Name: Immunohistochemische kleuring van B7-H1 (PD-L1) op paraffine ingebedde Slides van Pancreatic Darmkanker Tissue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Leer immunohistochemische kleuring van B7-H1 (PD-L1) op paraffine-ingebbedde weefsels van pancreaskanker. Deze methode maakt visualisatie van eiwitexpressie mogelijk om immunosuppressieve mechanismen in de tumoromgeving te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

EB, KMB, en HX dragen in gelijke mate. Dit onderzoek werd ondersteund door de NCI SPORE in Gastro Intestinale Tumoren P50 CA062924, NIH K23 CA148964, Lustgarten Foundation, Viragh Foundation, ASCO Young Investigator Award, NIH 5T32 CA0090701-28 Training Grant, Sol Goldman Pancreatic Cancer Center en National Pancreas Foundation.

B7-H1/PD-L1, een lid van de B7 familie van immuun-regulerende celoppervlakte-eiwitten, speelt een belangrijke rol in de negatieve regulatie van cel-gemedieerde immuunresponsen door de interactie met de receptor, geprogrammeerde dood 1 (PD -1) 1,2. Overexpressie van B7-H1 door tumorcellen is opgemerkt in een aantal menselijke kankers, waaronder melanoom, glioblastoma en carcinomen van de long, borst, colon, eierstok en niercellen en is aangetoond dat anti-tumor T-aantasting celimmuniteit 3-8. Onlangs heeft B7-H1 expressie door pancreatische adenocarcinoom weefsels geïdentificeerd als potentiële prognostische marker 9,10. Daarnaast is blokkade van B7-H1 in een muismodel van alvleesklierkanker blijkt een anti-tumor respons 11 produceren. Deze gegevens suggereren het belang van B7-H1 als potentieel therapeutisch doel. Anti-B7-H1 blokkade antilichamen Daarom worden getest in klinische studies voor meerdere menselijkevaste tumoren zoals melanoom en kanker van long, colon, nier, maag en pancreas 12. Om uiteindelijk kunnen de patiënten die baat hebben bij B7-H1 gerichte therapieën identificeren, is het essentieel om de correlatie tussen expressie en lokalisatie van B7-H1 en patiënt respons op behandeling met B7-H1 blokkade antilichamen te onderzoeken. Onderzoeken van de expressie van B7-H1 in menselijke pancreas adenocarcinoom weefsels door immunohistochemie zal een beter begrip van deze co-remmende signaalmolecuul bijdraagt ​​tot de onderdrukking van antitumor immuniteit in de tumor micro-omgeving. De anti-B7-H1 monoklonale antilichaam (kloon 5H1) ontwikkeld door Chen en medewerkers is aangetoond dat betrouwbare resultaten kleuring in cryosecties van meerdere soorten menselijke neoplastische weefsels 4,8, maar verkleuring van paraffine slides was een uitdaging tot onlangs 13-18. Wij hebben de B7-H1 staining protocol voor paraffine ingebedde dia&#39;s van pancreas adenocarcinoom weefsels. De B7-H1 kleuringsprotocol hier beschreven produceert consistente membraneuze en cytoplasmatische kleuring van B7-H1 met weinig achtergrond. 1. De-parafinization <ol><li> Bak schuift bij 55 ° C gedurende 20 minuten. </li><li> In een chemische afzuigkap, dompel slides in xyleen gedurende 10 minuten. </li><li> Dompel de objectglaasjes in verse xyleen gedurende 10 minuten. </li><li> Dompel de objectglaasjes in 100% ethanol gedurende 5 minuten. </li><li> Dompel de objectglaasjes in vers 100% ethanol gedurende 5 minuten. </li><li> Dompel de objectglaasjes in 95% ethanol gedurende 5 minuten. </li><li> Dompel de objectglaasjes in 80% ethanol gedurende 5 minuten. </li><li> Dompel de objectglaasjes in gedeïoniseerd water gedurende 5 minuten. </li></ol> 2. Antigen Retrieval <ol><li> Dompel de objectglaasjes in Tris-EDTA buffer (pH 9,0) en warmte in een snelkookpan 125 ° C gedurende 30 seconden, daarna 90 ° C gedurende 10 sec. </li><li> Laat dia&#39;s afkoelen gedurende 60 minuten. </li><li> Dompel de objectglaasjes in TBST gedurende 5 minuten; repetweemaal. </li></ol> 3. Kleuring <ol><li> Veeg oplossingen rond het weefsel op de dia&#39;s. Markeer een cirkel rond het weefsel met een hydrofobe pen. </li><li> Plaats de objectglaasjes in een vochtige kamer en voorkomen het drogen van het weefsel op de dia het gehele beitsen. Plaats een druppel (ongeveer 200 ul of meer van de weefselgebied volledig bedekken) van peroxidase blok binnen het hydrofobe cirkel op de dia en incubeer slides in peroxidase blok gedurende 5 minuten. </li><li> Spoel de objectglaasjes met TBST, dan plaats in TBST gedurende 5 minuten. </li><li> Plaats een druppel BLOCK ACE-blokkerende buffer op elke dia en incubeer gedurende 15 minuten. </li><li> Spoel de objectglaasjes met TBST, dan plaats in TBST gedurende 5 minuten. </li><li> Plaats een druppel Avidin oplossing op elke dia en incubeer gedurende 15 minuten. </li><li> Spoel de objectglaasjes met TBST, dan plaats in TBST gedurende 5 minuten. </li><li> Plaats een druppel biotine oplossing op elke dia en incubeer gedurende 15 minuten. </li><li> Spoel slides met TBST en vervolgens in TBST gedurende 5 minuten. </li><li> Incubeer slides met 1:1000 verdunning van muis-anti-B7-H1 monoklonale antilichaam (kloon 5H1) of een muis IgG1 κ isotype control in 200 ul TBST bij 4 ° C overnacht gedurende 22 uur + / - 1 uur. De uiteindelijke antilichaamconcentratie in TBST is 2,57 ug / ml. </li><li> Spoel de objectglaasjes met TBST, dan plaats in TBST gedurende 5 minuten. Tweemaal herhalen. </li><li> Incubeer slides met biotine geconjugeerd rat anti-muis secundair IgG1 antilichaam bij een concentratie 1:500 (in 200 pi 2% geitenserum oplossing) gedurende 30 minuten. </li><li> Spoel de objectglaasjes met TBST, dan plaats in TBST gedurende 5 minuten. Tweemaal herhalen. </li><li> Plaats een druppel streptavidine-biotine complex (moeten ten minste 30 minuten vóór gebruik) voor elke dia en incubeer gedurende 15 minuten. </li><li> Spoel de objectglaasjes met TBST, dan plaats in TBST gedurende 5 minuten. Tweemaal herhalen. </li><li> Plaats een druppel Amplification Reagent (verdund 2:1 met TBST) op elke dia en incubeer gedurende 4 min. </li><li> Spoel de objectglaasjes met TBST vervolgens in TBST gedurende 5 minuten. Tweemaal herhalen. </li><li> Plaats een druppel streptavidine-HRP op elke dia en incubeer gedurende 15 minuten. </li><li> Spoel de objectglaasjes met TBST, dan plaats in TBST gedurende 5 minuten. Tweemaal herhalen. </li><li> Plaats een druppel van 3,3-diaminobenzidine (DAB) chromogeen substraat en voor elke dia en de kleurreactie gedurende 2 minuten. </li><li> Onmiddellijk na de kleurontwikkeling, wassen dia&#39;s met ddH 2 O voor 1-2 minuten. </li><li> Incubeer dia&#39;s met een druppel hematoxyline gedurende 90 sec. </li><li> Wassen met ddH 2 O voor 1-2 minuten. </li><li> Wassen met zeep kraanwater voor 1-2 minuten. </li><li> Wassen met ddH 2 O voor 1-2 minuten. </li></ol> 4. Uitdroging en montage <ol><li> Dompel de slides in 80% ethanol gedurende 3 minuten. </li><li> Dompel de slides in 95% ethanol gedurende 3 minuten. </li><li> Dompel de glaasjes in 100% ethanol gedurende 5 minuten. Herhalen. </li><li> Dompel de objectglaasjes in xyleen gedurende 5 minuten. Herhalen. </li><li> Een druppelCytoseal 60 tot de dia en plaats het dekglaasje. </li></ol> Tabel 1 vermeldt de reagentia gebruikt in de hierboven beschreven procedures.

<ol><li>Flies, D. B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+B7s%3A+playing+a+pivotal+role+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity.</a> J. Immunother. 30, 251-260 (2007).</li>
<li>Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1%2C+a+third+member+of+the+B7+family%2C+co-stimulates+T-cell+proliferation+and+interleukin-10+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion.</a> Nat. Med. 5, 1365-1369 (1999).</li>
<li>Curiel, T. J., Wei, S., Dong, H., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Krzysiek, R., Knutson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+improves+myeloid+dendritic+cell-mediated+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity.</a> Nat. Med. 9, 562-567 (2003).</li>
<li>Dong, H., Strome, S. E., Salomao, D. R., Tamura, H., Hirano, F., Flies, D. B., Roche, P. C., Lu, J., Zhu, G. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDong%2C+H+%22Nat.+Med%22">Nat. Med</a>. 8, 793-800 (2002).</li>
<li>Dong, H., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+pathway+and+its+role+in+the+evasion+of+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Med.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity.</a> J. Mol. Med. (Berl). 81, 281-287 (2003).</li>
<li>Strome, S. E., Dong, H., Tamura, H., Voss, S. G., Flies, D. B., Tamada, K., Salomao, D., Cheville, J., Hirano, F., Lin, W., Kasperbauer, J. L., Ballman, K. V., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+blockade+augments+adoptive+T-cell+immunotherapy+for+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">B7-H1 blockade augments adoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma.</a> Cancer Res. 63, 6501-6505 (2003).</li>
<li>Hirano, F., Kaneko, K., Tamura, H., Dong, H., Wang, S., Ichikawa, M., Rietz, C., Flies, D. B., Lau, J. S., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+and+PD-1+by+monoclonal+antibodies+potentiates+cancer+therapeutic+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity.</a> Cancer Res. 65, 1089-1096 (2005).</li>
<li>Thompson, R. H., Gillett, M. D., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Webster, W. S., Krejci, K. G., Lobo, J. R., Sengupta, S., Chen, L., Zincke, H., Blute, M. L., Strome, S. E., Leibovich, B. C., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Costimulatory+B7-H1+in+renal+cell+carcinoma+patients%3A+Indicator+of+tumor+aggressiveness+and+potential+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17174-17179 (2004).</li>
<li>Geng, L., Huang, D., Liu, J., Qian, Y., Deng, J., Li, D., Hu, Z., Zhang, J., Jiang, G., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+up-regulated+expression+in+human+pancreatic+carcinoma+tissue+associates+with+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">B7-H1 up-regulated expression in human pancreatic carcinoma tissue associates with tumor progression.</a> J. Cancer Res. Clin. Oncol. 134, 1021-1027 (2008).</li>
<li>Loos, M., Giese, N. A., Kleeff, J., Giese, T., Gaida, M. M., Bergmann, F., Laschinger, M., WB, M., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+regulation+of+the+costimulatory+molecule+B7-H1+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H1 in pancreatic cancer.</a> Cancer Lett. 268, 98-109 (2008).</li>
<li>Okudaira, K., Hokari, R., Tsuzuki, Y., Okada, Y., Komoto, S., Watanabe, C., Kurihara, C., Kawaguchi, A., Nagao, S., Azuma, M., Yagita, H., Miura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+or+B7-DC+induces+an+anti-tumor+effect+in+a+mouse+pancreatic+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 or B7-DC induces an anti-tumor effect in a mouse pancreatic cancer model.</a> Int. J. Oncol. 35, 741-749 (2009).</li>
<li>Wang, S., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+cancer+therapies+targeting+CD137+and+B7-H1%2FPD-1+cosignal+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of cancer therapies targeting CD137 and B7-H1/PD-1 cosignal pathways.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 344, 245-267 (2011).</li>
<li>Thompson, R. H., Webster, W. S., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Leibovich, B. C., Kuntz, S. M., Sengupta, S., Kwon, E. D., Blute, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+glycoprotein+blockade%3A+a+novel+strategy+to+enhance+immunotherapy+in+patients+with+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">B7-H1 glycoprotein blockade: a novel strategy to enhance immunotherapy in patients with renal cell carcinoma.</a> Urology. 66, 10-14 (2005).</li>
<li>Thompson, R. H., Kuntz, S. M., Leibovich, B. C., Dong, H., Lohse, C. M., Webster, W. S., Sengupta, S., Frank, I., Parker, A. S., Zincke, H., Blute, M. L., Sebo, T. J., Cheville, J. C., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+B7-H1+is+associated+with+poor+prognosis+in+renal+cell+carcinoma+patients+with+long-term+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up.</a> Cancer Res. 66, 3381-3385 (2006).</li>
<li>Thompson, R. H., Dong, H., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+B7-H1+expression+in+clear+cell+carcinoma+of+the+kidney+for+prognostication+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Implications of B7-H1 expression in clear cell carcinoma of the kidney for prognostication and therapy.</a> Clin. Cancer Res. 13, 709s-715s (2007).</li>
<li>Karim, R., Jordanova, E. S., Piersma, S. J., Kenter, G. G., Chen, L., Boer, J. M., Melief, C. J., vander Burg, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-expressed+B7-H1+and+B7-DC+in+relation+to+PD-1%2B+T-cell+infiltration+and+survival+of+patients+with+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma.</a> Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009).</li>
<li>Inman, B. A., Sebo, T. J., Frigola, X., Dong, H., Bergstralh, E. J., Frank, I., Fradet, Y., Lacombe, L., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+%28B7-H1%29+expression+by+urothelial+carcinoma+of+the+bladder+and+BCG-induced+granulomata%3A+associations+with+localized+stage+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression.</a> Cancer. 109, 1499-1505 (2007).</li>
<li>Brahmer, J. R., Drake, C. G., Wollner, I., Powderly, J. D., Picus, J., Sharfman, W. H., Stankevich, E., Pons, A., Salay, T. M., McMiller, T. L., Gilson, M. M., Wang, C., Selby, M., Taube, J. M., Anders, R., Chen, L., Korman, A. J., Pardoll, D. M., Lowy, I., Topalian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+single-agent+anti-programmed+death-1+%28MDX-1106%29+in+refractory+solid+tumors%3A+safety%2C+clinical+activity%2C+pharmacodynamics%2C+and+immunologic+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates.</a> J. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 (2010).</li>
<li>Wang, L., Ma, Q., Chen, X., Guo, K., Li, J., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+of+B7-H1+and+B7-1+expressions+in+pancreatic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Clinical significance of B7-H1 and B7-1 expressions in pancreatic carcinoma.</a> World J. Surg. 34, 1059-1065 (2010).</li>
<li>Nomi, T., Sho, M., Akahori, T., Hamada, K., Kubo, A., Kanehiro, H., Nakamura, S., Enomoto, K., Yagita, H., Azuma, M., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+therapeutic+potential+of+the+programmed+death-1+ligand%2Fprogrammed+death-1+pathway+in+human+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer.</a> Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157 (2007).</li>
<li>Taube, J. M., Anders, R. A., Young, G. D., Xu, H., Sharma, R., McMiller, T. L., Chen, S., Klein, A. P., Pardoll, D. M., Topalian, S. L., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+inflammatory+response+with+B7-h1+expression+in+human+melanocytic+lesions+supports+an+adaptive+resistance+mechanism+of+immune+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape.</a> Sci. Transl. Med. 4, 127ra37(2012).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Immunohistochemische kleuring van B7-H1 op cryocoupes gerapporteerd in eerdere studies voor verschillende kankers 3,4. Echter, klinische tumormonsters meestal zijn alleen beschikbaar in de vorm van in paraffine ingebedde blokken. Het monoklonale antilichaam 5H1 is onlangs succesvol toegepast bij de kleuring van paraffine ingebed tumorweefsel zoals niercelcarcinoom, baarmoederhalskanker, blaaskanker en melanoom 13-18. B7-H1 kleuring op paraffine ingebedde 9,19 of 20 cryostat se...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> CSA-systeem </td><td> Dako </td><td> K1500 </td><td> Inclusief de volgende reagentia die in het protocol: peroxidase block, streptavidine-biotine complex, sterkingsreagens, streptavidine-HRP, en DAB substraat en chromogeen </td></tr><tr><td> Avidine / biotine Blocking Kit </td><td> Vector </td><td> SP-2001 </td><td></td></tr><tr><td> Blokkeren ACE </td><td> Serotec </td><td> BUF029 </td><td></td></tr><tr><td> Biotine anti-muis IgG1 </td><td> BD </td><td> 553441 </td><td></td></tr><tr><td> Muis IgG1 K isotypecontrole </td><td> eBioscience </td><td> 14-4714-85 </td><td></td></tr><tr><td> TBS (Tris-gebufferde zoutoplossing), 10X </td><td> Cellgro </td><td> 46-012 CM- </td><td> 10xTBS bevat 80 g / L NaCl en 24,2 g / L Tirs; Verdund tot 1X met ddH2O voor wasbeurten; </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1379 </td><td> 1 ml toegevoegd aan 1 L 1X TBS te maken TBST </td></tr><tr><td> Target Retrieval, 20x </td><td> Celerus Wave </td><td> 014-3000-000 </td><td> Verdund tot 1x met ddH 2 O </td></tr><tr><td> 190 Proof Ethyl Alcohol </td><td> Pharmco-Aaper </td><td> 111000190 </td><td></td></tr><tr><td> 200 Proof Ethyl Alcohol </td><td> PHARMO-Aaper </td><td> 111000200 </td><td></td></tr><tr><td> Xyleen </td><td> VWR </td><td> 95057-827 </td><td></td></tr><tr><td> Hematoxylin </td><td> Richard-Allan Wetenschappelijke </td><td> 72804 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> Richard-Allan Wetenschappelijke </td><td> 8,310-4 </td><td></td></tr><tr><td> Dekglaasjes </td><td> Corning </td><td> 2940-245 </td><td></td></tr><tr><td> Bevochtigingskamer </td><td> Sigma </td><td> H6644 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel 1. Reagentia en apparatuur. </td></tr></tbody></table>

immunohistochemische kleuring van b7-h1 (pd-l1) op paraffine ingebedde slides van pancreatic darmkanker tissue

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1/PD-L1, een lid van de B7 familie van immuun-regulerende celoppervlakte-eiwitten, speelt een belangrijke rol in de negatieve regulatie van cel-gemedieerde immuunresponsen door de interactie met de receptor, geprogrammeerde dood 1 (PD -1) 1,2. Overexpressie van B7-H1 door tumorcellen is opgemerkt in een aantal menselijke kankers, waaronder melanoom, glioblastoma en carcinomen van de long, borst, colon, eierstok en niercellen en is aangetoond dat anti-tumor T-aantasting celimmuniteit 3-8. Onlangs heeft B7-H1 expressie door pancreatische adenocarcinoom weefsels geïdentificeerd als potentiële prognostische marker 9,10. Daarnaast is blokkade van B7-H1 in een muismodel van alvleesklierkanker blijkt een anti-tumor respons 11 produceren. Deze gegevens suggereren het belang van B7-H1 als potentieel therapeutisch doel. Anti-B7-H1 blokkade antilichamen worden dan ook getest in klinische studies voor muldere humane vaste tumoren zoals melanoom en kanker van long, colon, nier, maag en pancreas 12. Om uiteindelijk kunnen de patiënten die baat hebben bij B7-H1 gerichte therapieën identificeren, is het essentieel om de correlatie tussen expressie en lokalisatie van B7-H1 en patiënt respons op behandeling met B7-H1 blokkade antilichamen te onderzoeken. Onderzoeken van de expressie van B7-H1 in menselijke pancreas adenocarcinoom weefsels door immunohistochemie zal een beter begrip van deze co-remmende signaalmolecuul bijdraagt ​​tot de onderdrukking van antitumor immuniteit in de tumor micro-omgeving. De anti-B7-H1 monoklonale antilichaam (kloon 5H1) ontwikkeld door Chen en medewerkers is aangetoond dat betrouwbare resultaten kleuring in cryosecties van meerdere soorten menselijke neoplastische weefsels 4,8, maar verkleuring van paraffine slides was een uitdaging tot onlangs 13-18. We hebben devweggelopen van de B7-H1 kleuringsprotocol voor paraffine ingebedde dia&#39;s van pancreas adenocarcinoom weefsels. De B7-H1 kleuringsprotocol hier beschreven produceert consistente membraneuze en cytoplasmatische kleuring van B7-H1 met weinig achtergrond.

Een succesvolle immunohistochemische kleuring van B7-H1 demonstreren de heterogene expressie van B7-H1 (bruin signalen DAB kleurontwikkeling) in de pancreas adenocarcinoom. Sommige pancreas adenocarcinoom cellen voornamelijk membraneuze expressie van B7-H1 (Figuur 1A) terwijl anderen ofwel overwegend cytoplasmatische expressie van B7-H1 of weinig expressie van B7-H1 (figuren 2 en 3). Normale alvleesklierductuscellen epithelium expressie weinig B7-H1 (figuur 4). Kleuren ...

B7-H1 (PD-L1) en de binding aan PD-1 een grote tumor geïnduceerde immunosuppressieve signaal in de tumor micro-omgeving. Een immunohistochemische kleuring techniek om de expressie en lokalisatie van B7-H1 in pancreas adenocarcinoom karakteriseren wordt hier beschreven.

Immunohistochemische kleuring van B7-H1 (PD-L1) op paraffine ingebedde Slides van Pancreatic Darmkanker Tissue

B7-H1/PD-L1, een lid van de B7-familie van immuunregulerende celoppervlakte-eiwitten, speelt een belangrijke rol bij de negatieve regulatie van celgemedieerde ...

Het algemene doel van deze procedure is om immunohistochemische kleuringstechnieken te gebruiken om de expressie van B seven H one PD L one te evalueren op paraffine-insluitingen van menselijk pancreasadenocarcinoomweefsel. Dit wordt bereikt door eerst de paraffine te verwijderen en de gesneden weefselcoupes te rehydrateren. De tweede stap van de procedure is antigeenherstel, waarbij een snelkookpan wordt gebruikt om het weefsel te kleuren.Een antilichaamkleuringsprocedure wordt gevolgd door stappen voor signaalversterking en DAB-kleurontwikkeling. De laatste stappen bestaan uit het dehydreren en inklappen van het weefsel. Zodra dit voltooid is.Microscopie en beeldanalyse kunnen worden gebruikt om membraangebonden en cytoplasmatisch B7-H1 te visualiseren. Dit kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het onderzoek naar pancreasendocrinocarcinoom door een beter inzicht te geven in hoe B7-H1/BTL1 bijdraagt aan de onderdrukking van de antitumorimmuniteit in de micro-omgeving van de tumor. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals kleuring op cryosneden, is dat deze is geoptimaliseerd voor gebruik met paraffine-ingebedde weefselsneden, die vaak gemakkelijker verkrijgbaar en eenvoudiger te bewaren zijn.Betrouwbare antilichaamskleuring op coupes is niet mogelijk zonder de paraffine eerst te verwijderen. Om coupes met in paraffine ingebed weefsel voor te bereiden, worden de coupes eerst 20 minuten gebakken bij 55 °C. Vervolgens worden in een zuurkast zeven opeenvolgende chemische baden gebruikt om de paraffine te verwijderen; dompel de coupes eerst 10 minuten onder in xyleen.Dompel de objectglazen vervolgens gedurende 10 minuten onder in een tweede vers xyleenbad. Dompel de objectglazen daarna onder in 100% ethanol gedurende vijf minuten. Dompel de objectglazen tot slot nogmaals gedurende vijf minuten onder in verse, 100% ethanol.Vijfde, dompel de preparaten vijf minuten onder in 95% ethanol. Zesde, dompel de preparaten vijf minuten onder in 80% ethanol. Ten slotte worden de preparaten vijf minuten gereinigd met gedeïoniseerd water.Zodra de paraffine is verwijderd, is het vervolgens noodzakelijk om het antigeen beschikbaar te maken. Dompel de objectglazen eerst onder in Tris EDTA-buffer. Verhit de objectglazen nu in een snelkookpan met een programma van twee stappen.Verwarm ze eerst 30 seconden bij 125 °C. Verwarm ze vervolgens 10 seconden bij 90 °C. Zet de objectglazen daarna opzij om af te koelen tot kamertemperatuur.Laat de objectglazen een uur afkoelen en was ze vervolgens twee keer met TBST, vijf minuten per bad. De objectglazen kunnen nu worden gekleurd. Begin met het droogdeppen van de TBST-oplossing rondom het weefsel en markeer vervolgens met een hydrofobe pen een cirkel rondom het weefsel.Voorkom gedurende deze procedure dat het weefsel uitdroogt door de objectglazen in een bevochtigingskamer te bewaren. Wanneer de glazen niet in een bad liggen, brengt u één druppel peroxidaseblok aan binnen de hydrofobe cirkel op het objectglas. Wacht vijf minuten en spoel de peroxidase af met TBST.Bad daarna de objectglazen vijf minuten in TBST. Haal de objectglazen uit de oplossing en schud het overtollige TBST voorzichtig eraf. Plaats nu één druppel CE-blokkeringsbuffer op elk objectglas en incubeer deze 15 minuten bij kamertemperatuur.Reinig de objectglazen door ze af te spoelen en vijf minuten te laten weken in TBST. Plaats vervolgens één druppel Vidan-oplossing op elk objectglas en wacht 15 minuten. Verwijder de AVADON met hetzelfde spoel- en weekregime in TBST.Breng nu biotine aan. Wacht vijf minuten en reinig de objectglazen opnieuw met TBST. Incubeer de objectglazen vervolgens met een verdunning van een muis monoklonaal antilichaam of een controle-antilichaam.Laat beide antilichamen in TBST 22 uur lang conjugeren bij vier graden Celsius. Was de objectglazen de volgende dag drie keer met TBST, zoals eerder beschreven. Elke wasbeurt bestaat uit een spoeling met TBST en een bad van vijf minuten.Dit drievoudige wasregime wordt meerdere keren herhaald tijdens het uitwassen van het primaire antilichaam. Bereid de STR titin Bio ITIN complex-oplossing. Deze dient ten minste 30 minuten voor gebruik te worden bereid.Incubeer de objectglazen nu gedurende 30 minuten met een biotinyl-geconjugeerd geiten anti-US secundair antilichaam in een geitenserumoplossing. Bereid tijdens deze incubatie de DAB-substraat CHROMOGEN-oplossing volgens de instructies van de DACO-kit. De oplossing kan tot acht uur bij vier graden in het donker worden bewaard.Voer na de incubatie de drievoudige TBST-wasbeurt uit. Breng vervolgens één druppel strippin biotin complex aan. Incubeer de glaasjes 15 minuten en was de glaasjes daarna drie keer met TBST.Breng vervolgens een druppel amplificatiereagens aan op elk objectglas. Wacht vier minuten en was de objectglazen drie keer met TBST. Nadat het amplificatiereagens is weggewassen, voegt u een druppel streptavidine-HRP toe aan elk objectglas en incubeert u deze gedurende 15 minuten.Voer vóór het vervolg nogmaals een drievoudige wasbeurt met TBST uit. Nu volgt de meest gevoelige stap van de procedure. Voeg één druppel DAB-substraat CHROMOGEN met substraat waterstofperoxide toe aan een objectglas en begin de kleurontwikkeling te observeren, het DAB-substraat.De ontwikkeltijd van het CHROMOGEEN is doorgaans twee minuten, maar we bewaken de ontwikkeling routinematig onder een microscoop om een optimale kleuring te garanderen. Om een minimale achtergrond bij elke kleuringsronde te waarborgen, voegen we één slide van een vorige batch en één tonsil-slide toe als positieve controles. Was de slide onmiddellijk na voltooiing in water, niet in TBST.Incubeer het preparaat met één druppel hematine gedurende 90 seconden. Was het preparaat onmiddellijk met gedestilleerd gedeïoniseerd water, gevolgd door zeepachtig kraanwater en vervolgens opnieuw met gedestilleerd gedeïoniseerd water. Hiermee is de kleuringsprocedure voltooid.Zodra alle coupes zijn gekleurd, wordt een ethanolreeks gebruikt om de coupes te dehydrateren voordat ze worden gemonteerd. Ten eerste worden de coupes drie minuten lang ondergedompeld in 80% ethanol. Ten tweede worden de coupes drie minuten lang ondergedompeld in 95% ethanol.Dompel de objectglazen voor het derde en vierde bad vijf minuten onder in 100% ethanol. Voor het vijfde en zesde bad dompelt u de objectglazen vijf minuten onder in xyleen. Voeg tot slot één druppel per hoeveelheid toe aan elk objectglas en breng voorzichtig een dekglas aan.De coupes zijn nu klaar voor immunohistochemische kleuring via microscopie; B7-H1 toonde een heterogene expressie van B7-H1 in het pancreasadenocarcinoom. Deze zijn zichtbaar als bruin door de DAB-kleurontwikkeling. Sommige cellen van het pancreasadenocarcinoom vertonen voornamelijk membraaneexpressie van B7-H1, terwijl andere voornamelijk cytoplasmatische expressie van B7-H1 vertonen of weinig expressie van B7-H1. Normaal pancreasductepitheel vertoonde weinig B7-H1-kleuring. Kleuring met een muis IgG1-kappa isotoopcontrole-antilichaam in plaats van het anti-B7-H1-antilichaam produceerde zeer weinig achtergrondkleuring. Eenmaal beheerst kan deze techniek in zeven uur worden uitgevoerd, verspreid over twee dagen met een incubatie van 22 uur overnacht, mits correct uitgevoerd na deze ontwikkeling.Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers in het veld van de oncologie om B seven H one PD L one-signalering in andere maligniteiten te onderzoeken.

immunohistochemical-staining-b7-h1-pd-l1-on-paraffin-embedded-slides

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Deze video demonstreert de procedures voor de karakterisering van humane pancreatische eilandjes met hematoxyline en eosine (H &amp; E) en immunohistochemie (IHC). Pancreas delen van het hoofd, lichaam en staart regio's worden gekleurd door zowel H &amp; E en IHC te eilandje endocriene samenstelling (insuline, glucagon, en pancreas polypeptide), cel-replicatie (Ki67) en inflammatoire infiltraten (H &amp; E, CD3) te bepalen. De uncinate regio is gelokaliseerd met behulp van IHC voor pancreas...

Kleuring Protocols for Human pancreatische eilandjes

Hier presenteren we een protocol bij afbeelding menselijke alvleesklier secties in drie dimensies (3D) met behulp van geoptimaliseerde passieve methoden wissen. Dit manuscript toont deze procedures voor de passieve optische clearing gevolgd door meerdere immunofluorescentie kleuring ter identificatie van de belangrijkste elementen van de autonome en zintuiglijke neurale netwerken innervating menselijke eilandjes.

Hoge resolutie 3D beeldvorming van het Neuro-insulaire netwerk van menselijke alvleesklier

De experimentele procedure op de immunophenotyping van lymfkliertest orthotopic PDAC homografts is gericht op de profilering van de tumor immuno-communicatie. Tumoren zijn orthotopically geïmplanteerd via chirurgie. Tumoren van 200 – 600 mm3 in grootte werden geoogst en losgekoppeld om te bereiden eencellige schorsingen, gevolgd door multi immuun marker FACS analyse met behulp van verschillende fluorescently gelabelde antilichamen.

Immunophenotyping van Orthotopic Homograft (Syngeneic) van de alvleesklier ductaal adenocarcinoom lymfkliertest primaire KPC door Stroom Cytometry

Ex vivo alvleesklier islet studies zijn belangrijk voor onderzoek naar diabetes. Bestaande technieken om te studeren van gekweekte eilandjes in hun oorspronkelijke 3-dimensionale architectuur zijn zelden gebruikte, tijdrovend en inefficiënt. Dit werk beschrijft een nieuwe, eenvoudige en efficiënte methode voor het genereren van kwalitatief hoogwaardige paraffine secties van hele gekweekte eilandjes.

Alvleesklier Islet insluiten voor paraffine secties

Een gedetailleerd protocol voor een zes-marker multiplex immunofluorescentie paneel is geoptimaliseerd en uitgevoerd, met behulp van een geautomatiseerde stainer voor meer consistente resultaten en een kortere tijd van de procedure. Deze aanpak kan direct worden aangepast door elk laboratorium voor immuno-oncologie studies.

Geautomatiseerde Multiplex immunofluorescentie paneel voor Immuno-oncologie Studies over formaline-vaste Carcinoma weefsel Specimens

Hier presenteren we een protocol om het implantaat van borstkankercellen in de borstklier vet pad in een eenvoudige, minder invasief, en gemakkelijk te bedienen manier, en deze orthotopic borst kanker muismodel met een juiste borstklier vet pad omgeving kan worden gebruikt voor het onderzoeken van verschillende aspecten van kanker.

Orthotopic injectie van borstkankercellen in de borstklier vet Pad muizen

De in vivo immunofluorescentie lokalisatie (IVIL)-methode kan worden gebruikt om in vivo biodistributie van antilichamen en antilichaam conjugaten voor oncologische doeleinden in levende organismen te onderzoeken met behulp van een combinatie van in vivo tumor targeting en ex vivo-immunokleuring Methoden.

In vivo immunofluorescentie lokalisatie voor de beoordeling van therapeutische en diagnostische antilichamen Biodistribution in kankeronderzoek

Dit experimentele protocol beschrijft en optimaliseert een multiplex immunohistochemie (IHC) kleuringsmethode, voornamelijk door de incubatieomstandigheden van eenkanaals antilichamen te optimaliseren en de instellingen van antilichamen en kanalen aan te passen om de problemen van autofluorescentie en kanaaloverspraak in longkankerweefsels van klinische oorsprong op te lossen.

Multiplex immunohistochemiekleuring voor in paraffine ingebed longkankerweefsel

Multiplex, cyclische immunohistochemie, maakt in situ detectie van meerdere markers tegelijk mogelijk met behulp van herhaalde antigeen-antilichaamincubatie, beeldscanning en beelduitlijning en -integratie. Hier presenteren we het operationele protocol voor het identificeren van immuuncelsubstraten met deze technologie in longkanker en gepaarde hersenmetastasemonsters.

Multiplex cyclische fluorescerende immunohistochemie

Te ontrafelen de vroegste moleculaire mechanismen prostaatkanker initiatie, nieuw en innovatief model van de mens systemen en benaderingen zijn hard nodig. Het potentieel van de pre-prostaat urogenitale sinus mesenchym (UGSM) naar pluripotente stamcel populatie bewegen om menselijke prostaat epitheel vormen is een krachtig experimenteel hulpmiddel in prostate onderzoek.

Vorming van menselijke prostaat epitheel behulp Tissue recombinatie van knaagdieren Urogenital Sinus Mesenchym en menselijke stamcellen

Leer immunohistochemische kleuring van B7-H1 (PD-L1) op paraffine-ingebbedde weefsels van pancreaskanker. Deze methode maakt visualisatie van eiwitexpressie mogelijk om immunosuppressieve mechanismen in de tumoromgeving te bestuderen.

Immunohistochemische kleuring van B7-H1 (PD-L1) op paraffine ingebedde Slides van Pancreatic Darmkanker Tissue

Meer video's verkennen