-cellen.Stap twee is de in vitro infectie van gedifferentieerde TP one cellen met L. donovani promastigoten. Stap drie is de behandeling van Leishmania-geïnfecteerde macrofagen met de testverbindingen of standaardgeneesmiddelen. En stap vier is de kwantificering van de groei en proliferatie van Leishmania-parasieten met microscopische beeldanalyse of assays voor parasietredding en transformatie.Oogst een vier dagen oude cultuur van THP-1 macrofagen en bereid een celsuspensie voor in RPMI aangevuld met 10% hitte-geactiveerd FBS met een concentratie van 2,5 × 10⁵ cellen per milliliter. Voeg 25 ng/mL PMA toe aan de cellen om differentiatie te induceren. Draag vervolgens 200 µL celsuspensie over naar elke well van een 96-well plaat en naar elke kamer van een 16-kamer glazen slide. Zodra de cellen zijn uitgeplaat, worden de slide en de 96-well plaat in een incubator bij 37 °C geplaatst en worden de cellen overnight geïncubeerd om een bijna volledige cellulaire differentiatie mogelijk te maken.Voor de infectie wordt een vijf tot zes dagen oude ProMaster-geitenparasietcultuur gebruikt, waarin de meeste organismen zich in het infectieuze metacyclische stadium bevinden. In tegenstelling tot de procyclische ProMaster-geiten, die korte ellipsoïde cellen zijn met een korte flagel, zwak motiel en vaak in rozetten worden aangetroffen, kunnen de infectieuze metacyclische organismen worden herkend aan hun lange cilindrische vorm en hoge motiliteit.Oogst de parasieten en bereid een ProMaster geitensuspensie voor van 2,5 × 10⁶ parasieten per milliliter in 2% F-B-S-R-P-M-I. Haal de gedifferentieerde THP-1 celculturen uit de incubator, waarbij zowel de 96-wells plaat als het glazen objectglas worden verwerkt. Verwijder gelijktijdig het supernatant van de culturen en was de cellen vervolgens door vooraf verwarmd serumvrij medium toe te voegen. Verwijder het serumvrije medium en vervang dit door 200 µL per well ProMaster geitensuspensie, om een ratio van 10 parasieten per THP-1 cel te bereiken.Voeg voor de controleputjes 200 µL 2%F-P-S-R-P-M-I medium toe in plaats van de parasitensuspensie. Na toevoeging van de parasieten worden de coculturen 24 uur bij 37 °C geïncubeerd om de infectie vanuit de voorraadoplossingen van het te testen geneesmiddel te laten plaatsvinden. Bereid zes seriële verdunningen van één tot vijf in 2%F-B-S-R-P-M-I, zodanig dat de concentratie van elke verdunning tweemaal de beoogde uiteindelijke testconcentratie is.Concentraties van standaard antimalariageneesmiddelen zoals amphotericin b, pentamidine, melter, Fosse en natriumstibgluconaat kunnen als controles worden gebruikt voordat de geneesmiddelen aan de coculturen worden toegevoegd. Was de TP one-cellen in de plaat en op het glaasje herhaaldelijk zoals eerder beschreven. Was de cellen ten minste vijf keer om alle niet-geïnternaliseerde ProMaster goats te verwijderen.Voeg vervolgens 100 µL 2%F-B-S-R-P-M-I en 100 µL van elke drug-oplossing toe aan elke well of kamer, en incubeer de plaat en het objectglas na de drug-behandeling 48 uur bij 37 °C. Was de kamer en het objectglas drie keer met serumvrij medium.Verwijder de plastic kamers van de objectglas en fixeer de cellen door het objectglas 30 seconden in methanol te dompelen. Plaats het objectglas in een biohazard-kast met laminaire luchtstroom om het te laten drogen. Bereid ondertussen een vijf x oplossing van cyber green.Zodra het preparaat droog is, wordt het ondergedompeld in cyber green om het cellulaire en parasitaire DNA te kleuren. Incubeer het monster 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Was het preparaat na de kleuringsstap met water en laat het drogen.Plaats met behulp van monteermedium een glazen dekglas over het preparaat. Observeer vervolgens de monsters met een fluorescentiemicroscoop en leg beelden vast van elke kamer; in niet-geïnfecteerde cellen is alleen de nucleus van de macrofaag zichtbaar, terwijl in geïnfecteerde cellen de nuclei en canlas van de parasiet in het cellulaire cytoplasma te zien zijn, wat wijst op de aanwezigheid van intracellulaire l Donny-parasieten.Om de infectie te kwantificeren, wordt Image J gebruikt om het percentage infectiviteit te berekenen, wat het aantal am master goat-kernen vermenigvuldigd met 100 gedeeld door het aantal macrofaagkernen voor de parasiet-rescue-assay is. Was eerst de co-cultuur in de 96-wells plaat drie keer met serumvrij RPMI-medium om de cellen te lyseren met 20 µL 0,05% S-D-S-R-P-M-I. Schud de plaat gedurende 30 seconden voor elke well.Voeg vervolgens 180 µL 10%F-B-S-R-P-M-I per well toe. De duur van de SDS-behandeling mag 30 seconden niet overschrijden om een gecontroleerde lyse van de macrofaag te verkrijgen zonder de levensvatbaarheid van de geredde master te beïnvloeden. Incubeer de plaat bij 26 °C gedurende 48 uur om transformatie en proliferatie van de geredde zichtbare master tot pro-master-geiten mogelijk te maken.Om de pro master goats te kwantificeren, voegt u 10 µL alamar blue toe aan elke put van de 96-wells plaat en incubeert u deze gedurende de nacht bij 26 °C. Na deze incubatie kwantificeert u de levende parasieten door de plaat af te lezen in een standaard fluorescentiefluorimeter. In afwezigheid van geneesmiddelen neemt het infectiepercentage toe met het aantal aanwezige master goats ten opzichte van het aantal macrofagen.Daarnaast correleert de hoeveelheid overlevende parasieten, bepaald door de rescue-assay, goed met het infectiepercentage bij toenemende concentraties amfotericine. B. Het aantal geredde parasieten neemt af op een dosisafhankelijke wijze. De parasite rescue and transformation assay kan worden samengevat met opeenvolgende microscopische beelden.Deze afbeelding toont intacte THP-1-cellen in cultuur die geïnfecteerd zijn met Leishmania amazonensis. Deze geïnfecteerde THP-1-cellen worden onderworpen aan gecontroleerde lyse om levende amastigoten te isoleren. De levende amastigoten die uit de geïnfecteerde THP-1-cellen zijn geïsoleerd, transformeren de cultuur naar promastigoten.Deze getransformeerde ProMaster-geiten groeien en prolifereren in kweek. Het totale aantal ProMaster-geiten in kweek is direct proportioneel aan het aantal levende intracellulaire oma-geiten. Deze assay is geoptimaliseerd voor de controlelicentie van limania-geïnfecteerde THV one-cellen.Het doel was om de condities voor de detergentbehandeling te optimaliseren, wat zal leiden tot een bijna volledige lysis van THV one-cellen met een minimaal effect op de TY van de rescue MST-codes. Deze stap is zeer kritisch in deze assay. De hier gedemonstreerde parasite rescue-assay kan ook worden toegepast voor het aantonen van de infectiviteit van verschillende soorten linia-parasieten die cutane of mucocutane leishman-acid veroorzaken in verschillende micro-hartcellijnen, en ook voor verschillende lenia-veldisolaten of genetisch gemanipuleerde parasietcellijnen.Zowel parasietredding als SA alsmede beeldanalyse als SA tonen vergelijkbare resultaten. Ze hebben potentieel voor automatisering en toepassing voor grootschalige screening. We hebben deze assay succesvol toegepast voor het screenen van meer dan 16 000 fracties, verkregen door high-throughput fractionering van natuurproductextracten die beschikbaar zijn in ons centrum.We hebben ook de beeldanalyse als assay geoptimaliseerd door de beelden die zijn vastgelegd onder DIC- en fluoresceïne-filters te combineren en de infectie te kwantificeren met ImageJ. ImageJ is een publiek beschikbaar, op Java gebaseerd programma voor beeldverwerking dat oorspronkelijk is ontwikkeld bij de NIH. Via deze assay zijn verschillende fracties van natuurproducten met nieuwe verbindingen geïdentificeerd als nieuwe leads voor de ontdekking van geneesmiddelen voor het maagdarmstelsel.

a-parasite-rescue-transformation-assay-for-antileishmanial-screening

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een in vivo beeldvormingssysteem wordt gebruikt om kwantitatieve metingen te genereren van muisinfecties met de Trypanosomatide protozoa Leishmania. Dit is een niet-invasieve en niet-lethale methode voor het detecteren van parasieten die luciferase tot expressie brengen in diverse weefsels gedurende het verloop van een chronische Leishmania spp. infectie.

In vivo imaging van transgene Leishmania parasieten in een Live Host

This video investigates Leishmania's virulence by treating macrophages with metacyclic promastigotes, resulting in the formation of intracellular amastigotes. The confirmation of Leishmania's virulence is achieved through nucleic acid fluorescent dye staining. This insight can contribute to the development of new therapies for leishmaniasis.

Assessment of Leishmania Virulence within Cultured Macrophages

This video demonstrates an assay to quantify the intracellular growth of parasites in bone marrow-derived macrophages (BMMs). The macrophage cells are infected with the motile and non-motile invasive stages of Leishmania, metacyclic promastigotes and amastigotes, respectively. The parasites invade the macrophages, getting internalized into a parasitophorous vacuole and multiplying inside. The intracellular parasite growth is quantified using a microscope upon fluorescently staining the...

An In Vitro Assay to Quantify the Intracellular Growth of Parasite in Macrophages

Een protocol voor het synthetiseren van peptoïden met gemengde kationische functionaliteit in dezelfde sequentie wordt gepresenteerd (lysine- en arginine-achtige monomeren). Het daaropvolgende testen van deze verbindingen tegen Leishmania mexicana, de protozoa-parasieten die cutane leishmaniasis veroorzaken, wordt ook beschreven.

Een efficiënte methode voor de synthese van peptoïden met Gemengde lysine-type / Arginine-type monomeren en evaluatie van hun anti-leishmania Activity

Alle pathogene Leishmania soorten zich bevinden en repliceren in macrofagen van hun gewervelde gastheren. Hier presenteren we een protocol om te infecteren lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen in cultuur met Leishmania, gevolgd door precieze kwantificering van intracellulaire groei kinetiek. Deze methode is handig voor het bestuderen van de afzonderlijke factoren beïnvloeden host-pathogen interactions en Leishmania virulentie.

Kwantificering van intracellulaire groei binnen macrofagen is een snel en betrouwbare methode voor de beoordeling van de virulentie van Leishmania parasieten

Hier presenteren we een samengesteld protocol om de cutane infectie van muizen met Leishmania amazonensiste evalueren. Dit is een betrouwbare methode voor het bestuderen van parasietvirulentie, waardoor een systemische weergave van de gewervelde gastheer respons op de infectie.

In Vivo Infectie met Leishmania amazonensis om parasiet virultie in muizen te evalueren

Het mechanisme geassocieerd met fagocytose bij Leishmania-infectie blijft slecht begrepen. Hier beschrijven we methoden om de vroege gebeurtenissen te evalueren die plaatsvinden tijdens leishmania-interactie met de gastheercellen.

Onderzoek naar de fagocytose van Leishmania met behulp van confocale microscopie

Hier wordt een protocol gepresenteerd met behulp van Leishmania major promastigoten om de binding, cytotoxiciteit en signalering geïnduceerd door porievormende toxines te bepalen. Een proof-of-concept met streptolysine O wordt verstrekt. Andere toxines kunnen ook worden gebruikt om de genetische mutanten die beschikbaar zijn in L. major te gebruiken om nieuwe mechanismen van toxineresistentie te definiëren.

Het ontcijferen van het moleculaire mechanisme en de functie van porievormende toxines met behulp van Leishmania major

Hier beschrijven we de methodologie die wordt gebruikt voor het genereren van L. panamensis - en L. donovani-stammen die het gen voor eGFP tot expressie brengen als een stabiel geïntegreerd transgen met behulp van het pLEXSY-systeem. Getransfecteerde parasieten werden gekloond door verdunning te beperken en klonen met de hoogste fluorescentie-intensiteit in beide soorten werden geselecteerd voor verder gebruik in medicijnscreeningtests.

Ontwikkeling van Leishmania-soortenstammen met constitutieve expressie van eGFP

Hier presenteren we een longitudinale evaluatie van goudhamsters die intraperitoneaal (IP) of via intragingivaal (IG) zijn geïnfecteerd met L. infantum-Luc door middel van bioluminescente beeldvorming en door PCR. Hamsters werden 1 dag na infectie (1 dpi), 1 week na infectie (8 dpi) en 3 weken na infectie (22 dpi) geëvalueerd en geëuthanaseerd op de 50edpi en 8 maanden na infectie.

In vivo Beeldvorming van met Leishmania infantum geïnfecteerde hamsters door gingiva-inoculatie van axenische amastigoten die luciferase tot expressie brengen

Leer een geoptimaliseerde parasiet-rescue en transformatie-assay voor antileishmaniale screening met THP1-cellen geïnfecteerd met Leishmania donovani. Deze methode kwantificeert levende intracellulaire amastigoten voor nauwkeurige bepaling van geneesmiddelwerking.

Een Parasiet Rescue and Transformation Assay voor antileishmania Screening tegen intracellulaire Leishmania donovani Amastigoten in THP1 Human acute monocytische leukemiecellijn (Video) | JoVE Journal

Een Parasiet Rescue and Transformation Assay voor antileishmania Screening tegen intracellulaire

Meer video's verkennen