Name: Generation, Zuivering en karakterisering van Cell-invasieve DISC1 Protein Soorten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: Leer de generatie en zuivering van cel-invasieve DISC1-eiwitaggregaten voor neurowetenschappelijk onderzoek. Deze methoden tonen eiwitopname aan in neuroblastoomcellen en neuronen in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door NEURON-ERANET ontdekken (BMBF 01EW1003) naar CK en JPH, DFG (Ko 1679/3-1, GRK1033) om CKVB wordt ondersteund door een subsidie ​​van de Forschungskommission van de Medische Faculteit van de Universiteit van Düsseldorf.

1. Bereiding van aggresoom donorcellen: Transfectie van Monomeer Red Fluorescent Protein (mRFP) of versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP)-gelabeld Human volledige lengte (FL) DISC1 <ol><li> Zaad 1,5 x 10 6/10 cm schotel menselijke neuroblastoom NLF (NLF; Children&#39;s Hospital van Philadelphia, Philadelphia, PA) cellen in tien schalen van 10 cm en groeien &#39;s nachts. NLF cellen worden gekweekt in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% FBS, penicilline / Strepomycin, L-Glutamine. De volgende dag moeten cellen bij 70-80% confluentie. </li><li> Tijdelijk transfecteren elk 10 cm schaal met 15 ug plasmide-DNA en Metafectene transfectiereagens (Biontex, Martinsried, Duitsland). Kortom voor een 10 cm schaal, werd 15 ug plasmide-DNA en 30 pl Metafectene aan 750 pl Opti-MEM, gemengd en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. 5 schalen werden getransfecteerd met pcDNA3.1 mRFP / eGFP-gelabeld humaan (FL) DISC1 en 5 schotels met eGFP-plasmide alleen. </li></ol> 2. AggresoomZuivering van getransfecteerde cellen Donor De hier beschreven protocol is een combinatie van een methode om Lewy-lichamen zuiveren van hersenweefsel 13 en een protocol om grote aggregaten en aggresomes 14 isoleren. Omdat bestaande methoden berusten op het gebruik van detergentia, de isolatie van detergens vrij proteïne voor toepassing in cel-assays invasiviteit is kritisch. <ol><li> 48 uur na transfectie, bewaken de expressie van eGFP en mRFP/eGFP-DISC1 en bevestigen de vorming van aggresomes onder een fluorescentiemicroscoop (figuur 1). </li><li> Spoel de cellen met PBS pH 7,4, schrapen met 400 pi PBS per Voeg 1X Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Indianapolis, IN) en verstoren de cellen door een Precellys24 homogenisator (Bertin technologieën, Frankrijk). In het kort, voeg 1 ml celsuspensie op een 2 ml lysis buis en voeg 10 keramiek kralen. Lyse van de cellen met 3 x 60 sec pulsen. De mechanische kracht van het proces kanverhogen van de temperatuur in het monster boven 37 ° C, zodat voorzichtigheid is geboden aan het monster koelen op ijs na lysis procedure. </li><li> Koel de cellen op ijs en voeg 10 mM MgCl2, 40 U / ml DNase A en incubeer 60 min bij 37 ° C </li><li> Bereid oplossingen van 80%, 50%, 20% sucrose (w / v) in PBS pH 7,4 (10 ml elk). </li><li> Bereid de sucrose gradiënt in een 15 ml falcon-buis, te beginnen met 2 ml 80% sucrose, gevolgd door 50% en 20%. Giet langzaam de helling en wees voorzichtig dat u reeds gegoten lagen te verstoren. Laag de verkregen lysaat bovenop de gradiënt en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 1000 xg bij 4 ° C. </li><li> Zorgvuldig verzamelen interface tussen de 50-80% sucrose laag met een pipet en meng met 5 volumina PBS pH 7,4. Centrifugeer gedurende 15 min bij 1000 xg bij 4 ° C. Herhaal het wassen van twee extra keer. In deze interfase, aggresomes zijn fluorescerend en kunnen worden gevisualiseerd in een microscoop onder UV-licht. </li><li> Verwijder het supernatant enresuspendeer de pellet op 250-500 ul PBS pH 7,4. Deze pellet bevat het gezuiverde aggresomes (figuur 2). </li></ol> 3. Behandeling van Ontvanger SH-SY5Y Cellen met mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes <ol><li> Zaad 5 x 10 4 ontvanger SH-SY5Y menselijke neuroblastoomcellen constitutief tot expressie GFP-DISC1 (598-854) op steriele dekglaasjes in elk putje van een plaat met 24 putjes. SH-SY5Y cellen worden gekweekt in DMEM/F-12 medium aangevuld met penicilline / streptomycine, niet-essentiële aminozuren (NEAA) en 10% FBS. </li><li> 24 uur later, wordt 10 pi aan elk putje en incubeer gedurende 48-72 uur. </li><li> Spoel de cellen met 3 x PBS pH 7,4 en doof extracellulaire fluorescentie met 0,04% Trypan Blue gedurende 5 minuten. </li><li> Bevestig de cellen met 4% PFA in PBS pH 7,4 gedurende 10 min op ijs, eenmaal wassen met steriel H2O en monteren dekglaasjes op glasplaatjes met ProLong Gold met DAPI fixeermiddel (Invitrogen, USA). </li><li> Bevestig de opname /invasie van exogeen toegepaste aggresomes door colokalisatie met aangeworven eiwitten die door ontvangende cellen in Z-stack beelden. </li></ol> Toch kan opname / invasie van exogeen eiwit niet wezenlijk worden gedetecteerd in parallel met rekrutering gastheercel eiwit. In ons voorbeeld mRFP gemerkte DISC1 aggresomes werven oplosbaar GFP-gelabeld DISC1 (598-854) proteïne uitgedrukt door de gastheercel (zie figuur 3). Foto&#39;s werden genomen op een Zeiss LSM 510 confocale-of een Zeiss AxioVision Apotome2 Microscoop. 4. Generatie van recombinant DISC1 (598 tot 785) In een eerdere publicatie analyseerden we het vermogen van diverse DISC1 eiwitfragmenten om zelf interactie gebaseerd op de aanwezigheid van zelfassociatie domeinen. Van alle geteste menselijke eiwitfragmenten DISC1 (598-785) weergegeven sterkste multimerisatie propensity 4 (Figuur 4). Daarom werd de menselijke DISC1 (598-785) gekloneerd in pET15b (nr.vagen, Madison, Wisconsin) die een N-terminale 6-histidine tag, uitgedrukt in E. coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, VS) en gezuiverd onder denaturerende omstandigheden in 8 mol / l ureum zoals beschreven 4. In het kort, is het protocol hieronder beschreven. <ol><li> BL21-(ide3) Rosetta E. coli werden gekweekt in 2 x 500 ml 2YT dat 5 mM-arginine-HCl, 5 mM MgSO4, 100 ug / ml carbencillin, 35 ug / ml chlooramfenicol tot een OD 600: 0,6-0,8 en DISC1 (598-785) expressie werd geïnduceerd met 1 mM IPTG. </li><li> DISC1 (598-785) werd uitgedrukt gedurende 4 uur bij 37 ° C werd de expressie beëindigd door het oogsten van de bacteriën door centrifugatie. </li><li> De bacteriële pellet werd geresuspendeerd in 50 ml TE buffer (50 mM TRIS-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA) plus 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 ug / ml lysozym, 20 mM MgCl2 en 400 ml U/50 DNase I. Om volledige lysis te verzekeren, werd het reactiemengsel gedurende 30 min bij kamertemperatuur onder voorzichtig roeren. </li><li> Voeg 10 mM β-mercaptoethanol (ME) en 500 mM NaCl en incubeer 30 min een. </li><li> Spin down bacteriële insluitlichaampjes op 20.000 g gedurende 30 min bij 4 ° C. </li><li> Hersuspendeer pellet in 50 ml extractiebuffer bevattende 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazool, 500 mM NaCl, 8 M ureum en 10 mM β-ME en verwijder afval door centrifugatie bij 20.000 g gedurende 30 min bij 4 ° C. </li><li> Was de Ni-NTA agarose matrix met extractiebuffer. Incubeer de geresuspendeerde, vooraf geklaard eiwitextract met Ni-NTA matrix gedurende 2 uur bij KT. </li><li> Was de Ni-NTA matrix met extractiebuffer bevattende 12 mM imidazool. </li><li> Langzaam Elueer het eiwit met 15 ml elutiebuffer die 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazool, 8 M ureum, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA en 10 mM β-ME. </li><li> Dialyseer het eiwit stapsgewijs te PBS pH 7,4 bevattende 10 mM β-ME. </li></ol> Vanaf 1 L bacteriële starten cultuur is het mogelijk om tot isoleren tot 50 mg recombinant DISC1 (598 tot 785) protein. α-synucleïne hervouwing Voor experimenten met α-synucleïne, 500 ug van het recombinante eiwit (Sigma-Aldrich, USA) werd opgelost in PBS bij een concentratie van 1 mg / ml. Oligomeren verkrijgen hervouwing werd gedurende de nacht bij 37 ° C zoals beschreven in een eerdere publicatie 10. 5. Etikettering van Recombinant DISC1 (598 tot 785) met DyLight594 <ol><li> Voorafgaand het naderhand coderen proces, DISC1 (598 tot 785) eiwit is het bevrijd worden van β-ME. Derhalve wordt het eiwit gedialyseerd 3 keer met PBS pH 7,4 bij een verdunning van 1:2000. </li><li> Label 1 mg DISC1 (598-785) met DyLight 594 maleïmide (Thermo Scientific, USA) volgens de instructies van de fabrikant. Kortom, los 1 mg / ml eiwit in PBS pH 7,4 en voeg 5 mM TCEP om vrije thiolgroepen te herstellen. Voeg 20 ul van de DMF opgeloste kleurstof aan de reactie en incubeer gedurende 2 uur bij KT. </li><li> Dialyseer het eiwit tot 3 x PBS pH7,4 bij een verhouding van 1:2000 voor 2 uur elk. </li></ol> Verdere verhoging van de zuiverheid van het gelabelde eiwit een His6-tag based affiniteit-zuivering op een Ni-NTA kolom uitgevoerd. <ol start="4"><li> Wash 1 ml Ni-NTA matrix (Qiagen, Duitsland) met 10 ml PBS pH 7,4. </li><li> Breng de gelabelde, gedialyseerd eiwit aan de kolom en laat hem langzaam lopen over de kolom. </li><li> Was het eiwit met 3 x 20 ml PBS pH 7,4 </li><li> Elueer het eiwit met PBS pH 7,4, 500 mM imidazool druppelsgewijze onder controle van de gekleurde band op de Ni-NTA kolom het eluaat volume te verlagen. </li><li> Dialyseer het eluaat 3 x met 10 mM NaPi pH 7,4 bij een verdunning van 1:2000 gedurende 2 uur elk. </li><li> Een steriele 0,45 urn spuitfilter het eluaat aliquot in 5 x 100 ul monsters en snap bevriezen in vloeibare stikstof filteren. De totale hoeveelheid eiwit moet 0,5 - 1 ug / ml per 100 ul aliquot. </li></ol> optionele concentratie stap <ol start="10"><li> Voor stereotactical rat injecties werd het eiwit 10-voudig geconcentreerd in een Speed-Vac (Eppendorf Concentrator 5301). De laatste buffer voorwaarde was 100 mM NaPi. </li></ol> α-synucleïne Labeling De labeling en zuivering (Ni-NTA kolom) van de recombinant α-synucleïne werd uitgevoerd parallel aan DISC1 (598-785). Het totale uitgangsmateriaal was 500 ug plaats van 1 mg DISC1 (598-785). 6. Behandeling van Ontvanger SH-SY5Y Cellen met gemerkt recombinant DISC1 (598 tot 785) Protein <ol><li> Seed 5x10 4 Ontvanger SH-SY5Y menselijke neuroblastoomcellen constitutief tot expressie GFP-DISC1 (598-854) op steriele dekglaasjes in elk putje van een plaat met 24 putjes. </li><li> Toevoegen gemerkt eiwit aan het celkweekmedium in een concentratie van 5-10 ug / ml en incubeer gedurende 48-72 uur. </li><li> Was de cellen 3 x met PBS pH 7,4 en lessen extractieellular fluorescentie met 0,04% Trypan Blue gedurende 5 minuten. </li><li> Bevestig de cellen met 4% PFA in PBS pH 7,4 gedurende 10 min op ijs, eenmaal wassen met steriel H2O en monteren dekglaasjes op glasplaatjes met ProLong Gold met DAPI fixeermiddel (Invitrogen, USA). </li><li> Bevestig de opname / invasie van exogeen toegepaste recombinant eiwit door colokalisatie met aangeworven eiwitten die door ontvangende cellen in Z-stack beelden gegenereerd door laser scanning confocale microscopie. Toch werving van endogeen eiwit niet kan worden gedetecteerd in hoofdzaak parallel met invasie van gastheercel eiwit, kan Z-stack beelden nog bevestigen het invasieve karakter van het eiwit. </li></ol> In ons voorbeeld rec. DISC1 (598-785) * tenminste gedeeltelijk oplosbaar rekruten GFP-gelabeld DISC1 (598-854) proteïne uitgedrukt door de gastheercel (zie figuur 5A). Voor recombinant α-synucleïne invasie maar geen rekrutering (Figuur 5B). Foto&#39;s zijn genomeneen Zeiss LSM 510 confocale-of een Zeiss microscoop AxioVision Apotome2. De injectie van de geconcentreerde (ca. 4 pl van 2,5 ug / ul), gelabeld DISC1 (598-785) * in de mPFC leidt tot het verspreiden van het eiwit rond de injectieplaats die zelfs na perfusie van de dieren worden gedetecteerd met 4% PFA in PBS pH 7,4 met een rhodamine filterset. In ons voorbeeld DISC1 (598-785) wordt opgenomen door een afzonderlijk aantal neuronen en kunnen door Z-stack imaging (Figuur 6). In het algemeen hebben de injectie van eiwitten anders dan die welke worden gebruikt hier niet te leiden tot cel-invasie. De invasie event is voornamelijk afhankelijk van de aard van het eiwit toch een schone zuivering is een voorwaarde voor verdere analyse. 7. Representatieve resultaten Aggresomes bestaande uit recombinant FL DISC1-eGFP gezuiverd van NLF cellen binnengevallen ontvanger SH-SY5Y ceLLS bij lage efficiëntie (ongeveer 0,3% 5) zoals zichtbaar colokalisatie met confocale microscopie (figuur 3). Zoals eerder gemeld, DISC1 (598-785) uitgedrukt en gezuiverd uit E. coli gevormd multimeren 4 waren even cell-invasieve bij een rendement van ongeveer 20% 5 (Figuur 5A) gelijk aan die van α-synucleïne dat in parallel als positieve controle (Figuur 5B). Gelabeld recombinant DISC1 (598-785) uitgedrukt en gezuiverd uit E. coli was ook cel-invasieve aan neuronen in vivo wanneer het multimere eiwit stereotactisch geïnjecteerd in de mediale prefrontale cortex van de rat (figuur 6; Pum, Bader, Huston, Korth, ongepubliceerd). <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. NLF neuroblastomacellen transiënt tot expressie FP-DISC1 (rood). Rode fluorescerende aggresomes kan verslechteringcted in de cellen. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Gezuiverd mRFP gemerkte DISC1 aggresomes na zuivering in een sucrosegradiënt. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. Fluorescentie beeld van binnengevallen aggresomes. mRFP-gelabeld flDISC1 aggresomes werden gezuiverd en geïncubeerd met SH-SY5Y neuroblastoomcellen overexpressie oplosbaar GFP-gelabeld DISC1 (598-854). Een opname van gelabelde aggresomes wordt bewaakt door Z-stack beeldvorming op een Laser-Scan microscoop (Zeiss LSM 510). <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig4.jpg" alt="Figuur 4" /> Figuur 4. SEC-profiel van rec. DISC1 (598 tot 785) met de S704 en de C704 single nucleotide polymorfismen (SNP). Beide varianten tonen een verstoring van geordende oligomerisatie en vorming van hoog molecuulgewicht multimers (rode pijl). Dit beeld wordt aangepast na de publicatie van Leliveld et al.., Biochemistry 2009. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig5.jpg" alt="Figuur 5" /> Figuur 5. Fluorescent Z-stack beeld van invasieve DyLight-gelabeld recombinant DISC1 (598 tot 785). SH-SY5Y neuroblastoomcellen expressie oplosbaar GFP-DISC1 (598-854) werden geïncubeerd met gemerkt, recombinant eiwit in een concentratie van 5 ug / ml. (A) Red aggregaten toont de invasie van rec. DISC1 (598 tot 785) eiwit en gele stippen geven een werving van oplosbare GFP-DISC1 (598 tot 854) in aggregaten. (B) Recombinant α-synucleïne (rood) binnendringt de cellen zonder recruitment met een frequentie van ongeveer 20%. <a href="/files/ftp_upload/4132/4132fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig6.jpg" alt="Figuur 6" /> Figuur 6. Immunofluorescente beeld vande geïnjecteerde gelabelde recombinant DISC1 (598-785) eiwit. Z-stack beeldvorming bevestigt de aanwezigheid van rec. DISC1 (598-785) eiwit in rat corticale neuronen gekleurd met een antilichaam tegen neuronale kernen (neun, groen).

<ol><li>Millar, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+two+novel+genes+by+a+translocation+co-segregating+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia.</a> Hum. Mol. Genet. 9, 1415-1423 (2000).</li>
<li>St Clair, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+within+a+family+of+a+balanced+autosomal+translocation+with+major+mental+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Association within a family of a balanced autosomal translocation with major mental illness.</a> Lancet. 336, 13-16 (1990).</li>
<li>Leliveld, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insolubility+of+disrupted-in-schizophrenia+1+disrupts+oligomer-dependent+interactions+with+nuclear+distribution+element+1+and+is+associated+with+sporadic+mental+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Insolubility of disrupted-in-schizophrenia 1 disrupts oligomer-dependent interactions with nuclear distribution element 1 and is associated with sporadic mental disease.</a> J. Neurosci. 28, 3839-3845 (2008).</li>
<li>Leliveld, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomer+assembly+of+the+C-terminal+DISC1+domain+%28640-854%29+is+controlled+by+self-association+motifs+and+disease-associated+polymorphism+S704C%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Oligomer assembly of the C-terminal DISC1 domain (640-854) is controlled by self-association motifs and disease-associated polymorphism S704C.</a> Biochemistry. 48, 7746-7755 (2009).</li>
<li>Ottis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+two+independent+mental+disease+genes+on+the+protein+level%3A+recruitment+of+dysbindin+to+cell-invasive+disrupted-in-schizophrenia+1+aggresomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Convergence of two independent mental disease genes on the protein level: recruitment of dysbindin to cell-invasive disrupted-in-schizophrenia 1 aggresomes.</a> Biol. Psychiatry. 70, 604-610 (2011).</li>
<li>Meyer-Luehmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+induction+of+cerebral+beta-amyloidogenesis+is+governed+by+agent+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host.</a> Science. 313, 1781-1784 (2006).</li>
<li>Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+tau+misfolding+from+the+outside+to+the+inside+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell.</a> J. Biol. Chem. 284, 12845-12852 (2009).</li>
<li>Frost, B., Ollesch, J., Wille, H., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+diversity+of+wild-type+Tau+fibrils+specified+by+templated+conformation+change%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Conformational diversity of wild-type Tau fibrils specified by templated conformation change.</a> J. Biol. Chem. 284, 3546-3551 (2009).</li>
<li>Clavaguera, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+and+spreading+of+tauopathy+in+transgenic+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain.</a> Nat. Cell Biol. 11, 909-913 (2009).</li>
<li>Desplats, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+formation+and+neuronal+cell+death+through+neuron-to-neuron+transmission+of+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13010-13015 (2009).</li>
<li>Ren, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+penetration+and+persistent+infection+of+mammalian+cells+by+polyglutamine+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates.</a> Nat. Cell Biol. 11, 219-225 (2009).</li>
<li>Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+propagation+of+mutant+superoxide+dismutase-1+misfolding+in+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 3548-3553 (2011).</li>
<li>Iwatsubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+Lewy+bodies+from+the+brains+of+patients+with+diffuse+Lewy+body+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of Lewy bodies from the brains of patients with diffuse Lewy body disease.</a> Am. J. Pathol. 148, 1517-1529 (1996).</li>
<li>Meriin, A. B., Wang, Y., Sherman, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+aggresomes+and+other+large+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of aggresomes and other large aggregates.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, 1-9 (2010).</li>
<li>Korth, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DISCopathies%3A+brain+disorders+related+to+dysfunctional+DISC1%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">DISCopathies: brain disorders related to dysfunctional DISC1.</a> Rev. Neurosci. 20, 321-330 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

In deze studie beschrijven we de zuivering van mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes uit getransfecteerde neuroblastoma cellijn, de bereiding en het kenmerken van een recombinant eiwit DISC1 species en hun toepassing in cel-invasie experimenten ontvangende cellen in vitro en in vivo. De zuivering van natieve mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes werd ontwikkeld uit protocollen Lewy body-achtige structuren en grotere aggregaten 13, 14 isoleren, maar aangepast om het gebruik van detergenten voorkomen en het risico op vals-positieve cel-invasie die zich kunnen voordoen minimaliseren als gevolg van detergent-gefaciliteerde membraan penetratie. Een mogelijke toekomstige verbeteringen kan de in de zuiverheid van de aggresomes door sonicatie verder stijgen tot volledig gescheiden blijven membranen en het cytoskelet aggresomes. Door de totale zuiverheid, het totaal aantal gebeurtenissen die invasie opgenomen voor grote ma aggresomesy worden verhoogd 5. Of de beperkte definitie van onze voorgestelde 3-fase sucrose is voldoende voor aggresomes andere eiwitsoort worden getest, in die zin de hier geschetste protocol moet worden beschouwd als uitgangspunt voor individuele optimalisatie. Het gezuiverde aggresomes bleek vrij robuust in onze handen, extra wasstappen (zonder detergent) om sporen sucrose niet significant verminderen de totale opbrengst elimineren. In een eerdere publicatie beschreven we dat oligomeer samenstel van DISC1 is afhankelijk van verschillende multimerisatie domeinen in het C-terminus 4 (Figuur 4). We kozen voor dit fragment voor recombinante expressie in E. oplosbaar coli en daaropvolgende en Ni-NTA zuivering. Om de multimerisatie volgen en de cel invasiviteit vergelijken met een beschreven cel-invasieve eiwit zoals α-synucleïne, we gemerkte DISC1 (598-785) met de fluorescente kleurstof DyLight594, en vergeleken decel-invasiviteit met die van gelijk gelabelde α-synucleïne. De cel-invasiviteit van de recombinant DISC1 fragment werd enorm toegenomen vergeleken met die van natief, volledige lengte DISC1 aggresomes waarschijnlijk door de geringe afmetingen en veel hogere zuiverheid. Nogmaals, zuiverheid lijkt een beslissende rol spelen in cel-invasiviteit. In ons voorbeeld invasieve aggresomes gerekruteerd oplosbare homoloog eiwit van de doelcellijn dat recombinant expressie werd gebracht in een oplosbare, dwz cel-gedispergeerde vorm. De expressie van een fluorescerend eiwit (GFP of RFP bijvoorbeeld) in de ontvangende cellijn een voordeel aangezien het de colokalisatie van invasieve aggresomes en recombinante eiwitten in de ontvangende cel grens via Z-stack imaging. Cell-invasieve DISC1 aggresomes en multimere fragmenten tot expressie gebracht en gezuiverd uit E. coli kan een bepalend kenmerk van een eiwit conformationele ziekten in verband met DISC1, DI wordenSC1opathies 15. PROBLEMEN OPLOSSEN: Laag aggresoom opbrengst na sucrose gradiënt zuivering: De sucrose-gradiënt die in dit protocol werkt goed met eGFP/mRFP-DISC1 (FL) aggresomes. Aggresomes bestaande uit andere eiwitten kan van variabele afmetingen dan de concentraties sucrose moeten worden geoptimaliseerd door andere gebruikers. Onvoldoende zuivering van recombinant eiwit: Een bacteriële verontreinigingen in het zuiveringsproces van het recombinante eiwit worden geëtiketteerd latere stappen van het protocol. Om verontreinigingen te voorkomen, voert het eiwit op SDS-PAGE en bevestigen dat het recombinant eiwit ten minste 95% zuiver door kleuring met Coomassie-Blue. Te waarborgen hoogste kwaliteit en opbrengst, het protocol moet worden geoptimaliseerd voor elk eiwit. Lage etikettering efficiëntie van recombinante eiwitten: Alle verontreinigingen die vrije SH-groepen bevatten afneemt efficiënte labeling van het eiwit. Daarom uitgebreide dialyse en Ni-NTA based zuivering verplicht.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens naam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td> Medium is afhankelijk van de gastheercellijn. De optimale ontvangende cellijn worden bepaald door de gebruiker. </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-033 </td><td> Medium is afhankelijk van de ontvangende cellijn. De optimale ontvangende cellijn worden bepaald door de gebruiker. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Metafectene </td><td> Biontex </td><td> T020-1.0 </td><td> Andere transfectiereagentia kan net zo goed werken, maar zijn niet getest met ons protocol. </td></tr><tr><td> Ni-NTA agarose </td><td> Qiagen </td><td> 30210 &lt;/ Td&gt; <td> De experimenten werden gedaan met Ni_NTA agarose van Qiagen, moeten andere leveranciers zo goed werkt. </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td><td> Er is geen noodzaak voor RNase vrij DNase in het proces van aggresomes zuivering. </td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-062 </td><td> Serumvrij medium werkt ook </td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td> Toeslag voor SH-SY5Y en NLF medium </td></tr><tr><td> Niet-essentiële amino-zuren (NEAA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7145 </td><td> Toeslag voor SH-SY5Y medium </td></tr><tr><td> Trypan Blue 0,4% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td> Giftige reagens </td></tr><tr><td> DyLight 594 Maleimide </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 46608 </td><td> Verminderd cysteine ​​reactieve kleurstof stabiele thioether bindingen. Ook verkrijgbaar in andere kleuren. </td></tr><tr><td> ProLong Gold met DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36935 </td><td> Dit antifade vloeibare inbedmiddel superieure resultaten gaf in onze handen. </td></tr><tr><td> Protease Inhibitor cocktail </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> Los 1 tabel in 500 pi H 2 O voor 100X oplossing. </td></tr><tr><td> Synthetische a-synucleïne </td><td> Sigma </td><td> S7820 </td><td> Vouw zoals beschreven in de tekst. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel van specifieke reagentia. </td></tr><tr><td> Precellys 24 </td><td> Bertin Technologies </td><td> 03119.200.RD000 </td><td> We hebben niet getest andere mechanische homonizers anders dan dit. Andere wasmiddel zonder homogenisering methode kan net zo goed werken, maar zijn niet getest op dit protocol. </td></tr><tr><td> 5301 Concentrator (speedvac) </td><td> Eppendorf </td><td> 5301 000.210 </td><td> Alleen nodig wanneer eiwit worden geconcentreerd. </td></tr><tr><td> LSM 510 en AxioVision Apotome2 </td><td> Zeiss </td><td> Zie fabrikanten catalogus </td><td> Beide microscopen haven de mogelijkheid om Z-stack beeldvorming uit te voeren. Dit is een voorwaarde voor vaste en serieuze evaluatie van de invasie evenementen. </td></tr><tr><td> Celcultuur kunststof </td><td> Nunc </td><td> 10 cm schalen # 172958, 24-well platen # 142475 </td><td> Het gebruik van verschillende kunststof beinvloeden de interactie van recombinante eiwitten of aggresomes en plastic oppervlakken. We hebben niet getest materiaal andere dan de hier beschreven. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel van specifieke materialen en apparatuur. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Aantal </td><td> Buffer naam </td><td> inhoud </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Bacteriële groeimedium </td><td> 16 g / l Bacto trypton, 10 g / l Bacto gistextract, 5 g / l NaCl, 5 mM-arginine-HCl, 5 mM MgSO4, 100 ug / ml carbencillin, 35 ug / ml chlooramfenicol </td><td> Bacteriën groeien OD 600: 0.6-0.8 induceren expressie met 1 mM IPTG. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Bacteriële resuspensie buffer </td><td> 50 mM TRIS-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 ug / ml lysozym, 20 mM MgCl2 en 400 U/50 ml DNase I </td><td> Resupend bacteriële pellet van 1 L overnight cultuur in 50 ml resuspensie buffer. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Protein extractiebuffer </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazool, 500 mM NaCl, 8 M ureum en 10 mM b-ME </td><td></td></tr><tr><td> 4. </td><td> Ni-NTA kolom wasbuffer </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazool, 500 mM NaCl, 8 M ureum en 10 mM b-ME, 12 mM imidazool </td><td> Gemodificeerde extractiebuffer met 12 mM imidazool toegevoegd. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Ni-NTA kolom elutiebuffer </td><td> 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazool, 8 M ureum, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA en 10 mM b-ME </td><td> De elutiebuffer bevat 10 mM b-ME, die later gedialyseerd. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> PBS </td><td> 8 g / l NaCl, 0,2 g / l KCl, 1,44 g / l Na 2 HPO 4, 0,24 g / l KH 2PO 4, op pH 7,4 </td><td></td></tr><tr><td>7. </td><td> Labeling buffer </td><td> PBS met 5 mM TCEP </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Tabel met recepten. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

generation, zuivering en karakterisering van cell-invasieve disc1 protein soorten

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Eiwitaggregatie wordt gezien als een algemeen kenmerk van chronische, degeneratieve hersenaandoeningen zoals bijvoorbeeld in neurodegeneratieve ziekten ziekte van Alzheimer (Aß, tau), ziekte van Parkinson (α-synucleïne), de ziekte van Huntington (polyglutamine, huntingtin) en anderen. Eiwit aggregatie wordt gedacht dat optreden als gevolg van verstoorde proteostasis, dat wil zeggen het onevenwicht tussen het ontstaan ​​en afbraak van verkeerd gevouwen eiwitten. Van belang zijn dezelfde eiwitten samengevoegd in sporadische vormen van deze ziekten die mutant in zeldzame varianten van familiaire vormen. Schizofrenie is een chronische progressieve hersenaandoening die samen in veel gevallen gaat met een permanente en onomkeerbare cognitieve tekorten. In een kandidaatgen benadering hebben we onderzocht of Onderbroken-in-schizofrenie 1 (DISC1), een gen gekloneerd in Schotse familie met koppeling aan chronische geestesziekte 1, 2, kunnen worden gevonden als onoplosbare aggregaten in de brain van sporadische gevallen van schizofrenie 3. Met de SMRI CC identificeerden we in ongeveer 20% van de gevallen met CMD maar niet de normale controles en patiënten met neurodegeneratieve ziekten sarkosyl onoplosbare DISC1 immunoreactiviteit na biochemische fractionering. Latere studies in vitro aangetoond dat de aggregatie neiging van DISC1 werd beïnvloed door ziekte geassocieerde polymorfismen S704C 4 en dat DISC1 aggresomes gegenereerd in vitro werden cel-invasieve 5, vergelijkbaar met wat is aangetoond voor Aß 6, tau 7-9, α -synucleïne 10, polyglutamine 11 of SOD1 aggregaten 12. Deze bevindingen ons ertoe stellen dat ten minste een subset van gevallen met CMD, die met geaggregeerde DISC1 misschien eiwit conformationele aandoeningen. Hier beschrijven we hoe we DISC1 aggresomes in zoogdiercellen te genereren, te zuiveren ze op een sucrose gradiënt en gebruik ze voor cel-invasiviteit studies. Ook beschrijven we hoe we een exclusief multimere C-terminale fragment DISC1, label genereren en zuiveren voor cel invasiviteit studies. Gebruik van de recombinante multimeren van DISC1 we bereiken soortgelijke cel als invasiviteit een vergelijkbaar gemerkte synthetische α-synucleïne fragment. We zien dat dit fragment wordt opgenomen in vivo als stereotactisch geïnjecteerd in de hersenen van de ontvanger dieren.

De generatie, zuivering en celinvasie van intracellulaire, cytoplasmatische volledige lengte DISC1 eiwit aggresomes van celculturen en van een label, multimeer recombinant DISC1 eiwitfragment in<em&gt; E. coli</em&gt; Beschreven. Cell invasiviteit wordt getoond voor ontvangende cellen in celkweek en neuronen<em&gt; In vivo</em&gt; Na stereotactical hersenen inoculatie.

Generation, Zuivering en karakterisering van Cell-invasieve DISC1 Protein Soorten

Proteïneaggregatie wordt beschouwd als een algemeen kenmerk van chronische, degeneratieve hersenaandoeningen, zoals bijvoorbeeld bij de neurodegeneratieve ziekten de ziekte van Alzheimer (Aβ, tau), de ziekte van Parkinson (α-synucleïne), de ziekte van Huntington (polyglutamine, huntingtine) en andere. Men gaat ervan uit dat proteïneaggregatie optreedt als gevolg van verstoorde proteostase, oftewel de onbalans tussen het ontstaan en de afbraak van verkeerd gevouwen proteïnen. Opvallend is dat dezelfde proteïnen geaggregeerd worden aangetroffen in sporadische vormen van deze ziekten als in zeldzame varianten van familiale vormen waarin deze gemuteerd zijn. Schizofrenie is een chronische progressieve hersenaandoening die in veel gevallen gepaard gaat met een permanent en irreversibel cognitief deficit. Middels een kandidaatgen-benadering hebben wij onderzocht of Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), een gen dat is gekloond in een Schotse familie met een koppeling aan chronische psychische aandoeningen, als onoplosbare aggregaten kon worden aangetroffen in de hersenen van sporadische gevallen van schizofrenie. Met behulp van de SMRI CC identificeerden wij in ongeveer 20 % van de gevallen met een chronische psychische aandoening, maar niet bij normale controles of patiënten met neurodegeneratieve ziekten, sarkosyl-onoplosbare DISC1-immunoreactiviteit na biochemische fractionering. Vervolgstudies in vitro onthulden dat de aggregatiegevoeligheid van DISC1 werd beïnvloed door het ziekte-geassocieerde polymorfisme S704C, en dat in vitro gegenereerde DISC1-aggresomen cel-invasief waren, vergelijkbaar met wat was aangetoond voor Aβ, tau, α-synucleïne, polyglutamine of SOD1-aggregaten. Deze bevindingen brachten ons ertoe voor te stellen dat ten minste een subset van gevallen met een chronische psychische aandoening, namelijk zij met geaggregeerd DISC1, proteïne-conformationele stoornissen zouden kunnen zijn. Hier beschrijven wij hoe wij DISC1-aggresomen genereren in zoogdiercellen, deze zuiveren op een sucrosegradiënt en ze gebruiken voor studies naar cel-invasiviteit. Evenzo beschrijven wij hoe wij een exclusief multimeer C-terminaal DISC1-fragment genereren, labelen en zuiveren voor studies naar cel-invasiviteit. Met behulp van de recombinante multimeren van DISC1 bereiken we een vergelijkbare cel-invasiviteit als voor een op soortige wijze gelabeld synthetisch α-synucleïne-fragment. We tonen ook aan dat dit fragment in vivo wordt opgenomen wanneer het stereotactisch in de hersenen van ontvangende dieren wordt geïnjecteerd.

Het algemene doel van de volgende procedures is het genereren van gezuiverde schijf-aggregaten die in staat zijn om recipiënte cellen binnen te dringen. Met de eerste methode worden twee verschillende manieren gedemonstreerd om dit doel te bereiken.Het fluorescent eiwit-fusie-eiwit disc one, dat somen vormt, wordt overgeëxpresseerd in NLF menselijke neuroblastoom-donorcellen. De cellen worden vervolgens gewassen met PBS, verzameld en gelyseerd zonder gebruik van detergentia. Het DNA wordt gedigesteerd en agro-zones worden gezuiverd met behulp van een sucrosegradiënt-systeem.Agrios die met deze methode zijn gezuiverd, vertonen een lage efficiëntie bij celinvasie. Een alternatieve benadering is om de aminozuren 5 98 tot 7 85 van het recombinante disc one-eiwit in e coli over te expresseren. Het eiwitfragment wordt vervolgens gelabeld met DITE 5 94, gedialyseerd en gezuiverd met behulp van een NI NTA-matrix, waarmee alle resterende ongebonden kleurstof en multimeer disc worden verwijderd.Fragmenten die met deze methode zijn gegenereerd, vertonen een hoge celinvasie-efficiëntie voor het beoordelen van de invasie van gastcellen. Gebruik hiervoor ofwel de gezuiverde fluorescente eiwitdisc, ribosomen of de gelabelde recombinante disc. De fragmenten worden geïncubeerd met de betreffende recipiënte cellen.Vervolgens wordt Trian blue toegevoegd om de extracellulaire fluorescentie te doven en de invasie wordt gevisualiseerd met confocale microscopie. Tot nu toe is eiwitaggregatie geen erkend kenmerk geweest van chronische mentale ziekten zoals schizofrenie. Waar bij schizofrenie één eiwit een kandidaat is voor verstoring, is de cellulaire invasiviteit van eiwitaggregaten een kenmerkend aspect van eiwitconformationele ziekten.Hier tonen we met twee methoden aan dat aggregaten van het disc1-eiwit cel-invasief zijn en dat disc1-gerelateerde aandoeningen of disc1-neuropathieën derhalve eiwitconformatieziekten zijn. De twee methoden bestaan enerzijds uit de zuivering van full-length disc1-SOS uit neuroblastoomcellijnen en anderzijds uit de expressie van een C-terminaal multimeer disc1-fragment in E. coli, evenals de zuivering en labeling met een fluorescente kleurstof.Waar de eerste methode slechts leidt tot een lage efficiëntie van celinvasie, waarbij ongeveer 0,3% van de cellen de gezuiverde microsomen opneemt, infecteert het zuivere recombinante eiwitfragment tot 20% van de blootgestelde cellen. De hier beschreven methoden zouden overdraagbaar moeten zijn op andere eiwitten waarbij acrosomevorming of multimere assemblage overtuigend is aangetoond. In elk van de 10 10 centimeter schalen.Zaai 1,5 x 10⁶ menselijke neuroblastoom- en LF-cellen uit in aangevuld RPMI 1640-medium en laat deze een nacht groeien. De volgende dag moeten de cellen 70 tot 80% confluent zijn; label vijf kweekschalen voor transfectie met pcDNA 3.1 mRFP- en EGFP-gelabeld menselijk full-length DISC1 en vijf voor transfectie met alleen het EGFP-plasmide. Combineer voor elke schaal van 10 centimeter 15 µg plasmide-DNA, 30 µL Metafect en 750 µL.Voeg Opti MEM toe in een microcentrifugebuis en meng door herhaaldelijk op en neer te pipetteren, en laat dit 20 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens, om de cellen te transfecteren, de DNA-transfectiereagensoplossing druppelsgewijs toe aan de cellen. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO₂. Controleer 48 uur na transfectie de expressie van MRFP full length disc one en bevestig de vorming van aggresomen onder een fluorescentiemicroscoop. Sommige cellen bevatten massieve fluorescentie-eiwitaggregaten, zoals hier getoond.Dit protocol combineert een methode voor het zuiveren van Lewy-lichaampjes uit hersenweefsel met het protocol voor het isoleren van grotere aggregaten of agro-zones; aangezien bestaande methoden gebaseerd zijn op het gebruik van detergentia, is de isolatie van detergentvrije eiwitten cruciaal voor de toepassing in assays voor celinvasiviteit. Aspireer vervolgens het medium, was met PBS en voeg 400 µL PBS toe dat een protease-remmercocktail bevat. Schraap daarna de cellen af en voeg één mL celсусpensie en 10 keramische kraaltjes toe aan een lysisbuis van twee mL.Lyseren de cellen met drie pulsen van 62 seconden in een pre-cell lyse 24 homogenisator. De mechanische kracht van dit proces kan de temperatuur in het monster doen stijgen tot boven de 37 °C. Daarom moet er zorgvuldig worden toegezien dat het monster op ijs wordt gekoeld. Voeg na de lyseprocedure, nadat de cellen op ijs zijn afgekoeld, 10 millimol magnesiumchloride en 40 units per milliliter DNAA toe en incubeer dit 60 minuten bij 37 °C onder schudding.Bereid telkens 10 milliliter van 80%, 50% en 20% sucrose (gewicht per volume) in PBS voor. Bereid vervolgens in een conische buis van 15 milliliter de sucrosegradiënt door te beginnen met twee milliliter 80% sucrose, gevolgd door twee milliliter 50% en twee milliliter 20% sucrose. Giet de gradiënt langzaam in en zorg ervoor dat de reeds gegoten lagen niet worden verstoord.Laag vervolgens het gedigesteerde lysaat bovenop de gradiënt en centrifugeer 15 minuten bij 1000 ×g bij vier graden Celsius. Neem na het centrifugeren voorzichtig de interface tussen de 50 en 80% sucroselaag op met een pipet en meng dit met vijf volumes in een kegelvormige centrifugebuis van 15 milliliter; centrifugeer vervolgens 15 minuten bij 1000 ×g bij vier graden Celsius. Verwijder voorzichtig het supernatant en behoud het pellet dat de agri-zone bevat.Herhaal het wassen nog twee keer in deze interface. Agri-zones zijn fluorescent en kunnen na de laatste wasbeurt onder UV-licht in de microscoop worden gevisualiseerd; verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in 250 tot 500 µL PBS. Dit pellet bevat de gezuiverde agro-zones.Voeg 10 µL van de MRFP disc, one asome suspensie toe aan elke well van een 24-well plaat met SHSY five Y humane neuroblastoomcellen die constitutief oplosbaar GFP disc one C-terminus tot expressie brengen op steriele glazen dekglasjes en incubeer gedurende 48 tot 72 uur. Was de cellen drie keer met PBS en quench de extracellulaire fluorescentie met 0,04% trypan blue gedurende vijf minuten.Was vervolgens met PBS om het trypaanblauw te verwijderen. Plaats daarna de schaal op ijs en voeg 4% PFA en PBS toe gedurende 10 minuten om de cellen te fixeren. Was vervolgens één keer met steriel water en monteer de dekglasjes op objectglazen met Prolong Gold DPI monteermedium.Bevestig de opname bij invasie van exogeen toegevoegde aggro-zones door colocalisatie met gerekruteerde eiwitten die tot expressie komen door recipientcellen in Z-stack-beelden. Deze Z-stack heeft een diepte van ongeveer zes micrometer.24 opnamen gemaakt met stappen van 200 nanometers. De fluorescentie van de MRFP disc one agri-zone, weergegeven in rood, rekruteert de cytosolische GFPC terminale disc. Eén fragment, weergegeven in groen, vertoont colocalisatie als geel en geeft aan dat de agri-zones het cytosol van de ontvanger zijn binnengedrongen en voorheen oplosbaar disc one-eiwit hebben gerekruteerd.In dit deel van het protocol wordt human disc one gelabeld met DITE 5 94. Deze D maakt directe monitoring van het recombinante eiwit mogelijk zonder dat aanvullende immunokleuring nodig is. Begin met het vrijmaken van het eiwit, zoals voorbereid in het bijbehorende document, van beam mercaptoethanol door het drie keer te dialyseren in twee liter PBS bij een verdunning van 1 op 2000.Label één milligram disc one met DITE 5 94 IDE; los één milligram per milliliter proteïne op in PBS en voeg vijf millimolar TCEP toe om vrije TH-groepen te herstellen. Voeg 20 microliters van de in DMF opgeloste kleurstof toe aan de reactie en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Dialyseer de proteïne drie keer in PBS met een ratio van 1:2000 gedurende telkens twee uur, met behulp van een SLI-dialysecassette met een molecular weight cutoff van 10.000 Daltons, om de zuiverheid van de gelabelde proteïne verder te verhogen.Er wordt een affiniteitszuivering op basis van een histidine-tag uitgevoerd op een Ni-NTA-kolom. Was één milliliter Ni-NTA-matrix met 10 milliliter PBS, breng vervolgens het gelabelde, gedialyseerde eiwit aan op de kolom en laat dit door de kolom lopen.Langzaam zal de oplossing een deel van zijn blauwe kleur verliezen door de binding van het eiwit aan de NTA-matrix; ongebonden vrije kleurstof blijft in de doorstroomfractie aanwezig. Nadat de eiwitoplossing in de kolom is aangebracht, wordt de kolom drie keer gewassen met 20 milliliter PBS. Om het eiwit te elueren, worden twee milliliter PBS met 500 millimolar imidazol aan de kolom toegevoegd.Stel de klep in op een lage snelheid en elueer druppelgewijs terwijl de gekleurde band op de Ni-NTA-kolom wordt gevolgd. Deze gekleurde fractie van het eluaat bevat het gelabelde recombinante eiwit. Draag het eluaat over naar een sliders-dialysecassette en dialyseer het eluaat drie keer tegen 10 millimolair NaPi bij een verdunning van 1:2000 gedurende telkens twee uur in twee liter. Pers het eluaat na dialyse door een steriel 0,45 micrometer spuitfilter, verdeel dit vervolgens in vijf monsters van 100 microliter en vries deze direct in met vloeibare stikstof.De totale hoeveelheid eiwit moet 0,5 tot 1 µg per milliliter zijn in elk aliquot van 100 µL. Om de invasiviteit van het eiwit te beoordelen, wordt medium met 5 tot 10 µg per milliliter gelabeld recombinant Disc1-eiwit toegevoegd aan elke put van een 24-well plaat met ontvangende SH-SY5Y menselijke neuroblastoomcellen. Die het oplosbare GFP-tag Disc1 C-terminus constitutief tot expressie brengen op steriele glazen dekglasjes, incuberen gedurende 48 tot 72 uur.Doof de extracellulaire fluorescentie, fixeer en monteer de cellen zoals gedaan is bij de met agri zone behandelde cellen; bevestig de invasie van het exogeen toegevoegde recombinante eiwit via Z-stack imaging. Wanneer het gelabelde eiwit wordt opgenomen, is dit detecteerbaar binnen de perimeter van de recipiënte cellen in beelden gegenereerd door confocale microscopie. Deze Z-stack omvat een diepte van ongeveer 5 µm over 24 stappen van 220 nm.Hier wordt het recombinante disc1-fragment 598 tot 785, in het rood weergegeven, opgenomen door recipiënte cellen die het oplosbare C-terminale GFP-getagde disc1, in het groen weergegeven, tot expressie brengen om de invasiviteit van disc1-eiwitaggregaten te bepalen. Acrozonen bestaande uit MRFP-getagd full-length disc1 werden gezuiverd uit NLF-cellen en aangebracht op recipiënte SH-SY5Y-cellen zoals beschreven in dit protocol, zoals hier getoond. MRFP-getagde disc1-acrosomen infiltreerden een menselijke neuroblastoom SH-SY5Y-cel die oplosbaar GFP-getagd C-terminaal disc1 tot expressie bracht.Bovendien was het MRFP-gelabelde disc one-asoom in staat om oplosbaar GFP-gelabelde disc one te rekruteren in onoplosbare aggregaten. Om de invasiviteit te bepalen, werd DIA-gelabeld recombinant disc one toegepast op SH-SY5Y neuroblastoomcellen die oplosbaar GFP-disc one tot expressie brachten, zoals hier wordt getoond. Recombinant disc one-eiwit (in het rood weergegeven) infiltreerde de ontvangende cel; gele stippen duiden op de rekrutering van oplosbaar GFP-gelabelde C-terminale disc one in aggregaten. Gelabeld recombinant disc one, tot expressie gebracht en gezuiverd uit E. coli, was ook celinvasief voor neuronen in vivo wanneer het multimere eiwit stereotactisch werd geïnjecteerd in de mediale prefrontale cortex van een rat. Z-stack imaging bevestigt de aanwezigheid van recombinant disc one-eiwit in rat corticale neuronen, gekleurd met een antilichaam tegen neuronale kernen.We hebben zojuist twee methoden laten zien voor het genereren van disc one-aggregaten om celinvasie te bestuderen. Met gebruik van een van deze methoden kunnen we de cellulaire effecten van de opname van disc one-aggregaten onderzoeken zonder de potentieel verstorende variabelen van recombinante genexpressie door transfectie van vreemd DNA. Deze technieken kunnen worden toegepast om de biologische effecten van disc one-eiwitpathologie in vitro in cellen, en in vivo via intracerebrale inoculatie of andere toedieningswijzen in diermodellen te onderzoeken.Wij zijn ervan overtuigd dat deze technieken uiteindelijk ook kunnen worden overgedragen naar andere eiwitaggregaten, mits het protocol licht wordt aangepast aan elk specifiek eiwit. Besteed bij het uitvoeren van deze procedure voldoende tijd aan een zorgvuldige analyse van de confocale microscopiebeelden.

generation-purification-characterization-cell-invasive-disc1-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Modellen van de tumorcel invasie in drie-dimensionale extracellulaire matrix beter aansluiten bij...

Modeling and Imaging 3-Dimensionale Collectief Cell Invasion

Bloedvaten in de menselijke skeletspier haven diverse multi-lineage voorloper populaties die ideaal is voor regeneratieve toepassingen zijn. Deze isolatie methode maakt gelijktijdige zuivering van drie multipotente precursor celpopulaties respectievelijk uit drie structurele lagen van de bloedvaten: myogene endotheelcellen van de intima, pericytes van media en adventitia cellen van adventitia.

Isolatie van bloedvatgeassocieerde afgeleid Multipotente Voorlopers van Human Skeletal Muscle

Dit artikel geeft gedetailleerde methodologieën voor het gebruik van driedimensionale (3D) assays om borstkanker cel invasie kwantificeren. Concreet bespreken we het nodig om dergelijke assays procedures, kwantificering en gegevensanalyse, alsook werkwijzen voor het verlies van membraan integriteit die ontstaat wanneer cellen binnendringen onderzoeken.

Kwantificering van de Breast Cancer Cell Invasiviteit met een drie-dimensionale (3D) Model

Hier voorgesteld is een eenvoudige methode voor het isoleren en flowcytometrische analyse van glioma infiltrerende perifere mononucleaire cellen die tijdsafhankelijk kwantitatieve gegevens over het aantal en activeringsstatus van immuuncellen die het begin hersentumor micro oplevert.

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Glioom infiltreren perifere mononucleaire bloedcellen

Epitheliële naar mesenchymale overgang (EMT) maakt het mogelijk dat kankers invasief worden. Om EMT te onderzoeken, wordt een op neurale stamcellen (NSC) gebaseerd in vitro model beschreven dat vrij is van serum en enzymen. Dit gestandaardiseerde systeem maakt een kwantitatieve en kwalitatieve beoordeling van celmigratie, gen- en eiwitexpressie mogelijk. Het model is geschikt voor geneesmiddelontdekking.

Een enzym en Serum-free neurale stamcel Cultuur Model voor EMT Investigation Geschikt voor Drug Discovery

Lever verwondingen worden begeleid door voorlopercellen cel expansie die een heterogene populatie cellen vertegenwoordigt. Nieuwe indeling van deze cellulaire compartiment zorgt voor de onderscheidende meerdere subsets. De hier beschreven methode laat de flowcytometrieanalyse en hoge zuiverheid isoleren van diverse subsets die kunnen worden gebruikt voor verdere tests.

Isolatie en Verrijking van Liver Progenitor subsets geïdentificeerd door een Novel Surface Marker Combinatie

De processen die blaas kanker invasie vertegenwoordigen mogelijkheden voor biomerker en therapeutische ontwikkeling. Hier presenteren we een blaas kanker invasie model waarin 3D-cultuur tumor spheroïden, time-lapse beeldvorming en confocale microscopie. Deze techniek is handig voor het definiëren van de kenmerken van de invasieve proces en voor het screenen van therapeutische agenten.

3D-celcultuur voor het bestuderen van de invasie en evalueren van Therapeutics in blaaskanker

Dictyostelium-discoideum is een populair model-organisme te bestuderen van complexe cellulaire processen zoals cel migratie, endocytose en ontwikkeling. Het nut van het organisme is afhankelijk van de haalbaarheid van genetische manipulatie. Hier presenteren we methoden om te transfect Dictyostelium discoideum cellen die bestaande van kweken cellen in vloeibare media beperkingen.

Genetische manipulatie van Dictyostelium discoideum cellen op basis van de selectie en de groei van bacteriën

Dit artikel presenteert een kleinschalig plasmamembraanisolatieprotocol voor de karakterisering van Candida albicans ABC (ATP-binding cassette) eiwit Cdr1, overexpressie in Saccharomyces cerevisiae. Een protease-breekbare C-terminal mGFPHis dubbele tag met een 16-residu linker tussen Cdr1 en de tag is ontworpen om de zuivering en detergent-screening van Cdr1 te vergemakkelijken.

Kleinschalige plasmamembraanvoorbereiding voor de analyse van Candida albicans Cdr1-mGFPHis

We beschrijven een aanpak om invasieve celsubpopulaties in realtime te detecteren en vast te leggen. Het experimentele ontwerp maakt gebruik van Real-Time Cellular Analysis door veranderingen in de elektrische impedantie van cellen te monitoren. Invasieve kanker, immuun-, endotheel- of stromale cellen in complexe weefsels kunnen worden vastgelegd en de impact van coculturen kan worden beoordeeld.

Real-time detectie en vastlegging van invasieve celsubpopulaties uit coculturen

Leer de generatie en zuivering van cel-invasieve DISC1-eiwitaggregaten voor neurowetenschappelijk onderzoek. Deze methoden tonen eiwitopname aan in neuroblastoomcellen en neuronen in vivo.

Generation, Zuivering en karakterisering van Cell-invasieve DISC1 Protein Soorten

Meer video's verkennen