Generation, Zuivering en karakterisering van Cell-invasieve DISC1 Protein Soorten

Het algemene doel van de volgende procedures is om gezuiverde schijven te genereren. Een aggregaten die in staat zijn om receptorcellen te invasiëren. Twee verschillende methoden om dit doel te bereiken, zullen worden gedemonstreerd met de eerste methode.

Het asome-vormende fluorescerende eiwit schijf een fusie-eiwit wordt overmatig tot expressie gebracht in NLF humane neuroblastoom donorcellen. De cellen worden vervolgens gewassen met PBS, verzameld en gelyseerd zonder het gebruik van detergenten. Het DNA wordt verteerd en agrozones worden gezuiverd met behulp van een sucrosegradiënt systeem.

Agrios gezuiverd door deze methode hebben een lage celinvasie-efficiëntie. De alternatieve aanpak is om aminozuren 5 98 tot 7 85 van het recombinante schijf een eiwit in e coli overmatig tot expressie te brengen. Het eiwitfragment wordt vervolgens gelabeld met DITE 5 94, gedialyseerd en gezuiverd met behulp van een NI NTA matrix die eventueel overgebleven ongebonden kleurstof multimerisch schijf verwijdert.

Een fragmenten gegenereerd door deze methode hebben een hoge celinvasie-efficiëntie om celinvasie door de gastheer te beoordelen. Hetzij het gezuiverde fluorescerende eiwit schijf een risosomes of het gelabelde recombinante schijf. Een fragment wordt geïncubeerd met de belangrijke receptorcellen.

Trian blauw wordt vervolgens toegevoegd om de extracellulaire fluorescentie te doven en invasie wordt gevisualiseerd door confocale microscopie. Tot nu toe is eiwitaggregatie niet gezien als een kenmerk van chronische mentale ziekten zoals schizofrenie. Waar het verstoorde schizofrenie een eiwit een kandidaat is voor celinvasiviteit van eiwitaggregaten, is een kenmerkend kenmerk voor eiwitconformatieve ziekten.

Hier laten we zien met twee methoden dat schijf een eiwitaggregaten celinvasief zijn en dus dat schijf een gerelateerde stoornissen of schijf een neuropathieën eiwitconformatieve stoornissen zijn. De twee methoden zijn ten eerste de zuivering van volledige lengte schijf, een ASOS uit neuroblastoomcellijnen en ten tweede de expressie van een C-terminaal multimerisch schijf. Een fragment in e coli evenals de zuivering en labelen met de fluorescerende kleurstof.

Terwijl de eerste methode slechts leidt tot een lage efficiënte celinvasie van oh 0,3%van de cellen die de gezuiverde microsomen opnemen, infecteert het zuivere recombinante eiwitfragment tot 20%van de blootgestelde cellen. De hier beschreven methoden zouden overdraagbaar moeten zijn naar andere eiwitten waarbij acrosoomvorming of multimere assemblage overtuigend is aangetoond. In elk van de 10 10 centimeter schaaltjes.

Zaai 1,5 keer 10 tot de zes humane neuroblastoom en LF cellen in gesupplementeerd RPMI 1640 medium en laat overnacht groeien. De volgende dag zouden cellen 70 tot 80%conflueëren, label vijf schotels voor transfectie met PC DNA 3.1 MRFP en EGFP getagd menselijk volledig lengte schijf een en vijf voor transfectie met alleen EGFP plasmide. Voor elke 10 centimeter schotel, combineer 15 microgram plasmide DNA 30 microliters met effect en 750 microliters.

Opti MEM in een microcentrifugebuis en maakt door op en neer te pipetteren, incubeer op kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Voeg vervolgens om de cellen te transfecteren de DNA transfectiereagens oplossing druppelsgewijs toe aan de cellen, incubeer de cellen bij 37 graden Celsius met 5%CO 2 48 uur na transfectie bewaakte de expressie van MRFP volledige lengte schijf een en bevestigde de vorming van agrozones onder een fluorescentiemicroscoop. Sommige cellen bevatten massieve fluorescerende eiwit inclusies zoals hier getoond.

Dit protocol combineert een methode om Lewy lichamen uit hersenweefsel te zuiveren en het protocol om grotere aggregaten of agrozones te isoleren aangezien bestaande methoden gebaseerd zijn op het gebruik van detergenten, is de isolatie van detergentvrij eiwit voor de toepassing in celinvasiviteitstests cruciaal. Aspibeer vervolgens het medium, was met PBS en voeg 400 microliter PBS met proteaseremmercocktail toe. Scheer de cellen en voeg een milliliter celsuspensie en 10 keramische kralen toe aan een twee milliliter lyseringsbuis.

Lys de cellen met behulp van drie 62ste pulsen op een pre-cell lys 24 homogenisator. De mechanische kracht van het proces kan de temperatuur in het monster boven de 37 graden Celsius verhogen. Zorg er dus voor om het monster op ijs te koelen. Na de lyseprocedure, na afkoeling van de cellen op ijs, voeg 10 millimolair magnesiumchloride 40 eenheden per milliliter DNAA toe en incubeer gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius met schudden.

Bereid 10 milliliters van elk van 80%50%en 20%sucrose gewicht per volume in PBS. Bereid vervolgens in een 15 milliliter conische buis de sucrosegradiënt voor, beginnend met twee milliliters 80%sucrose gevolgd door twee milliliters 50%en twee milliliters 20%sucrose. Giet de gradiënt langzaam en zorg ervoor dat u reeds gegoten lagen niet verstoort.

Bedek vervolgens het verteerde lysaal op de top van de gradiënt en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 1000 keer G bij vier graden Celsius. Met de breuk, verzamel voorzichtig de interface tussen de 50 tot 80%sucrose laag met een pipet en meng met vijf volumes van een 15 milliliter conische buis centrifugeer gedurende 15 minuten bij 1000 keer G bij vier graden Celsius. Verwijder voorzichtig het supernatant en bewaar het agrizone bevattende pellet.

Herhaal het wassen nog twee keer in deze interface. Agri zones zijn fluorescerend en kunnen onder UV-licht in de microscoop worden gevisualiseerd na de laatste wassing, gooi het supernatant weg en suspendeer het pellet in 250 tot 500 microliter PBS. Dit pellet bevat de gezuiverde agrozones.

Voeg 10 microliter MRFP schijf een asome suspensie toe aan elke put van een 24-welputten plaat bevattende SHSY vijf Y humane neuroblastoom cellen. Constitutief expressie van oplosbaar GFP schijf een C-terminus op steriele glazen deksels en incubeer gedurende 48 tot 72 uur na de incubatie. Was de cellen drie keer met PBS en do